西羅莫司對肝癌HepG2細胞中HIF1α表達阻礙

1、西羅莫司對肝癌HepG2細胞中HIF-1a表達阻礙【摘要】目的研究西羅莫司對氯化鉆(CoC12)誘導的肝癌HepG2細胞中缺氧誘導因子-la(HIF-la)表達的阻礙。方式用CoC12誘導細胞模擬缺氧微環(huán)境，并依照CoC12濃度不同分為0、50、100、200及400Umol/L組；選擇CoC12濃度為200Umol/L來模擬腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境，同時別離聯(lián)合0、10、20>30、40nmol/L的西羅莫司作用于細胞24ho應用逆轉錄-聚合酶鏈反映檢測HIF-lamRNA的表達。結果隨CoC12濃度提高,HIF-lamRNA的表達升高(F=,q=,P<),其中CoC12濃度為2

2、00和400umol/L兩組比較不同無顯著性(q=,P>)；西羅莫司可使HepG2細胞HIF-lamRA的表達降低并呈劑量依托性(F=,q=-,P<)o結論缺氧微環(huán)境能夠增進HepG2細胞中HIF-lamRNA的表達，HIFTa可能通過在細胞缺氧調(diào)控中起作用而參與了腫瘤的發(fā)生進展。西羅莫司能夠抑制HIF-1amRXA的表達，這可能是其抗腫瘤的機制之一?！娟P鍵詞】肝腫瘤；HepG2細胞；西羅莫司；缺氧誘導因子1,a亞基ABSTRACTObjectiveToinvestigatetheeffectofsirolimusontheexpressionofhypoxia-i

3、nduciblefactor-1alpha(HIF-1a)inhumanhepatocellularcarcinomaHepG2cellsinducedbycobaltCobaltchloridewasusedtomimicthecellhypoxicmicroenvironment,andHepG2cellsweredividedintofivegroupsaccordingtodifferentconcentrationsofcobaltchloride,.0-，50-,100-,200-,and400Umol/Lgroups.Theconcentrationof200Umol/Lofco

4、baltchloridewaschosentomimictumorhypoxicmicroenvironment,and,atthesametime,differentconcentrationsofsirolimus(0,10,20,30,and40nmol/L)wereappliedtotreatthecellsfor24h.TheexpressionofHIF-1amRNAwasdetectedbysemi-quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR).ResultsWithincreasingofcon

5、centrationofcobaltchloride,theexpressionofHIF-1amRNAincreased(F=,q=<),andtherewasnosignificantdifferencebetween200Umol/Lgroupand400Umol/Lgroup.TheexpressionofHIF-1amRXAofHepG2cellsinducedbycobaltchloridewasdegressivewiththeeffectofsirolimus,andbecamedose-dependent(F=,q=<).ConclusionThe

6、expressionofHIF-1amRNAofHepG2cellscanbeelevatedbyhypoxicmicroenvironment,andHIF-1amayplayanimportantroleinthecellhypoxicregulationtoparticipateinthetumorousgrowth.SirolimuscaninhibittheexpressionofHIF-1amRNA,whichmaybeoneofitsantineoplasticmechanisms.KEYWORDSTumorofliver;HepG2cell;Sirolimus;Hypoxia-

7、induciblefactor1,alphasubunit由于腫瘤細胞的失控性生長致使耗氧量的增加，缺氧成為腫瘤細胞生長的大體環(huán)境，腫瘤細胞如何適應這一微環(huán)境并維持持續(xù)生長己成為腫瘤研究的中心問題。缺氧誘導因子T（HIF-1）是缺氧條件下普遍存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉錄因子，由HIF-1a和HIF-18亞基組成，HIF-la是惟一的氧調(diào)劑亞單位，決定HIF-1的活性1,而HIF-1直接調(diào)控VEGF基因的表達，是惡性腫瘤誘導新生血管形成的要緊調(diào)控因子。西羅莫司（SRL）是從吸水性鏈霉菌發(fā)酵液中提掏出的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，研究顯示SRL不僅有抗移植免疫排斥反映作用，而且還有普遍的抗腫瘤作用2

8、,3。本文用氯化鉆（CoC12）化學模擬誘導肝癌HepG2細胞內(nèi)缺氧，再加不同濃度SRL培育，觀看細胞內(nèi)HIF-la表達轉變，并對其發(fā)生機制進行初步研究。1材料與方式材料RPMI1640培育基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；SRL為Sigma公司產(chǎn)品；Trizol試劑盒購自Introvigen公司；RT-PCR試劑盒購自美國Promege公司；引物及GAPDH內(nèi)參由上海生工生物工程公司提供。方式細胞培育人肝癌HepG2細胞由南京凱基生物科技提供。將肝癌HepG2細胞接種于含體積分數(shù)為的胎牛血清的1640培育基，內(nèi)含100U/L青鏈霉素，在37°C、體積分數(shù)

