基因多態(tài)性的檢測方法

1、基因多態(tài)性的檢測方法多態(tài)性（polymorphism）是指處于隨機婚配的群體中，同一基因位點可存在2種以上的基因型。在人群中，個體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因（DNA）的多態(tài)性(gene polymorphism)。這種多態(tài)性可以分為兩類，即DNA位點多態(tài)性(site polymorphism)和長度多態(tài)性 (longth polymorphism)?；蚨鄳B(tài)性的主要檢測方法簡述如下：1限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態(tài)性，致使DNA 分子的限制酶切位點及數(shù)目發(fā)生改變，用限制酶切割基因組

2、時，鈉問亢兔扛銎蔚某染筒煌此降南拗菩云緯榷嗵裕賈孿拗破緯確謀淶拿蓋形壞悖殖莆嗵暈壞恪鈐縭怯肧outhern Blot/RFLP方法檢測，后來采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）與限制酶酶切相結(jié)合的方法?，F(xiàn)在多采用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態(tài)性。2單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）：是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個堿基不同，就會形成不同的構(gòu)象。在電泳時泳動的速度不同。將PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發(fā)生單個堿基替換等改變時，就會出現(xiàn)泳動變位（mobility shift），多用于鑒定是否存在突變及診斷未知突變

3、。3PCR-ASO探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針法。在PCR擴增DNA片段后，直接與相應(yīng)的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用PCR擴增后，產(chǎn)物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變堿基。突變堿基及對應(yīng)的正常堿 基勻位于寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補的等位基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央堿基不同的等位基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交，說明

4、突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應(yīng)的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。4. PCR-SSO法：SSO技術(shù)即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段擴增后利用序列特異性寡核苷酸探針，通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑒定。探針與PCR產(chǎn)物在一定條件下雜交具有高度的特異性，嚴格遵循堿基互補的原則。探針可用放射性同位素標(biāo)記，通過放射自顯影的方法檢測，也可以

5、用非放射性標(biāo)記如地高辛、生物素、過氧化物酶等進行相應(yīng)的標(biāo)記物檢測。5. PCR-SSP法：序列特異性引物分析即根據(jù)各等位基因的核苷酸序列，設(shè)計出一套針對每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性 (group-specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。SSP只能與某一等位基因特異性片段的堿基序列互補性結(jié)合，通過PCR特異性地擴增該基因片段，從而達到分析基因多態(tài)性的目的。6. PCR-熒光法：用熒光標(biāo)記PCR引物的5端，熒光染料FAM和JOE呈綠色熒光，TAMRA呈紅色熒光，COUM 呈蘭色熒光，不同熒光標(biāo)記的多種引物同時參加反應(yīng)，PCR擴增待檢測的DNA

6、，合成的產(chǎn)物分別帶有引物5端的染料，很容易發(fā)現(xiàn)目的基因存在與否。7. PCR-DNA測序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由于PCR技術(shù)的應(yīng)用，使得DNA 測序技術(shù)從過去的分子克隆后測序進入PCR直接測序。PCR產(chǎn)物在自動測序儀上電泳后測序。常用方法有：Sanger雙脫氧末端終止法;Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法；DNA測序的自動化。目前DNA順序全自動激光測定法是最先進的方法。8. PCR指紋圖法（PCR-fingerprints）：實用于快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個體中，每種DR單倍型及每種單倍型組合所產(chǎn)生的單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的大小、數(shù)目和位置各異，由于同質(zhì)雙

7、鏈和異質(zhì)雙鏈之間的分子構(gòu)象不同。因此，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它們的遷移率各不相同，從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針，同經(jīng)過酶切的人體DNA作Southern blot，可以得出長度不等的雜交帶，雜交帶的數(shù)目和分子量的大小具有個體特異性，除非同卵雙生，幾乎沒有兩個人是完全相同的，就象人的 指紋一樣，人們把這種雜交帶圖形稱為基因指紋(gene finger-printing)。9. 基因芯片法：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標(biāo)記的若干靶核酸序列互補匹配，與芯片特定

8、位點上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術(shù)已用于基因多態(tài)性的檢測。對多態(tài)性和突變檢測型基因芯片采用多色熒光探針雜交技術(shù)可以大大提高芯片的準(zhǔn)確性、定量及檢測范圍。應(yīng)用高密度基因芯片檢測單堿基多態(tài)性，為分析SNPs提供了便捷的方法。10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法AFLP技術(shù)是一項新的分子標(biāo)記技術(shù)，是基于PCR技術(shù)擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結(jié)合位點

9、。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導(dǎo)及DNA擴增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標(biāo)記。AFLP可在一次單個反應(yīng)中檢測到大量的片段。以說AFLP技術(shù)是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術(shù)。11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法變性梯度凝膠電泳法（） DGGE法分析PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率

10、可達100，檢測片段可達1kb，最適圍為100bp-500bp。基本原理基于當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳適移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測發(fā)生于高熔點區(qū)的突變。在DGGE的基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TG

11、GE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經(jīng)建立，操作也較簡便，適合于大樣本的檢測篩選。12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法運用隨機引物擴增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD( Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態(tài)性DNA)。盡管RAPD技術(shù)誕生的時間很短, 但由于其獨特的檢測DNA多態(tài)性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術(shù)已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點.這些特異的結(jié)合位點在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴增反應(yīng)的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內(nèi),就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些