組織培養(yǎng)第十二章

1、第十二章第十二章 種質(zhì)離體保存種質(zhì)離體保存超低溫保存超低溫保存種質(zhì)保存種質(zhì)保存低溫保存低溫保存主要內(nèi)容主要內(nèi)容 種質(zhì)種質(zhì)是指親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給是指親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。子代的遺傳物質(zhì)。 種質(zhì)保存（種質(zhì)保存（germ plasm conservation）：）：指指利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境來保存種質(zhì)資源，利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境來保存種質(zhì)資源，使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保存其遺傳完整性使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保存其遺傳完整性（genetic integrity），有高的活力（），有高的活力（vigor），能），能通過繁殖將其遺傳特性傳遞下去。通過繁殖將其

2、遺傳特性傳遞下去。 傳統(tǒng)保存方法有種子保存和種植保存。傳統(tǒng)保存方法有種子保存和種植保存。 種質(zhì)保存方式：種質(zhì)保存方式：原地保存和異地保存。原地保存和異地保存。 前者通過建立自然保護(hù)區(qū)和天然公園里實(shí)現(xiàn)，前者通過建立自然保護(hù)區(qū)和天然公園里實(shí)現(xiàn)，后者通過植物園、種質(zhì)園、種子庫及離體保存來后者通過植物園、種質(zhì)園、種子庫及離體保存來實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)。 具有世界先進(jìn)水具有世界先進(jìn)水平的國家種質(zhì)資平的國家種質(zhì)資源庫源庫國家種質(zhì)資源庫內(nèi)景一角國家種質(zhì)資源庫內(nèi)景一角國家國家種質(zhì)種質(zhì)資源資源庫內(nèi)庫內(nèi)景景保存對象：保存對象：凡能通過種子繁殖維持物種凡能通過種子繁殖維持物種遺傳完整性的各類植物種質(zhì)資源，都可遺傳完整性的各類

3、植物種質(zhì)資源，都可保存到國家種質(zhì)庫，其種子應(yīng)是耐低溫保存到國家種質(zhì)庫，其種子應(yīng)是耐低溫和耐干燥類型，即正常型種子和耐干燥類型，即正常型種子（orthodox seedsorthodox seeds）。）。 江蘇鎮(zhèn)江桑樹圃江蘇鎮(zhèn)江桑樹圃呼和浩特牧草圃呼和浩特牧草圃浙江杭州茶樹圃浙江杭州茶樹圃國國 家家 種種 質(zhì)質(zhì) 圃圃（包括試管苗庫）（包括試管苗庫）中國野生苧麻種質(zhì)中國野生苧麻種質(zhì)基因庫在江西建成基因庫在江西建成兩位市民在江西宜春市中國兩位市民在江西宜春市中國野生苧麻種質(zhì)基因庫參觀野生苧麻種質(zhì)基因庫參觀。 種子保存的優(yōu)點(diǎn)種子保存的優(yōu)點(diǎn) 占用空間??；占用空間小； 可以保存多年；可以保存多年； 種子

4、容易干燥和包裝，便于運(yùn)送種子容易干燥和包裝，便于運(yùn)送到引種中心和基因庫到引種中心和基因庫種子保存的缺點(diǎn)種子保存的缺點(diǎn) 1）隨著貯存時(shí)間的延長，種子的生活力逐）隨著貯存時(shí)間的延長，種子的生活力逐漸下降，并常常受到病蟲害的侵襲；漸下降，并常常受到病蟲害的侵襲； 2）種子一般都是雜合體，繁殖中性狀會(huì)分）種子一般都是雜合體，繁殖中性狀會(huì)分離而不穩(wěn)定，因而除了無融合生殖物種以離而不穩(wěn)定，因而除了無融合生殖物種以外，難以保存各種來源不同的無性系；外，難以保存各種來源不同的無性系； 3）不適用于營養(yǎng)繁殖作物；）不適用于營養(yǎng)繁殖作物； 4）在苗圃或田間大量保存各種植物基因型，）在苗圃或田間大量保存各種植物基因

5、型，不但成本極高，而且還有受到天災(zāi)毀滅的不但成本極高，而且還有受到天災(zāi)毀滅的危險(xiǎn)。危險(xiǎn)。 離體保存：離體保存：將組織和細(xì)胞培養(yǎng)中將組織和細(xì)胞培養(yǎng)中的外植體或試管苗貯存在使其抑制生的外植體或試管苗貯存在使其抑制生長，緩慢生長或無生長的條件下，達(dá)長，緩慢生長或無生長的條件下，達(dá)到長期保存的方法。到長期保存的方法。 離體保存的優(yōu)點(diǎn)：離體保存的優(yōu)點(diǎn)： 1、解決一些無性繁殖作物種質(zhì)資源在低溫下長、解決一些無性繁殖作物種質(zhì)資源在低溫下長期保存問題，可有效避免資源的丟失。期保存問題，可有效避免資源的丟失。 2、節(jié)省土地和勞動(dòng)力，保存方法簡單，花費(fèi)少，、節(jié)省土地和勞動(dòng)力，保存方法簡單，花費(fèi)少，且能在保存中脫毒

6、。且能在保存中脫毒。 3、在提供利用時(shí)，可快速繁殖，也有利于國際、在提供利用時(shí)，可快速繁殖，也有利于國際國內(nèi)種質(zhì)交換。國內(nèi)種質(zhì)交換。 離體保存的一個(gè)基本要求是把繼代的次數(shù)減離體保存的一個(gè)基本要求是把繼代的次數(shù)減少到最低限度。少到最低限度。一、超低溫保存一、超低溫保存 超低溫保存（超低溫保存（ultra-low temperature）：）：一般是一般是-196（液氮）的超低溫下使保存（液氮）的超低溫下使保存的活細(xì)胞的物質(zhì)代謝和生長活動(dòng)幾乎完全的活細(xì)胞的物質(zhì)代謝和生長活動(dòng)幾乎完全停止，在適宜的條件下可迅速繁殖，生出停止，在適宜的條件下可迅速繁殖，生出新的植株，并保持原來的遺傳特性。新的植株，并保

7、持原來的遺傳特性。1.植物超低溫保存的概念及意義植物超低溫保存的概念及意義 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1）長期保持種質(zhì)遺傳性的穩(wěn)定；長期保持種質(zhì)遺傳性的穩(wěn)定； 2）保持培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的能力；保持培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的能力； 3）保存稀有珍貴及瀕危植物的種質(zhì)資源；保存稀有珍貴及瀕危植物的種質(zhì)資源； 4）保存不穩(wěn)定性的培養(yǎng)物，如單細(xì)胞；保存不穩(wěn)定性的培養(yǎng)物，如單細(xì)胞； 5）長期貯存去病毒的種質(zhì)；長期貯存去病毒的種質(zhì)； 6）防止種質(zhì)衰老；防止種質(zhì)衰老； 7）延長花粉壽命，解決不同開花期和延長花粉壽命，解決不同開花期和異地植物雜交上的困難；異地植物雜交上的困難； 8）便于國際間的種質(zhì)交換；便于國際間的種質(zhì)交換； 9