9、為的C0二、正常氧濃度與飽和濕度的培育箱中培育，進入對數(shù)生長期后，傳代于6孔細胞培育板中，選擇生長良好的肝癌細胞用于實驗。實驗分組對照組用培育液培育48h,實驗組用培育液培育24h后，用含不同濃度CoC12的培育液處置細胞24h,依照CoC12濃度不同分為5個亞組（0、50、100、200和400Umol/L組）；選擇CoC12濃度為200Umol/L來模擬腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境，用培育液培育細胞24h后，對照組用200nmol/L的CoC12培育液培育24h,實驗組用含SRL別離為0、10、20、30、40nmol/L的200Umol/L的CoC12培育液培育24hoRT-PCRTRIZ0L法提取

10、6孔板內(nèi)各組細胞的總RNA,紫外線分光光度計測定總RNA濃度，重復測定3次，-70冰箱保留。各樣本取1Ug總RNA,按Promege一步法利用說明書進行RT-PCR；所用引物由上海生物工程技術合成：HIF-1a上游引物序列為5'-ACGTGTTATCTGTCGCTTTG-3'，下游引物序列為5，-TAGGTTTCTGCTGCCTTGTAT-3',目的片段長度為371bp；內(nèi)參照基因GAPDH的上游引物序列為5'-TCATGGGTGTGMCCATGAGAA-3z,下游引物序列為5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3z,目的片段長度為146bp

11、。RT-PCR反映條件：45逆轉錄45min,94預變性2min,94變性30s,64退火1min,68延伸2min,27次循環(huán)后68終末延伸7min。掏出5uLPCR產(chǎn)物，加1ULLoadingbuffer,反復吸打混勻后，于20g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，電流為10mA,電源120V,電泳30min,長波紫外線下觀看電泳條帶情形并照相，GIS凝膠成像處置系統(tǒng)成像，并進行吸光度定量分析。PCR產(chǎn)物相對量二擴增產(chǎn)物的吸光度值/GAPDH擴增產(chǎn)物的吸光度值。陽性結果為HIF-1a的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在紫外線燈照射下顯現(xiàn)371bp的熒光條帶。統(tǒng)計學處置采納SPSS及PPMS4統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進

12、行統(tǒng)計學處置，組間比較采納單因素方差分析。2結果不同劑量CoC12對肝癌HepG2細胞中HIF-1amRXA表達的阻礙HIF-1amRNA在0、50、100、200和400umol/L的CoC12處置組表達強度別離為土、土、土、土、土，隨著CoC12的濃度的升高HIF-1amRNA表達增強(F=,q=,P<),其中CoC12濃度為200和400Umol/L兩組比較不同無顯著性(q=,P>)。RT-PCR產(chǎn)物的電泳結果見圖1。不同劑量的SRL對肝癌HepG2細胞中HIF-1amRXA表達的阻礙HIF-1amRNA在含SRL別離為0、10、20、30、40nmol/L的

13、200口mol/L的CoC12培育液處置組中的表達強度別離為土、土、土、土、土，隨著SRL濃度的升高HIF-1amRXA的表達減弱(F=,q=,P<)。RT-PCR產(chǎn)物的電泳結果見圖2。3討論肝細胞癌惡性程度高,進展迅速,術后易復發(fā)和轉移，目前尚缺乏有效的醫(yī)治藥物。肝細胞癌為典型的多血管腫瘤,抗血管生成在其醫(yī)治中有著誘人的前景5o缺氧誘導因子H1FT最先由WANG等6在研究低氧誘導的基因表達時發(fā)覺，它是在缺氧條件下普遍存在于人體內(nèi)，由HIF-1a和HIF-18亞基組成異源二聚體的轉錄因子，其中HIF-1a是要緊活性單位，其表達受氧分壓調(diào)劑。HIF-la感受缺氧信號后,自身被迅速激

