原子力顯微鏡在生物醫(yī)學中的應(yīng)用-- 生物醫(yī)學工程

1、原子力顯微鏡在生物醫(yī)學中的應(yīng)用- 生物醫(yī)學工程     1 原子力顯微鏡工作原理    原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）是一種以物理學原理為基礎(chǔ)，通過掃描探針與樣品表面原子相互作用而成像的新型表面分析儀器。它屬于繼光學顯微鏡、電子顯微鏡之后的第三代顯微鏡。AFM通常利用一個很尖的探針對樣品掃描，探針固定在對探針與樣品表面作用力極敏感的微懸臂上。懸臂受力偏折會引起由激光源發(fā)出的激光束經(jīng)懸臂反射后發(fā)生位移。檢測器接受反射光，最后接受信號經(jīng)過計算機系統(tǒng)采集、處理、形成樣品表面形貌圖像

2、。早期研制的為接觸式原子力顯微鏡，它包括恒力模式和恒高模式。前者利用反射光位移引起的光電二極管輸出電壓的變化構(gòu)成反饋回路控制壓電陶瓷管伸縮，從而調(diào)節(jié)固定于掃描器上樣品的位置，保持樣品和探針間作用力（懸臂彎曲度）不變，測量每一點高度的變化。后者保持樣品和探針間的距離不變，測量每一點作用力的大小。這種模式在調(diào)節(jié)探針與樣品距離前即可直接觀測懸臂彎曲度的改變。除傳統(tǒng)的接觸式之外，1993年又研制出輕敲式原子力顯微鏡。該顯微鏡在掃描過程中探針與樣品表面輕輕接觸，懸臂受存在于兩者間的排斥力作用隨樣品表面起伏發(fā)生高頻振顫。由于探針與樣品的接觸短暫，因此它更適用于質(zhì)地脆或固定不牢的樣品 1 。 &#

3、160;  2 原子力顯微鏡的應(yīng)用    在AFM誕生最初的一段時間主要應(yīng)用于電化學、材料科學等領(lǐng)域。近些年，人們逐漸探索著運用AFM對生物樣品進行納米水平的觀測及顯微操作等。與其它顯微鏡相比，AFM的納米量級的高空間分辨率尤為突出，橫向分辨率可達0.10.2nm，縱向分辨率高達0.01nm。此外，它不但能夠?qū)ι頎顟B(tài)下的樣品成像，而且可以實時動態(tài)地研究樣品結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。故而，AFM成為納米尺度上研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)、特性和相互作用的有力手段。以下主要對這項納米技術(shù)在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域中取得了顯著的成績作一綜述。    2.1 形

4、態(tài)結(jié)構(gòu) 作為新興的形態(tài)結(jié)構(gòu)成像技術(shù)，AFM實現(xiàn)了對接近自然生理條件下生物樣品的觀察。這主要由于它具備以下幾個特點:（1）與掃描電鏡和透射電鏡這些高分辨的觀測技術(shù)相比，樣品制備過程簡便，可以不需染色、包埋、電鍍、電子束的照射等處理過程;（2）除對大氣中干燥固定后樣品的觀察外，還能對液體中樣品成像;（3）可以根據(jù)觀察者的要求，調(diào)節(jié)樣品所處的溫度、濕度、大氣、真空等觀察條件。目前，AFM已廣泛地應(yīng)用于細胞及蛋白、多糖、核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)的研究中。對一個細胞而言，AFM不但能夠提供長度、寬度、高度等形態(tài)方面的信息，還可以滿足人們對膜上的離子通道、絲狀偽足、細胞間連接等細微結(jié)構(gòu)的研究 2，3 ，甚至還