8、）經(jīng)過超低溫保存后的再生植株，有經(jīng)過超低溫保存后的再生植株，有可能產(chǎn)生高抗寒性的新材料；可能產(chǎn)生高抗寒性的新材料； 10）用于超低溫保存的設(shè)備較簡單，不用于超低溫保存的設(shè)備較簡單，不需要大量的基本建設(shè)投資需要大量的基本建設(shè)投資2.超低溫保存的原理超低溫保存的原理 超低溫保存時(shí)，超低溫保存時(shí)，降溫冷凍降溫冷凍和和化凍化凍過過程最易引起植物材料的傷害。程最易引起植物材料的傷害。 在降溫冷凍過程中，植物遭受凍害在降溫冷凍過程中，植物遭受凍害的原因：的原因：1）細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰；細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰；2）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃縮。溶質(zhì)的濃縮。 因此在降溫冷凍過程中創(chuàng)造適宜的因此在降溫冷凍過程中創(chuàng)造適宜的條件，使植物

9、材料發(fā)生保護(hù)性脫水。條件，使植物材料發(fā)生保護(hù)性脫水。 1）在溶液中產(chǎn)生強(qiáng)烈的水合作用，提高溶液的）在溶液中產(chǎn)生強(qiáng)烈的水合作用，提高溶液的黏滯性，從而可在溫度下降的同時(shí)降低冰晶形成黏滯性，從而可在溫度下降的同時(shí)降低冰晶形成和增長的速度；和增長的速度； 2）增加細(xì)胞膜透性，加速細(xì)胞內(nèi)的水流到細(xì)胞）增加細(xì)胞膜透性，加速細(xì)胞內(nèi)的水流到細(xì)胞外結(jié)冰，從而防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的傷害；外結(jié)冰，從而防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的傷害； 3）在冷凍過程中減少冰的形成，從而減少組織）在冷凍過程中減少冰的形成，從而減少組織內(nèi)溶質(zhì)數(shù)量的迅速升高。內(nèi)溶質(zhì)數(shù)量的迅速升高。 4）糖類物質(zhì)（如海藻糖）對膜也具有一定的保）糖類物質(zhì)（如海藻糖）對膜也

10、具有一定的保護(hù)作用。護(hù)作用。防凍劑在低溫下對植物起保護(hù)作用的原因防凍劑在低溫下對植物起保護(hù)作用的原因 一種防凍劑難以同時(shí)具備所有防凍特一種防凍劑難以同時(shí)具備所有防凍特性，在實(shí)踐中往往采用多種防凍劑配合性，在實(shí)踐中往往采用多種防凍劑配合使用，以便取得更好的效果。使用，以便取得更好的效果。 化凍時(shí)還要防止細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰，多化凍時(shí)還要防止細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰，多數(shù)情況下采用快速化凍方法，即在數(shù)情況下采用快速化凍方法，即在3440溫水浴中化凍。溫水浴中化凍。3.超低溫保存主要設(shè)備和基本操作程序超低溫保存主要設(shè)備和基本操作程序 主要儀器設(shè)備：主要儀器設(shè)備：1）用于細(xì)胞和組織培養(yǎng)的）用于細(xì)胞和組織培養(yǎng)的全套設(shè)備

11、；全套設(shè)備；2）普通冰箱；）普通冰箱；3）-70 ，-20 低低溫冰箱；溫冰箱；4）程序降溫儀；）程序降溫儀；5）盛裝材料的玻璃或）盛裝材料的玻璃或塑料試管，且封蓋嚴(yán)密；塑料試管，且封蓋嚴(yán)密；6）液氮罐；）液氮罐；7）光學(xué)顯）光學(xué)顯微鏡和分光光度計(jì)，紫外熒光顯微鏡。微鏡和分光光度計(jì)，紫外熒光顯微鏡。超低溫保存的主要環(huán)節(jié)超低溫保存的主要環(huán)節(jié) 材料的準(zhǔn)備材料的準(zhǔn)備（選擇適宜年齡與生長狀態(tài)的植物器官、組（選擇適宜年齡與生長狀態(tài)的植物器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等）織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等） 預(yù)處理預(yù)處理（加速繼代、提高培養(yǎng)基滲透壓、低溫鍛煉、（加速繼代、提高培養(yǎng)基滲透壓、低溫鍛煉、ABAABA處理等）處理

12、等） 加入冷凍保護(hù)劑（加入冷凍保護(hù)劑（0 0左右或室溫左右或室溫） 干燥法干燥法 緩慢降溫法緩慢降溫法 兩步降溫法兩步降溫法 快凍法快凍法 逐級降溫法逐級降溫法 包埋脫水法包埋脫水法 種質(zhì)保存（種質(zhì)保存（-196-196） 快速解凍（快速解凍（34 34 40 40）、洗滌）、洗滌 再培養(yǎng)（細(xì)胞生長、植株再生、遺傳穩(wěn)定性鑒定）再培養(yǎng)（細(xì)胞生長、植株再生、遺傳穩(wěn)定性鑒定）（1）冰凍保護(hù)劑）冰凍保護(hù)劑 滲透型抗凍劑：滲透型抗凍劑：二甲亞砜（二甲亞砜（DMSO）、乙二）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甘油。醇、乙酰胺、丙二醇、甘油。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：多屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)多屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中

13、易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的的粘性增合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的的粘性增加而減少水的結(jié)晶過程，達(dá)到保護(hù)的目的。加而減少水的結(jié)晶過程，達(dá)到保護(hù)的目的。 非滲透型抗凍劑：非滲透型抗凍劑：聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、）、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等為非滲透型抗凍劑蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等為非滲透型抗凍劑 特點(diǎn)：特點(diǎn)：可溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，可在特定可溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，可在特定的溫度下降低溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，從而起到的溫度下降低溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，從而起到保護(hù)作用。保護(hù)作用。（2）保存液）保存液組成部分：組成部分：電解質(zhì)平衡鹽溶液電解質(zhì)平衡鹽溶液 高滲溶液：高滲溶液：選用