14、活，進入核內(nèi)與其他轉錄因子協(xié)同作用并結合到缺氧相關基因的調(diào)控元件，調(diào)控相關基因的表達，以維持細胞和機體的氧自穩(wěn)平穩(wěn)及能量代謝平穩(wěn)而缺氧是實質(zhì)性腫瘤物理微環(huán)境之一，因此HIF-1a關于腫瘤的生長尤其重要。鑒于此點，咱們選擇HIF-1a為研究指標，探討SRL抗腫瘤作用的可能機制。本研究利用在培育液中加入CoC12的方式模擬細胞缺氧環(huán)境，那個地址CoC12的作用與低氧一致，Co2+是亞鐵螯合酶的底物，可取代細胞中的Fe2+與血紅素結合，使原嚇咻IX與02分子的結合能力下降，阻斷02信號的傳遞，致使細胞內(nèi)環(huán)境處于乏氧狀態(tài)，誘導HIF-la的表達。同時，Co2+還能通過替代作為脯氨酰羥化酶(PHD)輔助

15、因子的Fe2+,抑制PHD對HIF-1a的羥基化作用，減少HIF-1a的降解7。本研究結果顯示，利用低濃度的CoC12預處置細胞，HIF-1a的表達隨著缺氧程度的增高而增強，提示不管在常氧仍是低氧條件下,HIF-1a在肝癌HepG2細胞均中有表達,且隨著CoC12濃度的增高,即缺氧信號的增強(實質(zhì)性腫瘤進展越快,氧供的不平穩(wěn)就越明顯)，其mRNA表達水平上調(diào)。其可能的機制為：當氧需求量絕對或相對增加,腫瘤細胞可通過啟動缺氧應答的開關“HIF-1”，使其表達上調(diào)，最終啟動一系列下游基因轉錄，其產(chǎn)物使腫瘤細胞適應缺氧的應激狀態(tài)繼續(xù)存活和增殖。SRL是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有抗真菌和增強免疫抑制活

16、性的作用，目前作為免疫抑制劑普遍應用于臨床。最近研究結果顯示，SRL具有普遍的抗腫瘤作用，如抗胰腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、腎癌等。研究說明，在低氧環(huán)境激活HIF-la的進程中，mTOR-磷脂酰肌醇-3激酶/抗凋亡蛋白途徑起了進一步放大效應8o以往研究顯示，抑制mTOR-磷脂酰肌醇-3激酶/抗凋亡蛋白途徑對實體腫瘤，專門是惡性程度高或?qū)熌退幍哪[瘤，具有醫(yī)治意義9。SRL通過特異性抑制mTOR而抑制HIF-1a的激活，可有效下調(diào)HIF-1a基因的表達，既能抑制HIF-1a基因的合成，又能增加其降解，并能下調(diào)HIF-1a基因調(diào)控的其他基因的表達10。本實驗結果顯示，SRL能明顯使肝癌HepG2細胞

17、HIF-lamRNA表達下降，且隨著SRL濃度的升高，HIF-1amRNA的表達也愈來愈低。由此推測，SRL能夠通過上述信號途徑，阻斷HepG2細胞表達HIF-1amRNA,進而抑制其下游基因VEGF的表達，從而抑制腫瘤的發(fā)生進展，這可能是其抗腫瘤的機制之一。總之，最近幾年來抗腫瘤血管生成己成為腫瘤醫(yī)治的基礎和臨床研究熱點，是最有希望的腫瘤導向醫(yī)治靶標。尤其是研制以HIF-1為醫(yī)治靶點的腫瘤醫(yī)治藥物，己成為抗腫瘤醫(yī)治研究的熱點，通過抑制HIFTa蛋白表達來抑制受其調(diào)控的多種促腫瘤生長相關基因的表達水平，從多方面入手抑制腫瘤的發(fā)生和進展。本研究通過對SRL抑制人肝癌HepG2細胞中HIF-la表

18、達的研究,進一步揭露其抗腫瘤血管生成的作用機制，為開發(fā)抗腫瘤血管生成新藥奠定理論基礎，為臨床應用提供理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】1GASSMANNM,CHILOVD,WENGERRH.Regulationofthehypoxia-induciblefactor-1alphaARNTisnotnecessaryforhypoxicinductionofHIF_1alphainthenucleusJ.AdvExpMedBiol,2000,475:87-99.2 STEPHANS,DATTA,WANGE,etal.Effectofrapamycinaloneandincombinationwithanti

19、angiogenesistherapyinanorthotopicmodelofhumanpancreaticcancerj.ClinCancerRes,2004,10:6993-7000.3 DANIELJ,BOFFA,FULUNGL,etal.Rapamycininhibitsthegrowthandmetastaticprogressionofnon-smallcelllungcancerj.ClinCancerRes,2004,10:293-300.4周曉彬，紀新強,徐莉.醫(yī)用統(tǒng)計學軟件PPMS的組成和應用特點J.齊魯醫(yī)學雜志，2020,24(1):29-32.5侯繼院，沈方臻,王延濤，等.順伯低劑量節(jié)律化療抑制小鼠H22肝癌血管生成觀看