感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化和提取

1、感受態(tài)細(xì)胞的制備LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨，1%（W/V）；酵母提取物，0.5%（W/V）；NaCl，1%（W/V），用固體NaOH調(diào)節(jié)pH為7.07.2，分裝于三角瓶中，滅菌后存于室溫。搖動(dòng)三角瓶，如果發(fā)現(xiàn)變渾濁，表明已染菌，應(yīng)棄掉重新配制；0.1 mol/L CaCl2：稱(chēng)取1.47 g CaCl22H20（Amresco分裝）溶于100 mL去離子水中，滅菌后存于4；離心管（50 mL或80 mL或100 mL），滅菌；培養(yǎng)試管，滅菌；1 mL槍頭，滅菌；1 mL加樣槍?zhuān)粸V紙，用牛皮紙包好后滅菌；10 mL量筒，滅菌；5 mL移液管，用棉花塞入管口，卷于報(bào)紙中滅菌；冰，離心管架；恒溫?fù)u床，

2、可見(jiàn)分光光度計(jì)，玻璃比色杯。1接種空白大腸桿菌于3 mL LB培養(yǎng)基中，37劇烈震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2將已培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)入100 mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD650=0.3后，將培養(yǎng)好的細(xì)菌置于冰上冷卻10 min；34，4 000 rpm離心10 min收集細(xì)菌，倒出上清，將離心管倒置于一干凈濾紙上，將培養(yǎng)基控干；4用40 mL冰預(yù)冷的CaCl2懸浮細(xì)菌，用加樣槍沖吸，使菌體盡可能分散。冰上放置30 min；54，4 000 rpm離心10 min收集細(xì)菌，倒出上清，再用4 mL冰預(yù)冷的CaCl2懸浮細(xì)菌，這些細(xì)菌可以立即使用，或者于4放置1224 h以增加其敏感性后使用。6如果證明所制備的

3、感受態(tài)細(xì)胞可用，可以在冰上分裝為100 L每管，再加入100 L甘油（注意：甘油非常黏稠，吸取時(shí)應(yīng)該多一點(diǎn)。），于液氮或-70冰箱中存放。存于低溫下的感受態(tài)細(xì)胞，一定不能融解。如果已經(jīng)融解，應(yīng)丟棄，而不能再凍結(jié)保存而繼續(xù)使用。注意事項(xiàng)：1本實(shí)驗(yàn)室所用空白大腸桿菌菌株為JM109?？瞻拙梢杂谄桨迳蟿澗€(xiàn)后，用Parafilm包好后存于4，也可將液體培養(yǎng)物存于4。但如果要長(zhǎng)期保存，則應(yīng)將細(xì)菌保存于50%的甘油中，存于-20或-70。當(dāng)接種的細(xì)菌是來(lái)自于-20或-70存放的液體培養(yǎng)物時(shí)，接種應(yīng)迅速，不等解凍，立即從表面刮下一塊冰后，將菌種迅速放回低溫存放；2一般于3 mL LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)12

4、h后，菌體已很濃，可以進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。于100 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 h后，即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。但有時(shí)如果由于存放過(guò)久，或者已經(jīng)過(guò)數(shù)次解凍，造成細(xì)菌生活力下降，則倍增時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)；3對(duì)OD值的監(jiān)測(cè)，當(dāng)肉眼看到菌體已很濃時(shí)，于超凈臺(tái)上取3 mL測(cè)OD值。開(kāi)始可以每30分鐘檢測(cè)一次，越到后面檢測(cè)的時(shí)間就應(yīng)該縮短；4感受態(tài)細(xì)胞的制備應(yīng)該再?lài)?yán)格無(wú)菌的條件下進(jìn)行。因此，所有操作均應(yīng)在超凈臺(tái)上。也可以在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行，但應(yīng)在后面放一酒精燈，所有操作都不能遠(yuǎn)離火焰。最好每次恰好做感受態(tài)之前，將所有的槍頭和管子都滅一下菌，用酒精棉球?qū)⒓訕訕尩那岸瞬潦靡槐椋?感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞膜比較脆弱，因此一當(dāng)用冰冷的CaCl2懸浮