14、葡萄糖、甘露醇、蔗選用葡萄糖、甘露醇、蔗糖等作為高滲劑。糖等作為高滲劑。 營養(yǎng)液：營養(yǎng)液：氨基酸、核甘類、葡萄糖。氨基酸、核甘類、葡萄糖。 （3）材料的預(yù)備和預(yù)處理）材料的預(yù)備和預(yù)處理材料的生長狀態(tài)和年齡的選擇材料的生長狀態(tài)和年齡的選擇培養(yǎng)細(xì)胞處于旺盛的對數(shù)分裂期培養(yǎng)細(xì)胞處于旺盛的對數(shù)分裂期液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞以液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞以57天天 抗凍能力強(qiáng)，抗凍能力強(qiáng)，固體培養(yǎng)的愈傷組織以固體培養(yǎng)的愈傷組織以912天為宜天為宜 存活率高存活率高野外生長的植物的芽（冬天低溫鍛煉）野外生長的植物的芽（冬天低溫鍛煉）預(yù)培養(yǎng)：預(yù)培養(yǎng)：在冰凍保存前的預(yù)培養(yǎng)中加入提在冰凍保存前的預(yù)培養(yǎng)中加入提高抗寒力的物質(zhì)如：梨糖

15、醇、脫落酸等，或高抗寒力的物質(zhì)如：梨糖醇、脫落酸等，或?qū)⑴囵B(yǎng)基的糖濃度提高，這樣可以提高存活將培養(yǎng)基的糖濃度提高，這樣可以提高存活率。率。冰凍保護(hù)劑：冰凍保護(hù)劑：由于一些冰凍保護(hù)劑的成分由于一些冰凍保護(hù)劑的成分有毒性，冰凍保護(hù)劑預(yù)處理必須在有毒性，冰凍保護(hù)劑預(yù)處理必須在0 下進(jìn)下進(jìn)行處理時(shí)間不能太長，一般不超過行處理時(shí)間不能太長，一般不超過1h。4.超低溫保存材料的類型超低溫保存材料的類型1）芽及莖尖分生組織）芽及莖尖分生組織 芽的超低溫保存是保存無性繁殖植物芽的超低溫保存是保存無性繁殖植物種質(zhì)的簡便途徑。種質(zhì)的簡便途徑。 分生組織作為超低溫保存的材料的優(yōu)越性：分生組織作為超低溫保存的材料的優(yōu)

16、越性： A.在某些情況下，愈傷組織很難再生完整植在某些情況下，愈傷組織很難再生完整植株，而分生組織相對會(huì)容易很多；株，而分生組織相對會(huì)容易很多； B.分生組織遺傳上更穩(wěn)定；分生組織遺傳上更穩(wěn)定； C.更快的營養(yǎng)繁殖方式；更快的營養(yǎng)繁殖方式； D.產(chǎn)生無病植株；產(chǎn)生無病植株； E.細(xì)胞培養(yǎng)物一般需要控制冷凍速度，而分細(xì)胞培養(yǎng)物一般需要控制冷凍速度，而分生組織則可經(jīng)受突然的冷凍。生組織則可經(jīng)受突然的冷凍。2）幼胚及胚狀體）幼胚及胚狀體 A.頑拗型種子由于對溫度及濕度極其敏感，常導(dǎo)頑拗型種子由于對溫度及濕度極其敏感，常導(dǎo)致胚的退化，因而無法長期保存。而通過分離出致胚的退化，因而無法長期保存。而通過分

17、離出胚或片段進(jìn)行低溫保存，是解決這一難題的有效胚或片段進(jìn)行低溫保存，是解決這一難題的有效途徑。途徑。 B.體細(xì)胞胚能迅速大量繁殖，是人工種子的核心，體細(xì)胞胚能迅速大量繁殖，是人工種子的核心，它的超低溫保存為人工種子的長期保存奠定了基它的超低溫保存為人工種子的長期保存奠定了基礎(chǔ)。礎(chǔ)。 C.不親和種的雜種胚常在早期敗育，因此可不親和種的雜種胚常在早期敗育，因此可切下幼胚，進(jìn)行超低溫保存，在需要時(shí)解凍切下幼胚，進(jìn)行超低溫保存，在需要時(shí)解凍培養(yǎng)。培養(yǎng)。 D.單倍體細(xì)胞極不穩(wěn)定，短期內(nèi)就可轉(zhuǎn)變?yōu)閱伪扼w細(xì)胞極不穩(wěn)定，短期內(nèi)就可轉(zhuǎn)變?yōu)槎扼w，通過花粉胚的超低溫保存可維持其二倍體，通過花粉胚的超低溫保存可維持

18、其穩(wěn)定性。穩(wěn)定性。3）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞及愈傷組織）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞及愈傷組織 冷凍材料應(yīng)選取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞；冷凍材料應(yīng)選取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞； 加入冷凍保護(hù)劑前，可先對材料進(jìn)行預(yù)培加入冷凍保護(hù)劑前，可先對材料進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)以提高其抗寒力；養(yǎng)以提高其抗寒力； 適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑及濃度是成功的關(guān)鍵；適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑及濃度是成功的關(guān)鍵； 冷凍后必須快速化凍；冷凍后必須快速化凍； 解凍后，為防止?jié)B透沖擊對細(xì)胞造成的傷解凍后，為防止?jié)B透沖擊對細(xì)胞造成的傷害，可用緩慢擴(kuò)散的方法除去保護(hù)劑；害，可用緩慢擴(kuò)散的方法除去保護(hù)劑； 在細(xì)胞轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長之前，在細(xì)胞轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長之前，常需在半固體培養(yǎng)基上

19、培養(yǎng)一周或二周；常需在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周或二周； 恢復(fù)生長所用的培養(yǎng)基成分需做適當(dāng)改變?；謴?fù)生長所用的培養(yǎng)基成分需做適當(dāng)改變。4）原生質(zhì)體）原生質(zhì)體 沒有細(xì)胞壁，排除了冷凍期間細(xì)胞中產(chǎn)生的沒有細(xì)胞壁，排除了冷凍期間細(xì)胞中產(chǎn)生的張力，所以受傷害較少，同時(shí)能篩選抗逆性強(qiáng)，張力，所以受傷害較少，同時(shí)能篩選抗逆性強(qiáng)，生長處于優(yōu)勢的細(xì)胞系。生長處于優(yōu)勢的細(xì)胞系。 同時(shí)操作復(fù)雜，技術(shù)難度大，限制了應(yīng)用。同時(shí)操作復(fù)雜，技術(shù)難度大，限制了應(yīng)用。5）花粉）花粉 可延長花粉壽命，解決花期不遇和異可延長花粉壽命，解決花期不遇和異地植物雜交困難等問題，建立起花粉種地植物雜交困難等問題，建立起花粉種質(zhì)庫，為國際間的