5、可清楚地觀察到膜身的骨架結(jié)構(gòu) 4 。后者對細胞表面與表面下結(jié)構(gòu)相互作用的進一步研究非常有利。Qian 5 等利用AFM對酵母的熱休克蛋白Sis1與Ssa1進行觀察，發(fā)現(xiàn)只有Ssa1的lid區(qū)一端與Sis1縮氨酸結(jié)合區(qū)作用，并且Sis1二聚體的縮氨酸結(jié)合區(qū)呈現(xiàn)較高水平的凹槽結(jié)構(gòu)，這有助于闡明蛋白相互作用機制及其在蛋白折疊、組裝、降解、轉(zhuǎn)移中的重要作用。定的生理生化反應(yīng)會引起生物樣品空間結(jié)構(gòu)的變化。利用AFM對這些變化的觀察，為細胞結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的生理意義等研究提供更多有價值的信息。例如Liu 6 等將大麥的中期染色體經(jīng)嚴格點干燥、2M NaCl處理后提取出2種非組蛋白。通過AFM在納米水平顯示提

6、取蛋白后染色體的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)處理后的染色體發(fā)生下列變化:高度降低同時表面較前粗糙。又如:Sit 7 將纖維蛋白原固定在3種不同基底表面，研究樣品發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化。由AFM的三維定量分析顯示纖維蛋白原按照mica<APTES<OTS.的順序出現(xiàn)不同程度的延長。隨著長寬的增加，高度出現(xiàn)相應(yīng)的降低。從而證實了接觸材料表面特性影響相互作用的纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)，反過來將使啟動血栓形成的這些分子的動力學發(fā)生改變。AFM能夠反復(fù)掃描同一表面區(qū)域，因此能對生理過程中動態(tài)表面變化進行實時觀察，為進一步驗證機制、假說提供一種新的實驗方法。例如Martin 8 將pegylated-polymer聚合體與

7、質(zhì)粒DNA按比例混合促使DNA濃縮，用AFM每隔5min掃描1幅圖像觀察溶液中該復(fù)合物的形態(tài)改變。圖像不僅顯示了螺旋狀濃縮體的形成過程，而且可見在濃縮體形成的早期階段桿狀與環(huán)狀濃縮體存在一種可逆的動態(tài)平衡，進而增加對DNA濃縮過程的理解。在形態(tài)結(jié)構(gòu)研究中，我們需要解決以下幾個問題:其一，盡量減少掃描樣品發(fā)生形變。由于接觸式AFM在掃描中探針與樣品持續(xù)接觸，施加約幾納牛（nN）的縱向剪切力。對于具有高粘彈性的樣品，這些力可能會導(dǎo)致它們發(fā)生形變，從而影響AFM獲得的高度數(shù)據(jù)。為此，一些學者盡量選擇力學常數(shù)較低的懸臂。在保證呈現(xiàn)穩(wěn)定圖像的前提下，降低掃描力的大小。當然隨著輕敲式AFM的問世，憑借其對

8、樣品小損傷的優(yōu)點，無疑給像DNA、蛋白、細胞膜這些軟的生物結(jié)構(gòu)研究帶來重大改進。其二，設(shè)法避免探針掃描引起樣品的移動。在成像中探針的施加力應(yīng)與樣品-底物間吸附力保持平衡。為此，一些學者采取多種措施來增大樣品-底物間相互作用。例如，接觸式AFM觀察處在空氣中的生物多聚體前，樣品先經(jīng)脫水、干燥處理;使用能與樣品經(jīng)共價或離子結(jié)合的底物，進而提高分辨率。通過溶液離子強度的靜電排斥來平衡探針-樣品的范德華力。另力，Mulle 9 等研究紫膜的嗜菌調(diào)理素結(jié)構(gòu)時，將該蛋白填塞于二維矩陣中，形成規(guī)則、有序的表面。這種方法使蛋白與底物作用力增強，同時其表面高度無大的起伏，允許使用接觸式AFM成像。該方法使處于溶