5、以后，即不能劇烈震蕩或快速抽吸；6根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，純度較高的含結(jié)晶水的CaCl2可以得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；7所有的槍頭和管子均應(yīng)干凈。如果有可能，都盡量用新的。如果是用的回收的槍頭，一定要看管壁是否干凈。8擴(kuò)大培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基體積可以調(diào)整。調(diào)整后的CaCl2溶液體積也按比例作相應(yīng)的放大或縮小。9以本方法制備的感受態(tài)細(xì)胞的感受效率將隨低溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，所以最好是現(xiàn)做現(xiàn)用。存于低溫下的感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)該在一個(gè)月內(nèi)使用。而對(duì)于轉(zhuǎn)化PCR連接產(chǎn)物，建議用其它的感受效率更高的制備方法。本節(jié)后的附4介紹了一種高感受效率感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化LB液體培養(yǎng)基：見(jiàn)感受態(tài)細(xì)胞的制備；LB固體培養(yǎng)

6、基：于液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉。不用在滅菌前溶化瓊脂粉，滅菌完后，輕輕搖勻。注意不能劇烈搖動(dòng)，否則可能會(huì)使培養(yǎng)基暴沸；LB平板：將滅菌后的固體培養(yǎng)基冷至60左右時(shí)，倒入90 mm的培養(yǎng)皿中（約30 mL。如果先前已加入了抗生素，則還應(yīng)在超凈臺(tái)上晃動(dòng)培養(yǎng)皿幾次；200 L槍頭，1.5 mL Ep管，滅菌；42水?。?0 L，200 L加樣槍?zhuān)慌囵B(yǎng)試管，滅菌；恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱；菌液推棒；抗生素儲(chǔ)液，本實(shí)驗(yàn)室所有的質(zhì)粒篩選所用的抗生素有兩類(lèi)，氨卞青霉素（Amp）（儲(chǔ)液，100 mg/mL，溶于無(wú)菌水中，工作濃度100 g/mL，即每毫升培養(yǎng)基取1 L儲(chǔ)液）；四環(huán)素（Tet）（儲(chǔ)液，5 m

7、g/mL，先用1/2體積的乙醇溶解，再加入1/2體積的無(wú)菌水，工作濃度50 g/mL，即每毫升培養(yǎng)基取10 L儲(chǔ)液。儲(chǔ)液全部于-20保存）；冰；1 如果是凍存的感受態(tài)細(xì)胞，先于冰上溶解；2加入用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA 1 L；3冰上放置30 min；4于42熱擊60 s；5迅速放于冰上，5 min后進(jìn)行下一步；6將已攝取了外源遺傳物質(zhì)的感受態(tài)細(xì)胞加入培養(yǎng)試管，該培養(yǎng)試管有已預(yù)熱至37的LB液體培養(yǎng)基，使總體積為1 mL，溫和震蕩（200 rpm左右）培養(yǎng)1 h；7，將復(fù)蘇的培養(yǎng)物倒入一Ep管中，4，4 000 rpm離心10 min，將培養(yǎng)基倒掉，用殘留的培養(yǎng)基懸浮，然后用加樣槍將菌液加到LB平板

8、上，用推棒涂布直至培養(yǎng)基表面無(wú)可見(jiàn)的液體，將有培養(yǎng)基的一面向下培養(yǎng)約30 min后，倒置培養(yǎng)過(guò)夜。注意事項(xiàng)：1熱擊時(shí)間要根據(jù)所用管子的傳熱效率，薄壁管子的傳熱效率高，熱擊時(shí)間可以縮短到45 s；2熱擊時(shí)，要使水浴盡可能不要流動(dòng)，熱擊后應(yīng)迅速放回冰上；3于37復(fù)蘇細(xì)菌時(shí)，不能加抗生素，搖動(dòng)也不能太過(guò)于劇烈；4對(duì)照的設(shè)置對(duì)于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化結(jié)果非常重要，將10 L感受態(tài)細(xì)胞分別涂布于不含抗生素或含有抗生素的平板上，如果感受態(tài)細(xì)胞沒(méi)有問(wèn)題，則應(yīng)該在不含抗生素的平板上生長(zhǎng)，而在含有抗生素的平板上不能生長(zhǎng)。5一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以用其中的1/3涂布一個(gè)平板，2/3涂布一個(gè)平板。不過(guò)，對(duì)于多拷貝質(zhì)粒，也可以不用離心，取