20、種質(zhì)交換提供便利。質(zhì)庫，為國際間的種質(zhì)交換提供便利。5.超低溫保存的方法與技術(shù)超低溫保存的方法與技術(shù) 1）常規(guī)超低溫保存）常規(guī)超低溫保存 2）玻璃化法超低溫保存）玻璃化法超低溫保存 3）包埋脫水法超低溫保存）包埋脫水法超低溫保存 4）干燥冷凍法超低溫保存）干燥冷凍法超低溫保存 5）其他方法）其他方法1）常規(guī)超低溫保存）常規(guī)超低溫保存 （1）預(yù)培養(yǎng)和低溫處理提高組織細(xì)胞）預(yù)培養(yǎng)和低溫處理提高組織細(xì)胞的抗寒力。的抗寒力。 （2）冷凍保護(hù)劑處理：將保護(hù)劑預(yù)冷）冷凍保護(hù)劑處理：將保護(hù)劑預(yù)冷至至0 ，等體積與培養(yǎng)基混合，靜置，等體積與培養(yǎng)基混合，靜置303060min。 （3）降溫冷凍）降溫冷凍 A.快

21、速冷凍法：快速冷凍法： 適用于培養(yǎng)物細(xì)胞體能小，胞質(zhì)濃、適用于培養(yǎng)物細(xì)胞體能小，胞質(zhì)濃、含水量低、液泡化程度低的材料。將植物含水量低、液泡化程度低的材料。將植物材料從材料從0或其他預(yù)處理溫度直接投入液氮或其他預(yù)處理溫度直接投入液氮罐中，降溫速度為罐中，降溫速度為1000/min以上。這種以上。這種快速降溫可使細(xì)胞內(nèi)的水在迅速越過快速降溫可使細(xì)胞內(nèi)的水在迅速越過-140這一冰晶形成的危險(xiǎn)溫度期后，細(xì)胞這一冰晶形成的危險(xiǎn)溫度期后，細(xì)胞內(nèi)的水形成內(nèi)的水形成“玻璃化玻璃化”狀態(tài)，不會(huì)對細(xì)胞狀態(tài)，不會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用。產(chǎn)生破壞作用。 B.慢速冷凍法：慢速冷凍法： 適用于含有大液泡的成熟細(xì)胞，這適用于含

22、有大液泡的成熟細(xì)胞，這種細(xì)胞含水量高，在慢速降溫過程中，種細(xì)胞含水量高，在慢速降溫過程中，可以使細(xì)胞內(nèi)的水有充足的時(shí)間不斷地可以使細(xì)胞內(nèi)的水有充足的時(shí)間不斷地滲到細(xì)胞外結(jié)冰而避免在細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。滲到細(xì)胞外結(jié)冰而避免在細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。 將植物材料以將植物材料以0.110/min的降溫的降溫速度從速度從0降到降到-100左右，而后立即浸左右，而后立即浸入液氮罐中或以同樣的速度連續(xù)降溫至入液氮罐中或以同樣的速度連續(xù)降溫至-196。 C.2步冷凍法：步冷凍法： 第第1步用慢速降溫法降到步用慢速降溫法降到-50-30，使，使細(xì)胞達(dá)到保護(hù)性脫水狀態(tài)；第細(xì)胞達(dá)到保護(hù)性脫水狀態(tài)；第2 2步投入液氮步投入液氮中迅速冷

23、凍。中迅速冷凍。 D.逐級冷凍法：逐級冷凍法： 保存材料經(jīng)冷凍保護(hù)劑在保存材料經(jīng)冷凍保護(hù)劑在0預(yù)處理后，預(yù)處理后，逐步通過不同的溫度，樣品在每級溫度上逐步通過不同的溫度，樣品在每級溫度上停留一定時(shí)間（停留一定時(shí)間（4 46min），然后浸入液氮。），然后浸入液氮。 化凍操作化凍操作快速化凍：快速化凍：在在35354040溫水中化凍溫水中化凍慢速化凍：慢速化凍：在在0 0，2 23 3或室溫下進(jìn)行化凍或室溫下進(jìn)行化凍注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1、操作輕，避免組織和細(xì)胞的機(jī)械損傷、操作輕，避免組織和細(xì)胞的機(jī)械損傷2、將冰凍樣品試管插入溫水浴中時(shí)，注意避、將冰凍樣品試管插入溫水浴中時(shí)，注意避免管口污染；免

24、管口污染；3、試管內(nèi)的冰一旦化凍后，要立即將試管移、試管內(nèi)的冰一旦化凍后，要立即將試管移到到20- -25的水浴中，并立即迅速進(jìn)行洗滌和再培的水浴中，并立即迅速進(jìn)行洗滌和再培養(yǎng)。養(yǎng)。 2）玻璃化法超低溫保存）玻璃化法超低溫保存 （1）玻璃化法保存的原理）玻璃化法保存的原理 玻璃化法：生物材料經(jīng)高濃度玻璃化玻璃化法：生物材料經(jīng)高濃度玻璃化保護(hù)劑處理后，快速投入液氮保存，保護(hù)劑處理后，快速投入液氮保存，使保護(hù)劑和細(xì)胞內(nèi)水分來不及形成冰使保護(hù)劑和細(xì)胞內(nèi)水分來不及形成冰晶或冰晶沒有足夠的時(shí)間生長，從而晶或冰晶沒有足夠的時(shí)間生長，從而進(jìn)入一種人工的完全玻璃化狀態(tài)。進(jìn)入一種人工的完全玻璃化狀態(tài)。（2）玻璃

25、化的特點(diǎn)）玻璃化的特點(diǎn) 部分玻璃化：胞內(nèi)玻璃化部分玻璃化：胞內(nèi)玻璃化 完全玻璃化：受高濃度保護(hù)劑作用后完全玻璃化：受高濃度保護(hù)劑作用后的細(xì)胞連同保護(hù)劑本身在快速降溫中的細(xì)胞連同保護(hù)劑本身在快速降溫中都進(jìn)入玻璃化。都進(jìn)入玻璃化。（3）玻璃化法的基本）玻璃化法的基本環(huán)節(jié)及技術(shù)要點(diǎn)環(huán)節(jié)及技術(shù)要點(diǎn) 預(yù)培養(yǎng)和低溫鍛煉預(yù)培養(yǎng)和低溫鍛煉保護(hù)劑加前過保護(hù)劑加前過渡或逐級添加渡或逐級添加保護(hù)劑成分及保護(hù)劑保護(hù)劑成分及保護(hù)劑處理時(shí)間和溫度處理時(shí)間和溫度被凍體積、降溫方被凍體積、降溫方式式化凍和洗滌化凍和洗滌活性檢測和恢復(fù)培活性檢測和恢復(fù)培養(yǎng)。養(yǎng)。 玻璃化法因材料不同略有差異。保玻璃化法因材料不同略有差異。保護(hù)劑的