9、液中的細胞膜結(jié)構(gòu)的橫向分辨率可高達0.45nm。    2.2 力學特性 由于利用AFM可對掃描各點高度及作用力的測量，這就意味著我們不僅可以獲取生物樣品的表面形態(tài)和三維結(jié)構(gòu)，還可以得到其表面硬度、粘彈性、摩擦力等力學特性的表面圖譜 10 。例如AFM在掃描樣品時，探針尖端作用樣品可使樣品產(chǎn)生可測量的凹陷。當應(yīng)力與應(yīng)變力成線性關(guān)系時，樣品發(fā)生的變形屬彈性變化，即撤銷力時樣品可恢復(fù)原有形態(tài)。我們利用凹陷的深度數(shù)據(jù)就能夠獲取有關(guān)樣品局部的彈性信息。Alcaraz 11 等利用AFM測量支氣管上皮和肺泡上皮細胞在不同負荷力和作用頻率下的復(fù)剪切彈性系數(shù)，觀察其變化規(guī)律。在

10、樣品表面性能測量中，應(yīng)該考慮到探針可能同時會受到其他作用而影響實驗數(shù)據(jù)。在該實驗中作者就針對溶液粘性牽拉力及與樣品接觸的探針幾何形狀引起的偏差予以校正，使測量結(jié)果更準確。    2.3 分子間力 將很高的空間分辨率與敏感且準確的力學感應(yīng)性相結(jié)合，是AFM的一個極為顯著的特點。通過將探針連接在彈性系數(shù)很小的懸臂上，AFM對力的測量敏感性可達到pn水平。到目前為止，AFM已經(jīng)廣泛地運用于測量溶液中生物分子間相互作用如與生物反應(yīng)有關(guān)的水合力的研究 12 。利用這些研究結(jié)果還有助于對生物分子結(jié)構(gòu)和機械性能進行分析。例如，蛋白質(zhì)依靠多種非共價作用而保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，通過機械或

11、化學的方法將蛋白伸展后，可以利用AFM直接測量穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用力，并進一步探究這些力對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。近幾年AFM對肌蛋白titin的去折疊研究取得的顯著成果即有力地說明了這一點 13另外，AFM還能夠測量單個分子間微弱的非共價力。例如測量受體-配體的去結(jié)合力，若受體固定在基底表面的話，則將與之對應(yīng)的配體固定于探針表面，使探針功能化。隨探針-樣品的距離逐漸縮小，懸臂受探體-樣品間吸引或排斥力的作用向接近或遠離樣品的方向偏折，懸臂偏折的最大幅度反映分離緊密結(jié)合兩分子所需的力。在測量中，有可能會受到探針與表面的非特異性相互作用的干擾 14 。因此，有必要認真地選擇對照實驗包括使用未功能化探針;或

12、基底所處的溶液中利用游離的配體封閉受體;調(diào)節(jié)溶液的離子強度或pH，降低靜電力的干預(yù) 15 。除此之外，探針還有可能受溶液粘性牽拉力作用，使撤離速率減慢至記錄數(shù)據(jù)低于實際的作用力。    2.4 顯微操作 通過在納米級水平調(diào)控探針的位置和施加力，AFM可以實現(xiàn)對生物分子進行物理操作如切割生物結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移分子至特定位置。在一定的范圍調(diào)整施加力，AFM在成像的同時即可對樣品進行操作。施加力的范圍主要由懸臂的力學常數(shù)和探針粗細決定。與標準顯維切割技術(shù)相比，AFM對目標區(qū)域切割、提取等操作具有更準確的特點。1992年Hansma 16 利用AFM切割遺傳物質(zhì)DNA分子的特定位