9、50 L涂布一個(gè)平板足矣。質(zhì)粒DNA的提取儲(chǔ)液：100 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)：稱(chēng)取Tris 12.1 g, 用濃HCl調(diào)節(jié)pH為8.0，然后定溶至100 mL，滅菌后存于4；100 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)：稱(chēng)取18.6 g二水乙二胺四乙酸二鈉，加80 mL去離子水，加熱溶解，用固體NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，然后定溶至100 mL，滅菌后存于4；100 mL 10% SDS，稱(chēng)取10 g十二烷基硫酸鈉于80 mL去離子水中，加熱溶解后存于室溫；2 mol/L NaOH 10 mL，稱(chēng)取0.8 g固體NaOH溶解，定溶至10 mL，

10、于塑料瓶中室溫存放，可以不滅菌。溶液I：每配制100 mL，稱(chēng)取葡萄糖0.9 g (50 mmol/L)，1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2.5 mL (25 mmol/L), 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 2 mL (10 mmol/L)，定溶至100 mL，滅菌后存于4；溶液II：現(xiàn)用現(xiàn)配，每100 L需要2 mol/L NaOH 10 L (0.2 mol/L)，10% SDS 10 L (1%)，然后加80 L無(wú)菌水；溶液III：每100 mL 稱(chēng)取KAc 49.1g,于70 mL去離子水中溶解，然后加入冰乙酸11.5 mL，定溶至100 mL后，滅

11、菌存于4；TE (pH 8.0)：每100 mL取1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)儲(chǔ)液1 mL (10 mmol/L)，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 0.2 mL (1 mmol/L)，定溶至100 mL后，滅菌存于4；無(wú)DNase的RNaseA：將RNaseA溶于10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5), 15 mmol/L NaCl中，使終濃度為10 mg/mL,于100加熱15分鐘，緩慢冷至室溫，然后存于-20；Tris飽和酚(pH 8.0)；氯仿/異戊醇（24：1）；100%乙醇與70%乙醇，均于-20存放；1.5 mL Ep管，200

12、L及1 mL槍頭，滅菌；40 L，200 L，1 mL加樣槍?zhuān)粸V紙，1.5 mL Ep管；冰；1接種一單菌落于3 mL含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)試管中，于37劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2將全部培養(yǎng)物分兩次倒入1.5 mL Ep管中,12 000 g離心1 min收集細(xì)胞;3將Ep管倒置于一干凈濾紙上，將培養(yǎng)基盡可能流盡；4將細(xì)菌沉淀重懸于200 l冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩使細(xì)菌沉淀分散；5加400 L新配制的溶液II，蓋緊管口，輕柔的快速顛倒Ep管510次，然后將Ep管于冰上放置5 min；6加300 L用冰預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口，將Ep管顛倒混合15次左右，然后將Ep管于冰上放置5 min；72，12

13、 000 g離心5 min，將上清轉(zhuǎn)入另一Ep管，加等體積的酚/氯仿，振蕩混勻，2，12 000 g離心5 min；8吸出上清，再加等體積的氯仿抽提；9在吸出的上清中加入2倍體積冰冷的乙醇于室溫沉淀2 min；102，12 000 g離心5 min，倒出上清，沉淀用70%乙醇洗兩次。然后倒置于一濾紙上，讓乙醇揮發(fā)干凈；11高拷貝質(zhì)粒溶于含5 L RNaseA的50 l TE中；低拷貝數(shù)質(zhì)粒減半。注意事項(xiàng)：1細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般以1216 h為宜，如果培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)物會(huì)非常粘稠，這會(huì)導(dǎo)致離心沉淀的困難；2一般細(xì)菌培養(yǎng)好以后，應(yīng)該馬上提取。如果不能馬上提取，于4存放時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)；2加溶液