26、毒性及滲透損傷程度與保護(hù)劑護(hù)劑的毒性及滲透損傷程度與保護(hù)劑的濃度及處理時(shí)間和溫度有關(guān)?；瘍龅臐舛燃疤幚頃r(shí)間和溫度有關(guān)。化凍后的洗滌非常重要。后的洗滌非常重要。3）包埋脫水法超低溫保存）包埋脫水法超低溫保存（1）包埋脫水法（）包埋脫水法（encapsulation-dehydration method）原理）原理 包埋脫水法：將包含有樣品的褐藻酸包埋脫水法：將包含有樣品的褐藻酸鈉溶液滴向高鈣溶液，因褐藻酸鈣的鈉溶液滴向高鈣溶液，因褐藻酸鈣的生成而固化成球狀顆粒，同時(shí)輔以高生成而固化成球狀顆粒，同時(shí)輔以高濃度蔗糖預(yù)處理樣品，使樣品獲得高濃度蔗糖預(yù)處理樣品，使樣品獲得高的抗凍力和抗脫水力后，結(jié)合適當(dāng)

27、的的抗凍力和抗脫水力后，結(jié)合適當(dāng)?shù)拿撍徒禍胤绞剑旱卤４?。脫水和降溫方式，液氮下保存?玻璃化法采用高濃度的復(fù)合玻璃化玻璃化法采用高濃度的復(fù)合玻璃化保護(hù)劑脫水樣品，減輕了兩步法保存保護(hù)劑脫水樣品，減輕了兩步法保存過程中的機(jī)械損傷和溶液效應(yīng)；而包過程中的機(jī)械損傷和溶液效應(yīng)；而包埋脫水法采用高濃度蔗糖預(yù)處理樣品，埋脫水法采用高濃度蔗糖預(yù)處理樣品，避免二甲基亞砜和甘油的化學(xué)毒性。避免二甲基亞砜和甘油的化學(xué)毒性。 蔗糖可能是通過水替代作用保護(hù)質(zhì)蔗糖可能是通過水替代作用保護(hù)質(zhì)膜完整性和蛋白質(zhì)構(gòu)型。其目的是提膜完整性和蛋白質(zhì)構(gòu)型。其目的是提高胞質(zhì)濃度，即使樣品獲得高的抗凍高胞質(zhì)濃度，即使樣品獲得高的抗

28、凍力和抗脫水力，有不至于引起樣品太力和抗脫水力，有不至于引起樣品太多的高滲損傷，促進(jìn)降溫過程中玻璃多的高滲損傷，促進(jìn)降溫過程中玻璃化的形成?；男纬伞＃?）包埋脫水法的優(yōu)點(diǎn)）包埋脫水法的優(yōu)點(diǎn) 不需要昂貴、復(fù)雜的降溫設(shè)備，降不需要昂貴、復(fù)雜的降溫設(shè)備，降溫過程不甚嚴(yán)格；同時(shí)避免了玻璃化溫過程不甚嚴(yán)格；同時(shí)避免了玻璃化法中二甲基亞砜等高濃度保護(hù)劑對材法中二甲基亞砜等高濃度保護(hù)劑對材料可能造成的損害；樣品易于操作，料可能造成的損害；樣品易于操作，被保存樣品體積可以比較大；樣品可被保存樣品體積可以比較大；樣品可獲得較高的抗凍力，提高保存效果，獲得較高的抗凍力，提高保存效果，使保存后的樣品不經(jīng)愈傷組織直

29、接成使保存后的樣品不經(jīng)愈傷組織直接成苗，降低了遺傳變異的可能。苗，降低了遺傳變異的可能。（3）包埋脫水法的主）包埋脫水法的主要環(huán)節(jié)及技術(shù)要點(diǎn)要環(huán)節(jié)及技術(shù)要點(diǎn) A.包埋方法：樣品先用高濃度蔗糖預(yù)包埋方法：樣品先用高濃度蔗糖預(yù)培養(yǎng)后再包埋，或者包埋后用高濃度培養(yǎng)后再包埋，或者包埋后用高濃度蔗糖培養(yǎng)處理。蔗糖培養(yǎng)處理。 B.褐藻酸鈉和蔗糖的濃度及處理時(shí)間：褐藻酸鈉和蔗糖的濃度及處理時(shí)間：常用褐藻酸鈉常用褐藻酸鈉3%，氯化鈣濃度，氯化鈣濃度100mmol/L，保證固化完成的維持時(shí)間，保證固化完成的維持時(shí)間30min。包埋脫水法保存時(shí)蔗糖濃度一。包埋脫水法保存時(shí)蔗糖濃度一般為般為0.30.75mol/L

30、，其中，其中0.75mol/L更更常用。常用。 C.保存前脫水：包埋后的樣品在保存保存前脫水：包埋后的樣品在保存前絕大多數(shù)采用干燥空氣脫水，也有前絕大多數(shù)采用干燥空氣脫水，也有將包埋后蔗糖預(yù)處理的樣品用二步法將包埋后蔗糖預(yù)處理的樣品用二步法或玻璃化法做進(jìn)一步的脫水保存?；虿ＡЩㄗ鲞M(jìn)一步的脫水保存。 D.再培養(yǎng)：一般不必除去褐藻酸鈣等再培養(yǎng)：一般不必除去褐藻酸鈣等包裹物，直接將其接種在固體培養(yǎng)基包裹物，直接將其接種在固體培養(yǎng)基上恢復(fù)生長即可。上恢復(fù)生長即可。4）干燥冷凍法超低溫保存）干燥冷凍法超低溫保存（1）干燥冷凍法（）干燥冷凍法（dissication freezing method）原理

31、及優(yōu)點(diǎn)）原理及優(yōu)點(diǎn) 一般是將植物材料經(jīng)無菌風(fēng)、真空、硅一般是將植物材料經(jīng)無菌風(fēng)、真空、硅膠或趕濃度蔗糖等進(jìn)行干燥預(yù)處理，適度膠或趕濃度蔗糖等進(jìn)行干燥預(yù)處理，適度脫水，通過控制脫水速度和脫水程度以增脫水，通過控制脫水速度和脫水程度以增強(qiáng)植物的抗凍性，然后液氮保存。強(qiáng)植物的抗凍性，然后液氮保存。 干燥冷凍法不需要昂貴的儀器設(shè)備，操干燥冷凍法不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作簡便，因此是一種切實(shí)可行的超低溫保作簡便，因此是一種切實(shí)可行的超低溫保存方法。存方法。（2）干燥冷凍法的關(guān)）干燥冷凍法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及技術(shù)鍵環(huán)節(jié)及技術(shù) A.直接干燥脫水：不以任何冷凍保護(hù)直接干燥脫水：不以任何冷凍保護(hù)劑處理，直接在層流櫥（劑

