western轉(zhuǎn)膜條件

1、western轉(zhuǎn)膜條件蛋白來源：RAW264.7 總蛋白蛋白名稱可保密：一些轉(zhuǎn)錄因子蛋白分子量：4070 KDWB用膜類型、孔徑：0.45 NC轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒流400 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：6090 minPS.其實(shí)吧，以我的經(jīng)驗(yàn)來看，除非目的蛋白特別小，或者特別大，不然轉(zhuǎn)膜時(shí)間真的不是那么重要， 曾經(jīng)因?yàn)槭д`，轉(zhuǎn)了15 min就拆下來了，但從麗春紅染色來看，跟平常實(shí)驗(yàn)也沒有太大的區(qū)別。蛋白來源：內(nèi)皮細(xì)胞 總蛋白蛋白名稱可保密：occludin & AKT蛋白分子量：65 KD & 56 KDWB用膜類型、孔徑：0.45 PVDF轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒壓

2、100 V轉(zhuǎn)膜時(shí)間：6070 min設(shè)備名字是“Bio-Rad mini。 蛋白來源：乳鼠心肌細(xì)胞和成年鼠心肌組織 總蛋白和核蛋白蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KDWB用膜類型、孔徑：PVDF預(yù)先用甲醇處理轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：半干轉(zhuǎn) 恒壓 12 V轉(zhuǎn)膜時(shí)間：30-40 min設(shè)備：“Bio-Rad mini建議：最開始做過濕轉(zhuǎn)過夜的那種，太費(fèi)事費(fèi)時(shí)，效果也不如半干轉(zhuǎn)。 蛋白來源：293T細(xì)胞蛋白名稱可保密：蛋白分子量：95 KD & 35 KDWB用膜類型、孔徑：PVDF轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒壓 90 V-110 V，控制電流不

3、要超過300 mA。轉(zhuǎn)膜時(shí)間：70 min 蛋白來源：腫瘤手術(shù)標(biāo)本蛋白名稱可保密：轉(zhuǎn)錄因子蛋白分子量：33 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：350 mA 恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：150 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad說明：相同條件曾用于數(shù)個(gè)30-70 KDa的蛋白，都能成功轉(zhuǎn)上，不過沒有試縮短時(shí)間效果如何； 實(shí)驗(yàn)時(shí)沒為轉(zhuǎn)膜條件苦惱，倒是電泳時(shí)膠的濃度及時(shí)間根據(jù)不同分子量而有區(qū)別。蛋白來源：成纖維細(xì)胞蛋白名稱可保密：smad3蛋白分子量：54 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：350 mA 恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：150 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn)

4、Bio-Rad 蛋白來源：胰腺癌細(xì)胞蛋白名稱可保密：蛋白分子量：16 KDa and 42 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：120 V 恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：90 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad蛋白來源：大鼠血管平滑肌細(xì)胞蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：72 KD，42 KD 和22 KDWB用膜類型、孔徑：一般的PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn)，恒流一張膜0.26 A，兩張膜0.3 A。轉(zhuǎn)膜時(shí)間：90 min設(shè)備：“Bio-Rad mini建議：轉(zhuǎn)膜緩沖液最多用3次，最好現(xiàn)用現(xiàn)配，我們用的沒有加SDS，轉(zhuǎn)的時(shí)候最好能用冰塊一類的東西降一下溫，這樣轉(zhuǎn)的效果要好

5、一些，轉(zhuǎn)的時(shí)候一定要把三明治每層之間的氣泡除去，同時(shí)使濾紙大于膜，膜大于膠，以免燒壞電極。 蛋白來源：大鼠PBMC蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：55 KDWB用膜類型、孔徑：0.22的PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒流：濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60-90 min設(shè)備：“Bio-Rad mini建議：轉(zhuǎn)膜液用過兩三次之后轉(zhuǎn)膜效果就很差了 其它按照常規(guī)就好了  其實(shí)0.22的膜一般不怕轉(zhuǎn)過頭 以我們的經(jīng)驗(yàn)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間、電壓其實(shí) 也有很大范圍的調(diào)整 ，并不是非要固定于哪一個(gè)最適宜，曾經(jīng)做過  一張膜轉(zhuǎn)，17 KD的和170 KD的，按照170 KD的條件，17

6、KD的轉(zhuǎn)膜也很好的。蛋白來源：人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：大于250 kDWB用膜類型、孔徑：millipore PVDF膜 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn)，恒流0.3A。轉(zhuǎn)膜時(shí)間：180min設(shè)備：“Bio-Rad 建議：電轉(zhuǎn)保持電壓在70 V以上，保持低溫，如果電壓低過70就需要換緩沖液了。蛋白來源：白血病細(xì)胞蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：28 KDWB用膜類型、孔徑：0.45的NC膜轉(zhuǎn)膜方式恒流：濕轉(zhuǎn)，90 min，0.25 A設(shè)備：“Bio-Rad 建議：海綿厚度要適宜，一次轉(zhuǎn)磨用的海綿太薄，導(dǎo)致三明治沒夾緊，轉(zhuǎn)膜后拿出來一看，marker都變得七扭八