14、I分散細(xì)菌沉淀比較關(guān)鍵，如果分散不好，將直接影響產(chǎn)率；3溶液I加入后，溶液會(huì)非常渾濁，加入溶液II顛倒幾次后，溶液變清，打開(kāi)管口，會(huì)發(fā)現(xiàn)溶液呈鼻涕樣，加入溶液III顛倒后，會(huì)發(fā)現(xiàn)有沉淀物形成，該沉淀物位于溶液上層。如果發(fā)現(xiàn)沉淀不能自動(dòng)聚集，而是呈爛棉花狀，且離心后不能沉到管底，則預(yù)示著實(shí)驗(yàn)的失敗；4培養(yǎng)基的成分非常復(fù)雜，如果去除得不太干凈，則有可能影響到后面的酶切效果；5乙醇必須去除干凈，否則會(huì)造成電泳點(diǎn)樣時(shí)上漂；但樣品又不能干燥太久，否則有可能使得質(zhì)粒DNA沉淀難于溶解在TE中。6SDS在低溫下會(huì)析出結(jié)晶，因此配制溶液II時(shí)應(yīng)先于60溶解；7如果一次要提多個(gè)樣品，可以先一起配制溶液II，而后

15、加入每管。但配制時(shí)應(yīng)略大于所需要的量；附：1苯酚的平衡重蒸苯酚8-羥基喹啉水浴鍋固體Tris50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0): 稱(chēng)取6.055 g Tris，溶于800 mL蒸餾水中，用濃HCl調(diào)pH為8.0，定容到1 L。1將重蒸酚于65水浴融化；2取100 mL融化的重蒸酚于一250 mL燒杯中，馬上加至少等體積的蒸餾水，同時(shí)加入0.1%苯酚體積的8-羥基喹啉，然后加入少量的固體Tris，當(dāng)Tris溶解后，可看到液面分層出現(xiàn)，加Tris用7.68.5的精密pH試紙調(diào)pH為8.0（待加入的Tris溶解充分后，停止攪拌，待分層完全出現(xiàn)后，再用pH試紙測(cè)上相的pH值）。3將

16、上清吸出，加入100 mL 50 mmol/L Tris (pH 8.0)，充分?jǐn)嚢韬?，測(cè)定上清的pH值。如果不到8.0，則還需要調(diào)節(jié)。4將上清吸出，再加入100 mL 50 mmol/L Tris (pH 8.0)，充分?jǐn)嚢韬?，吸出上清，但要在液面上保留一層液體。倒入棕色瓶中，于4保存。這樣的飽和酚可以使用2個(gè)月。如果超出2個(gè)月，則應(yīng)倒入專(zhuān)用的盛裝回收酚的棕色瓶中，再重新平衡。注意：1. 酚有強(qiáng)烈的腐蝕性，所以操作時(shí)一定要小心，注意不能溢出或?yàn)R出，并且要戴手套。如果不小心濺到皮膚上，用大量的水沖洗，切忌用乙醇！2. 由于酚的腐蝕性，所以不用pH計(jì)調(diào)pH值，只能用pH試紙。3. Tris一定要

17、溶解充分后，再測(cè)定pH值。2核酸樣品中蛋白質(zhì)的去除3 mol/L NaAC（pH 5.2）：稱(chēng)取40.824 g NaAc3H2O或無(wú)水NaAc 24.6 g，溶于30 mL水中，加HAc調(diào)pH至5.2，用水定溶至100 mL（調(diào)pH時(shí)，愈到后面，愈應(yīng)小心）。然后滅菌存于4。如果是濃縮RNA，還要用DEPC處理后再滅菌。槍頭和管子：根據(jù)純化樣品的不同而采取不同的處理方式，純化DNA時(shí)只需滅菌，純化RNA時(shí)則需要DEPC處理后再滅菌。Tris飽和酚(pH 8.0)；氯仿/異戊醇（24：1）；凍存于-20的無(wú)水乙醇和70%乙醇1在核酸樣品中加入1/2樣品體積的Tris飽和酚和1/2樣品體積的氯仿/