32、處理，直接在層流櫥（laminar flow cabinet）等無菌空氣流、真空等干燥）等無菌空氣流、真空等干燥脫水。脫水。 B.高濃度蔗糖預(yù)處理：關(guān)鍵是保存不高濃度蔗糖預(yù)處理：關(guān)鍵是保存不同種質(zhì)培養(yǎng)基的蔗糖濃度及處理時(shí)間。同種質(zhì)培養(yǎng)基的蔗糖濃度及處理時(shí)間。 C.高濃度蔗糖預(yù)處理，再用無菌空氣高濃度蔗糖預(yù)處理，再用無菌空氣或硅膠等干燥脫水?；蚬枘z等干燥脫水。5）其他方法）其他方法 熱振動(dòng)（熱振動(dòng)（37 處理處理2h） 超低溫冰箱（超低溫冰箱（-150 ）中保存）中保存至少至少1個(gè)月個(gè)月 家用冰箱（家用冰箱（-20 ）中預(yù)處理）中預(yù)處理24h6.凍后細(xì)胞活力、存活凍后細(xì)胞活力、存活率及遺傳性檢測

33、率及遺傳性檢測 超低溫保存植物種質(zhì)，目的是超低溫保存植物種質(zhì)，目的是要長期保持植物具有高的活力，要長期保持植物具有高的活力，存活率及遺傳完整性，能通過繁存活率及遺傳完整性，能通過繁殖將其遺傳特性傳遞下去。殖將其遺傳特性傳遞下去。1）TTC法（氯化三苯基四氮唑）法（氯化三苯基四氮唑） A.0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，pH7.5； B.TTC溶液；溶液； C.稱取稱取100200mg化凍洗滌后的樣品，加入化凍洗滌后的樣品，加入3mlTTC溶液。溶液。 D.22 培育反應(yīng)培育反應(yīng)1218h； E.吸去吸去TTC，用蒸餾水洗滌；，用蒸餾水洗滌； F.收集細(xì)胞加入收集細(xì)胞加入95%酒精

34、酒精3ml，60水浴水浴10min10min，抽提酶活性反應(yīng)產(chǎn)物；抽提酶活性反應(yīng)產(chǎn)物； G.G.冷卻后冷卻后95%95%酒精定容到酒精定容到3ml； H.搖勻，用分光光度計(jì)測吸收值；搖勻，用分光光度計(jì)測吸收值； I.與對照材料相比較。與對照材料相比較。2）FDA染色法（二醋染色法（二醋酸酯熒光素染色法）酸酯熒光素染色法） FDA本身不發(fā)光，只有當(dāng)它滲入本身不發(fā)光，只有當(dāng)它滲入活細(xì)胞內(nèi)后，通過酯酶的脫脂化作活細(xì)胞內(nèi)后，通過酯酶的脫脂化作用生成熒光素，該熒光素在紫外光用生成熒光素，該熒光素在紫外光的激發(fā)下才產(chǎn)生熒光。因此，它可的激發(fā)下才產(chǎn)生熒光。因此，它可以作為活細(xì)胞的一種鑒定方法。以作為活細(xì)胞的

35、一種鑒定方法。方法方法 往載玻片上滴一滴化凍后的細(xì)胞往載玻片上滴一滴化凍后的細(xì)胞懸浮液，然后滴懸浮液，然后滴1滴滴FDA溶液與之溶液與之混合。靜置混合。靜置510min后，蓋上蓋玻后，蓋上蓋玻片，放于紫外光熒光顯微鏡下觀察。片，放于紫外光熒光顯微鏡下觀察。3）色譜分析法）色譜分析法 通過色譜來分析冷凍組織產(chǎn)生通過色譜來分析冷凍組織產(chǎn)生的揮發(fā)性碳?xì)浠衔铮⑶也黄频膿]發(fā)性碳?xì)浠衔?，并且不破壞材料。壞材料?）再培養(yǎng)）再培養(yǎng) 細(xì)胞的再生長是最終檢驗(yàn)細(xì)胞活力細(xì)胞的再生長是最終檢驗(yàn)細(xì)胞活力的唯一可靠方法。的唯一可靠方法。 化凍和洗滌后，立即將保存材料轉(zhuǎn)化凍和洗滌后，立即將保存材料轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)

36、行再培養(yǎng)。在再移到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行再培養(yǎng)。在再培養(yǎng)過程中，觀測組織的復(fù)活情況、培養(yǎng)過程中，觀測組織的復(fù)活情況、存活率、生長速度、組織塊大小和重存活率、生長速度、組織塊大小和重量的變化，以及分化產(chǎn)生植株的能力量的變化，以及分化產(chǎn)生植株的能力和各種遺傳性狀的表達(dá)。和各種遺傳性狀的表達(dá)。 存活率存活率=重新生長細(xì)胞（或器官）數(shù)重新生長細(xì)胞（或器官）數(shù)目目/解凍的細(xì)胞（或器官）數(shù)目解凍的細(xì)胞（或器官）數(shù)目 100% 在培養(yǎng)初期一般有在培養(yǎng)初期一般有1個(gè)生長停滯期。個(gè)生長停滯期。停滯期的長短可能取決于損傷程度，停滯期的長短可能取決于損傷程度，也可能與植物基因型有關(guān)。有兩個(gè)因也可能與植物基因型有關(guān)。有兩個(gè)

37、因素可以導(dǎo)致停滯期的產(chǎn)生：一是修復(fù)素可以導(dǎo)致停滯期的產(chǎn)生：一是修復(fù)損傷；二是一些抑制生長的物質(zhì)作用。損傷；二是一些抑制生長的物質(zhì)作用。5）細(xì)胞學(xué)變化）細(xì)胞學(xué)變化 在恢復(fù)過程中，對細(xì)胞學(xué)的變化及在恢復(fù)過程中，對細(xì)胞學(xué)的變化及恢復(fù)可能性的認(rèn)識(shí)有助于提高存活率?；謴?fù)可能性的認(rèn)識(shí)有助于提高存活率。 變化：變化：A.線粒體、質(zhì)體膨脹；線粒體、質(zhì)體膨脹；B.高爾高爾基體膨脹；基體膨脹；C.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜分離；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜分離；D.多核糖體解體。多核糖體解體。 許多細(xì)胞學(xué)變化遇合適條件可許多細(xì)胞學(xué)變化遇合適條件可以恢復(fù)，因此解凍或洗滌后的處以恢復(fù)，因此解凍或洗滌后的處理不應(yīng)忽視。理不應(yīng)忽視。6）生化穩(wěn)定性）生