13、置，這是人們首次使用AFM對生物分子進行的可控性納米操縱。隨后它在生物膜的切割 17 、待研究分子的分離 18 等方面也得到廣泛的應(yīng)用。 3 AFM在染色體研究方面的進展AFM的高分辨成像和簡便的樣品制備過程吸引了眾 多學者利用它對染色體結(jié)構(gòu)進行研究。但早期由于鑲嵌于30nm蛋白質(zhì)層的RNA吸附在染色體的表面 19 ，同時鹽、細胞殘渣等隨同染色體滴片時吸附于玻片上 20 ，妨礙染色體表面更細微的結(jié)構(gòu)成像。近來隨著染色體制備方法的改善和AFM成像技術(shù)的提高，該方面的研究得到進一步的發(fā)展。染色體經(jīng)胃蛋白酶、RNA酶依次作用后，置于溶液中觀察，不僅去除了表面的蛋白質(zhì)層，而且再次水化后染色體體積增大5

14、7倍，能夠分辨出樣品表面的染色質(zhì)纖維所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu) 19 。最近利用該方法使染色體成像橫向和縱向分辨率分別可達到1nm、0.1nm，并且發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)纖維是由放射狀排列染色質(zhì)環(huán)與盤繞的螺旋管狀結(jié)構(gòu)共同組成 21 。在G、C分帶中期染色體的三維結(jié)構(gòu)觀察 7 ，染色單體型畸變識別 8 ，核型分析等方面研究的應(yīng)用證實了與光學顯微鏡、掃描及透射電鏡等成像工具相比AFM具備獨特的優(yōu)勢:它不僅能夠識別染色體畸變，同時可以對結(jié)構(gòu)變化進行細微的觀察。除正常染色體的結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)的研究，AFM還對G分帶染色體形態(tài)發(fā)生的一系列變化進行觀察。研究發(fā)現(xiàn)隨胰蛋白酶作用時間的延長，染色體除周邊之外的其余結(jié)構(gòu)將逐漸發(fā)生崩解

15、22 。中期染色體經(jīng)G、C分帶會出現(xiàn)縱向高度的差異 23，24 ，各條帶中染色質(zhì)纖維排列的松緊度也有所不同 25 。這些都有助于染色體分帶機制的闡明。對重離子射線誘發(fā)染色體畸變分析發(fā)現(xiàn)AFM不但識別出染色單體裂隙和單體斷裂，還清楚觀察到單體型畸變的斷裂點纖維狀結(jié)構(gòu) 26 。這證實了AFM是輻射誘發(fā)染色體畸變的結(jié)構(gòu)研究中十分有用的工具?？梢?，AFM已在染色體結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)等方面研究獲得很大的進展。另外，作為一種納米操縱工具，AFM還被用于納米切割染色體，提取DNA制作FISH實驗的探針等 27 。在亞細胞水平結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)上，發(fā)揮AFM連接亞細胞結(jié)構(gòu)、分子水平研究的橋梁作用，它有可能在基因定位和

16、功能研究等方面得到進一步的應(yīng)用與發(fā)展。綜上，憑借它對染色體納米量極的成像和顯微操縱，AFM有希望成為結(jié)合細胞遺傳學和分子遺傳學的有力工具。    4 展望    1986年，AFM作為一種新的成像技術(shù)被研制成功。在之后短短的十余年里它由原有的納米水平單分子成像，逐漸擴展到表面功能的研究，分子間力的測量，可控性分子操作等多個領(lǐng)域。當然，不容忽視，在上述的AFM多種應(yīng)用中仍存在一些有待進一步完善、解決的問題，也就是說，作為一個新興的研究工具，它同樣也存在著自身的不足。除了在實驗中不斷地分析、探求更好的解決方法之外，我們更應(yīng)該將AFM與其他

17、成像工具相結(jié)合，取長補短，以便能夠更大程度地挖掘其內(nèi)在潛力，使AFM在生物醫(yī)學研究中做出更大的貢獻。相信隨著這項多功能技術(shù)的相關(guān)工作的不斷發(fā)展，它會為形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面功能、相互作用力等方面研究提供更多、更重要的新發(fā)現(xiàn)。    參考文獻    1 Moller C，Allen M，Elings V，Engel A，et al.Tapping-mode atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces.Biophys J，

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