大腸桿菌群檢測(cè)方法

1、大腸桿菌群檢測(cè)方法：用平板涂布法將樣品稀釋后（每個(gè)水樣做3個(gè)濃度）涂布到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基后，待長(zhǎng)出菌落，觀察符合特征的群落，計(jì)算菌落數(shù)目，從而求出總數(shù)目。培養(yǎng)基及試劑配制-伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基1. 成分：蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 2g瓊脂 2030g蒸餾水 1000ml2%伊紅水溶液 20ml0.5 %美藍(lán)水溶液 13ml2.配制方法：先將瓊脂加至900ml蒸餾水，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨，混勻使之溶解，再以蒸餾水補(bǔ)足至1000ml，調(diào)整PH為7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入乳糖，混勻后定量分裝于燒瓶?jī)?nèi)，置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)以115滅菌20min，冷卻備用。臨用時(shí)加入

2、乳糖并加熱溶化瓊脂，冷至5055，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平板。1稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。2溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補(bǔ)足所失的水分。3調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試

3、紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH值，直至pH達(dá)7.6。反之，則用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會(huì)影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。對(duì)于有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行（使用方法，可參考有關(guān)說(shuō)明書）。4分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。實(shí)驗(yàn)步驟1. 涂布平板法：1 以無(wú)菌操作將檢樣25mL(或g放于有225mL滅菌

4、生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。以8 000-10 000 r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。 2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。 3 另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。4.將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無(wú)菌平板中，待凝固后編號(hào)，然后用無(wú)菌吸管吸取0.1ml菌液對(duì)號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上。再用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個(gè)稀釋

5、度用一個(gè)滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。2. 菌落統(tǒng)計(jì)方法-平板選擇法1.細(xì)菌常選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。每一稀釋度采用兩個(gè)平板菌落的平均數(shù)，如兩個(gè)平板其中一個(gè)有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，如片狀菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全板菌落數(shù)。2.計(jì)數(shù)方法  作平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，一般無(wú)用肉眼觀察，用鋼筆或蠟筆在平板上

6、進(jìn)行點(diǎn)數(shù)，必要時(shí)可借助于放大鏡檢查有無(wú)遺漏的微小菌落。在計(jì)數(shù)出各平板菌落數(shù)后，求出同一稀釋度菌落的平均數(shù)。表1 平板上菌落數(shù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差平板上菌落數(shù)(個(gè)/皿30x5051             x99100x300標(biāo)準(zhǔn)差(±10.020.050.0  如三個(gè)重復(fù)分別為43、32、46，則平均值為403，（x-x）2分別為72.9、6889、32.49，± 737，寫成±74（一）。將檢驗(yàn)所得的標(biāo)準(zhǔn)差作修約處理，與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的允許誤差作比

7、較，只要越出規(guī)定的極限數(shù)值都判定為不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，示例見表2。表2 菌數(shù)的測(cè)定誤差與判定示例稀釋平板菌落數(shù)(個(gè)/皿檢測(cè)中允許的誤差(n-1平板菌落數(shù)測(cè)定值(個(gè)/皿是否符合要求重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3平均值標(biāo)準(zhǔn)差(n-130 x50 ±10.042614750.0±0.0(-符合40605050.0±10.0符合40605150.3±0.0(+不符37635050.0±13.0不符51x99 ±20.061868276.3±3.4(+符合57554953.7±4.2(-符合906310285.0±0.0(-符合9

8、15910585.0±3.6(-不符100x300 ±50.010895123108.7±4.0(+符合298206286263.3±0.0(+不符297206287263.3±0.0(-符合300174286253.3±9.1(-不符3   菌落計(jì)數(shù)  應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30300之間，視兩稀釋液測(cè)定值之比來(lái)決定，如其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；如大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字；如所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于乘以最低稀釋倍數(shù)