38、化穩(wěn)定性 很多培養(yǎng)物，尤其是懸浮細(xì)胞很多培養(yǎng)物，尤其是懸浮細(xì)胞和愈傷組織，既有重要和特殊的和愈傷組織，既有重要和特殊的生化合成能力。冷凍保存后是否生化合成能力。冷凍保存后是否保持這種能力，也是衡量貯藏成保持這種能力，也是衡量貯藏成敗的重要指標(biāo)。敗的重要指標(biāo)。7）遺傳性分析）遺傳性分析 A.細(xì)胞全能性的保存，形態(tài)發(fā)生能力的表細(xì)胞全能性的保存，形態(tài)發(fā)生能力的表達(dá)情況；達(dá)情況； B.對保存材料的形態(tài)特征及生長發(fā)育的觀對保存材料的形態(tài)特征及生長發(fā)育的觀察；察； C.后代染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的分析；后代染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的分析； D.蛋白質(zhì)和同工酶譜的分析；蛋白質(zhì)和同工酶譜的分析； E.細(xì)胞特異產(chǎn)物的分析；細(xì)

39、胞特異產(chǎn)物的分析； F.抗逆性的分析；抗逆性的分析； G.借助分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性鑒定。借助分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性鑒定。7.提高冷凍后細(xì)胞或組提高冷凍后細(xì)胞或組織存活率的方法織存活率的方法 液氮的穩(wěn)定供應(yīng)、不同物種和不同液氮的穩(wěn)定供應(yīng)、不同物種和不同種類材料種質(zhì)、細(xì)胞、組織和器官等種類材料種質(zhì)、細(xì)胞、組織和器官等耐脫水能力不同、冷凍過程中如何防耐脫水能力不同、冷凍過程中如何防止冰晶的形成、理想的冷凍保護(hù)劑組止冰晶的形成、理想的冷凍保護(hù)劑組分及濃度、保存材料冷凍前及冷凍后分及濃度、保存材料冷凍前及冷凍后的遺傳穩(wěn)定性及保存后的再生能力。的遺傳穩(wěn)定性及保存后的再生能力。1）材料的選擇）材料

40、的選擇 超低溫保存前應(yīng)選擇合適的材超低溫保存前應(yīng)選擇合適的材料，綜合考慮植物材料的大小、料，綜合考慮植物材料的大小、基因型、抗凍性、年齡、形態(tài)結(jié)基因型、抗凍性、年齡、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)等。構(gòu)和生理狀態(tài)等。2）冷凍前預(yù)處理）冷凍前預(yù)處理 （1）懸浮培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)）懸浮培養(yǎng)或繼代培養(yǎng) 使細(xì)胞分裂分化同步化，增加指數(shù)使細(xì)胞分裂分化同步化，增加指數(shù)生長期的細(xì)胞生長期的細(xì)胞 （2）預(yù)培養(yǎng)可增加組織細(xì)胞保存后的）預(yù)培養(yǎng)可增加組織細(xì)胞保存后的存活率。存活率。 增加培養(yǎng)基中蔗糖濃度，提高滲透增加培養(yǎng)基中蔗糖濃度，提高滲透壓，或者在預(yù)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)抗寒壓，或者在預(yù)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或冷凍保護(hù)劑。力的

41、物質(zhì)或冷凍保護(hù)劑。 蔗糖：相對分子量小，十分易溶于蔗糖：相對分子量小，十分易溶于水，在生理水，在生理pH范圍內(nèi)不帶電荷，易進(jìn)范圍內(nèi)不帶電荷，易進(jìn)入細(xì)胞作為優(yōu)良的滲透調(diào)節(jié)和碳源，入細(xì)胞作為優(yōu)良的滲透調(diào)節(jié)和碳源，無毒性，不危及材料遺傳完整性。無毒性，不危及材料遺傳完整性。 DMSO：冰點(diǎn)低，進(jìn)入細(xì)胞后不僅：冰點(diǎn)低，進(jìn)入細(xì)胞后不僅降低材料含水量，而且可降低細(xì)胞結(jié)降低材料含水量，而且可降低細(xì)胞結(jié)冰點(diǎn)。冰點(diǎn)。 （3）低溫鍛煉可激活植物體內(nèi)的抗寒）低溫鍛煉可激活植物體內(nèi)的抗寒機(jī)制。讓植物在較低溫度下接受機(jī)制。讓植物在較低溫度下接受1周到周到幾周的低溫，并給予短日照或用化合幾周的低溫，并給予短日照或用化合物

42、處理，可使植物產(chǎn)生抗寒性。物處理，可使植物產(chǎn)生抗寒性。3）超低溫保存方法的選擇）超低溫保存方法的選擇 從各種材料的保存技術(shù)體系中找出從各種材料的保存技術(shù)體系中找出一定的規(guī)律，按照材料的基因型及生一定的規(guī)律，按照材料的基因型及生理狀態(tài)的不同，分別建立與之相適應(yīng)理狀態(tài)的不同，分別建立與之相適應(yīng)的保存模式，尋求最佳的保存方法。的保存模式，尋求最佳的保存方法。 液泡小、含水量少的細(xì)胞可采液泡小、含水量少的細(xì)胞可采用快速降溫冷凍方法；液泡大、用快速降溫冷凍方法；液泡大、含水量高的細(xì)胞一般需要采用慢含水量高的細(xì)胞一般需要采用慢速降溫法。速降溫法。4）冷凍保護(hù)劑）冷凍保護(hù)劑 特點(diǎn)：特點(diǎn)：易溶于水，在適當(dāng)質(zhì)量

43、分?jǐn)?shù)下易溶于水，在適當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對細(xì)胞是無毒的，化凍后易從組織細(xì)對細(xì)胞是無毒的，化凍后易從組織細(xì)胞中清除。胞中清除。 常用冷凍保護(hù)劑：常用冷凍保護(hù)劑：二甲基亞砜二甲基亞砜（DMSO）、甘油、脯氨酸、糖類、）、甘油、脯氨酸、糖類、乙二醇、二甘油、乙酰胺、福美氧化乙二醇、二甘油、乙酰胺、福美氧化劑等劑等 在進(jìn)行各種處理時(shí)，應(yīng)把冷凍保護(hù)在進(jìn)行各種處理時(shí)，應(yīng)把冷凍保護(hù)劑溶解于含糖或不含糖的冰中，或是劑溶解于含糖或不含糖的冰中，或是溶解在培養(yǎng)基中。溶解在培養(yǎng)基中。 為了保護(hù)細(xì)胞不受滲透壓變動(dòng)的影為了保護(hù)細(xì)胞不受滲透壓變動(dòng)的影響，保護(hù)劑應(yīng)當(dāng)在響，保護(hù)劑應(yīng)當(dāng)在3060min的一段時(shí)的一段時(shí)間內(nèi)逐漸加入。注意