18、異戊醇，混勻后，于2，12 000 rpm離心5 min，將上清轉(zhuǎn)入一新管中，重復(fù)酚/氯仿抽提直至界面無(wú)可見(jiàn)的沉淀物為止。2加入1倍樣品體積的氯仿/異戊醇，混合均勻后，于2，12 000 rpm離心5 min，將上清轉(zhuǎn)入另一新管。3加入1/10終體積的3 mol/L NaAC（pH 5.2），再加入2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，于-20至少沉淀3 h。42，12 000 rpm離心15 min。沉淀用70%的乙醇表面潤(rùn)洗2次，將管倒置于一濾紙上，空氣中干燥。然后將樣品溶于適量體積的溶劑中。注意：1混勻方式要根據(jù)DNA和RNA而有所不同：RNA混勻時(shí)，可以劇烈震蕩，而DNA只能用手顛倒混勻。2吸取上

19、清液應(yīng)根據(jù)待純化的樣品是DNA還是RNA而有所不同：DNA吸取要緩慢，RNA則可以不加注意。3所加乙醇的體積是以加了鹽后的體積計(jì)算的。4如果待純化的核酸樣品量太少（1g）或樣品太稀(0.01g/l),則所加乙醇的量應(yīng)擴(kuò)大到2.53倍。3核酸的濃縮以上所述的去除核酸中的蛋白質(zhì)后，再用乙醇沉淀即為核酸的濃縮。如果核酸樣品已經(jīng)很純，則沉淀時(shí)無(wú)必要加入醋酸鹽；如果核酸樣品中還有雜質(zhì)需要去除，則還應(yīng)加入醋酸鹽（NaAc, KAc或NH4AC）。4高感受效率感受態(tài)細(xì)胞的制備E. coli JM109或其它菌種LB液體培養(yǎng)基50 mL離心管LB固體培養(yǎng)基LB平板200 L槍頭，1.5 mL Ep管，滅菌；4

20、2水??；10 L，200 L加樣槍?zhuān)慌囵B(yǎng)試管，滅菌；恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱；菌液推棒；抗生素儲(chǔ)液，本實(shí)驗(yàn)室所有的質(zhì)粒篩選所用的抗生素有兩類(lèi)，氨卞青霉素（Amp）（儲(chǔ)液，100 mg/mL，溶于無(wú)菌水中，工作濃度100 g/mL，即每毫升培養(yǎng)基取1 L儲(chǔ)液）；四環(huán)素（Tet）（儲(chǔ)液，5 mg/mL，先用1/2體積的乙醇溶解，再加入1/2體積的無(wú)菌水，工作濃度50 g/mL，即每毫升培養(yǎng)基取10 L儲(chǔ)液。儲(chǔ)液全部于-20保存）；冰；SOB培養(yǎng)基(1L); 蛋白胨20 g, 酵母抽提物5 g, NaCl 0.58 g, KCl 0.38 g,100鎂離子母液(每100 mL含MgCl26H2O 20.

21、33 g, MgSO47H2O 24.65 g) 10 mL。用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。SOC培養(yǎng)基：SOB+20 mmol葡萄糖（每100 mL SOB培養(yǎng)基中加入50%的葡萄糖溶液720 L。）0.5 mol/L CaCl2：7.35 g CaCl22H2O溶于100 mL ddH2O中。用0.22 m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。1 mol/L KCl：7.45 g KCl溶于100 mL ddH2O中，高壓滅菌。0.45 mol/L MnCl2；8.9 g MnCl24H2O溶于100 mL ddH2O中，高壓滅菌。0.5 mol/L（K-MES）：9.76 g 2（-N-嗎啡啉）乙磺酸溶于約80 mL ddH2O中，用KOH調(diào)pH為6.2，加水定容至100 mL，用0.22 m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。分裝后于-20oC保存。二甲基亞砜（DMSO）。TB緩沖液：10 mmol/L K-MES (pH 6.2) （0.5 mol/L K-MES (pH 6.2) 2 mL ）, 45 mmol/L MnCl2 (0.45 mol/L MnCl2 10 mL, 15 mmol/L CaCl2 (0.5 mol/L CaCl2 3 mL)，250