44、溫度、時(shí)間等，間內(nèi)逐漸加入。注意溫度、時(shí)間等，防止產(chǎn)生毒害。防止產(chǎn)生毒害。 對植物來說，對植物來說，DMSO是最好的保護(hù)是最好的保護(hù)劑，其次是甘油。劑，其次是甘油。 在許多情況下，兩三種或更多冷凍在許多情況下，兩三種或更多冷凍保護(hù)劑混合使用可減低藥劑的毒性，保護(hù)劑混合使用可減低藥劑的毒性，同時(shí)提高細(xì)胞的存活率。同時(shí)提高細(xì)胞的存活率。5）材料的冷凍降溫方法）材料的冷凍降溫方法 快速冷凍法快速冷凍法 慢速冷凍法慢速冷凍法 兩步冷凍法兩步冷凍法 逐級冷凍法逐級冷凍法6）化凍和洗滌）化凍和洗滌 采取合適的化凍方法，以避免采取合適的化凍方法，以避免在化凍過程中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的次生在化凍過程中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的次生

45、結(jié)冰，并應(yīng)防止在化凍吸水過程結(jié)冰，并應(yīng)防止在化凍吸水過程中滲透沖擊對細(xì)胞膜體系的破壞。中滲透沖擊對細(xì)胞膜體系的破壞。 采用何種化凍方法與保存植物材料采用何種化凍方法與保存植物材料的性質(zhì)有關(guān)。的性質(zhì)有關(guān)。 大多數(shù)植物材料采用快速化凍，即大多數(shù)植物材料采用快速化凍，即將液氮保存后的材料直接在將液氮保存后的材料直接在3440的的溫水浴中化凍。溫水浴中化凍。 細(xì)胞含水較低的物種和材料適合用細(xì)胞含水較低的物種和材料適合用慢速化凍，即將超低溫保存材料先置慢速化凍，即將超低溫保存材料先置于于00低溫下，然后逐漸升至室溫，讓低溫下，然后逐漸升至室溫，讓其緩慢化凍。其緩慢化凍。 化凍速度還與降溫冷凍速度有關(guān)。化

46、凍速度還與降溫冷凍速度有關(guān)。一般而言，冷凍速度超過一般而言，冷凍速度超過-15/min/min，化凍時(shí)宜采用快速化凍，否則采用慢化凍時(shí)宜采用快速化凍，否則采用慢速化凍。速化凍。 化凍方式還影響材料的發(fā)育?；瘍龇绞竭€影響材料的發(fā)育。 化凍過程中應(yīng)小心操作，避免機(jī)械化凍過程中應(yīng)小心操作，避免機(jī)械損傷。試管內(nèi)的冰一旦溶解后，要立損傷。試管內(nèi)的冰一旦溶解后，要立即將試管轉(zhuǎn)移到即將試管轉(zhuǎn)移到2020的水浴室中，的水浴室中，并立即進(jìn)行洗滌和再培養(yǎng)，以避免熱并立即進(jìn)行洗滌和再培養(yǎng)，以避免熱傷害。傷害。7）再培養(yǎng)）再培養(yǎng) 植物材料化凍洗滌后，應(yīng)轉(zhuǎn)到培養(yǎng)植物材料化凍洗滌后，應(yīng)轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上先暗培養(yǎng)，以避免光對超低

47、溫?；舷劝蹬囵B(yǎng)，以避免光對超低溫保存后已有不同程度傷害材料的光抑制存后已有不同程度傷害材料的光抑制等不良影響，利于材料恢復(fù)生長。對等不良影響，利于材料恢復(fù)生長。對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或愈傷組織，在細(xì)胞于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或愈傷組織，在細(xì)胞轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長之前，轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長之前，常需在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)常需在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12周。周。 選擇凍存后合適的培養(yǎng)基成分是成選擇凍存后合適的培養(yǎng)基成分是成功的關(guān)鍵。功的關(guān)鍵。8）抗凍蛋白與種質(zhì)保存）抗凍蛋白與種質(zhì)保存 AFP能和冰晶作用，改變冰晶的結(jié)構(gòu)、能和冰晶作用，改變冰晶的結(jié)構(gòu)、大小和數(shù)目；大小和數(shù)目；AFP能和細(xì)胞膜作用，能和細(xì)胞膜

48、作用，封閉離子通道，阻止溶質(zhì)滲漏，保護(hù)封閉離子通道，阻止溶質(zhì)滲漏，保護(hù)膜完整性。膜完整性。二、低溫保存二、低溫保存1.低溫保存概況低溫保存概況 將外植體所再生的試管苗在低溫條將外植體所再生的試管苗在低溫條件下，結(jié)合某些特定的培養(yǎng)基如增加件下，結(jié)合某些特定的培養(yǎng)基如增加蔗糖濃度、添加甘露醇、山梨醇、脫蔗糖濃度、添加甘露醇、山梨醇、脫落酸等生長延緩因子，輔以培養(yǎng)環(huán)境落酸等生長延緩因子，輔以培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控，從而抑制或延緩生長，延長的調(diào)控，從而抑制或延緩生長，延長壽命，達(dá)到保存種質(zhì)的目的。壽命，達(dá)到保存種質(zhì)的目的。主要研究內(nèi)容主要研究內(nèi)容 在低于正常培養(yǎng)所需光照、溫度條在低于正常培養(yǎng)所需光照、溫度條件

49、下，篩選合適的生長延緩因子極其件下，篩選合適的生長延緩因子極其濃度，探討保存材料最長保存時(shí)間極濃度，探討保存材料最長保存時(shí)間極其存活率和再生率，分析其遺傳穩(wěn)定其存活率和再生率，分析其遺傳穩(wěn)定性，以優(yōu)化最佳的保存條件。性，以優(yōu)化最佳的保存條件。2.低溫保存方法與技術(shù)低溫保存方法與技術(shù)1）控制培養(yǎng)環(huán)境溫度）控制培養(yǎng)環(huán)境溫度 （1）常溫）常溫(255 5) 生長較緩慢和冷生長較緩慢和冷敏感植物種質(zhì)采用的保存方法。敏感植物種質(zhì)采用的保存方法。 （2）常低溫）常低溫(015)和低溫和低溫(-800) 很多植物種質(zhì)都可用常低溫保存。很多植物種質(zhì)都可用常低溫保存。2）改良培養(yǎng)基中某些）改良培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的濃度營養(yǎng)物質(zhì)的濃度 從培養(yǎng)基中減去一兩種營養(yǎng)元素，從培養(yǎng)基中減去一兩種營養(yǎng)元素，或者降低某些營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，或或者降低某些營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，或者略微改變培養(yǎng)基成分，使培養(yǎng)植者略微改變培養(yǎng)基成分，使培養(yǎng)植株處于最小生長階段。株處于最小生長階段。3）提高培養(yǎng)基滲透壓）