7、歪。但是有前輩說墊的海綿太厚可能將膠壓斷，沒經(jīng)歷過，不知道是不是會(huì)有這種情況。 蛋白來源：腫瘤細(xì)胞蛋白名稱可保密：磷酸化蛋白蛋白分子量：10-200 KDaWB用膜類型、孔徑：millipore PVDF膜 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：120 v 恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：120 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad建議：轉(zhuǎn)膜緩沖液只用2次，根本都轉(zhuǎn)上，5%BSA封閉，減少背景。 蛋白來源：胰腺細(xì)胞蛋白名稱可保密：*蛋白分子量：90-130 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：250 mA 恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：150 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) 蛋白來源：原核表

8、達(dá)蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：38 KDWB用膜類型、孔徑：0.45 NC轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒壓：100 V轉(zhuǎn)膜時(shí)間：120 min 蛋白來源：心臟蛋白名稱可保密：蛋白分子量：220 kDa，130 kDa，70 kDa，41kDaWB用膜類型、孔徑：PVDF轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：70 v120 min，180 min，5-6 h轉(zhuǎn)膜設(shè)備：伯樂濕轉(zhuǎn)建議改良方向可選：40 kDa一下，70 v ，60-90 min足夠，40-70 kDa 90-120 min即可。70-120 kDa ，70 v，120-180 min足夠，120-180 kDa ，180-2

9、40 min，180 kDa以上建議6 h。 蛋白來源：卵巢癌細(xì)胞膜蛋白蛋白名稱可保密：蛋白分子量：53 KDWB用膜類型、孔徑：PVDF膜 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：80 V 100 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad 蛋白來源：人宮頸癌HELA細(xì)胞總蛋白蛋白名稱可保密：-actin蛋白分子量：42WB用膜類型、孔徑：PVDF膜 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：50 4 h轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad  蛋白來源：腦組織蛋白名稱可保密：蛋白分子量：16 KD、27 KD、32 KD、42 KDWB用膜類型、孔徑

10、：PVDF 0.22 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：半干轉(zhuǎn) 恒流 1 mA/cm2或2 mA/cm2轉(zhuǎn)膜時(shí)間：不定轉(zhuǎn)膜設(shè)備：北京六一儀器建議：我共做了六個(gè)蛋白，所以總在想節(jié)約時(shí)間的方式。在 預(yù)試時(shí)我會(huì)觀察電壓數(shù)與轉(zhuǎn)膜效率的關(guān)系，所以我不會(huì)按時(shí)間來定何時(shí)轉(zhuǎn)完，而是按電壓來定。通過染膠來確定電壓數(shù)與轉(zhuǎn)移蛋白分子量上限的關(guān)系。這樣有的5分 鐘就轉(zhuǎn)完了，不用多浪費(fèi)時(shí)間。并且六一的半干轉(zhuǎn)膜儀隨著使用次數(shù)的增多，效率也會(huì)下降，所以時(shí)間和轉(zhuǎn)膜效率尤其是使用后期的關(guān)系并不穩(wěn)定，單純依靠時(shí) 間有時(shí)會(huì)有問題。 蛋白來源：CHO cell蛋白名稱可保密：酶原蛋白分子量：40 KDWB用膜類型、孔徑：0.22的P

11、VDF膜Biorad轉(zhuǎn)膜方式恒壓：100 V，濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 min。設(shè)備：Tanon上海天能建議：1.  轉(zhuǎn)膜液現(xiàn)用現(xiàn)配，用完倒掉。2.  轉(zhuǎn)膜時(shí)間，電壓可以適當(dāng)調(diào)整。分子量大或者小一些的蛋白，采用此條件一樣轉(zhuǎn)膜效率很高。 蛋白來源：Hepg2蛋白名稱可保密：EGFR蛋白分子量：170kdWB用膜類型、孔徑：pvdf 0.45轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：24V轉(zhuǎn)膜時(shí)間：2個(gè)半小時(shí)轉(zhuǎn)膜設(shè)備：伯樂半干轉(zhuǎn)  蛋白來源：肝癌細(xì)胞蛋白名稱：HIF-1蛋白分子量：120 kDWB用膜類型、孔徑：NC膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓：80伏，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜時(shí)間：150分鐘設(shè)備：“B

12、io-Rad mini建 議：濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜液特別重要，否那么會(huì)導(dǎo)致電壓或者電流不穩(wěn)影響轉(zhuǎn)膜條帶。轉(zhuǎn)膜均現(xiàn)配先用，不重復(fù)利用。轉(zhuǎn)膜時(shí)間一般是150分鐘，80伏恒壓。經(jīng)李春紅染 色，靠近蛋白膠的一側(cè)膜上蛋白染色深，膜另外一面染色淺，說明蛋白未轉(zhuǎn)過。該濕轉(zhuǎn)條件自己做過的蛋白分子量范圍：170-36 kD。 蛋白來源：心肌細(xì)胞總和膜蛋白名稱可保密：蛋白分子量：128 KD，100，60，55，43 KDWB用膜類型、孔徑：NC膜 0.2 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：70 V 200 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad建 議：轉(zhuǎn)膜液最好現(xiàn)配現(xiàn)現(xiàn)用，或配成母液，最好不重復(fù)使用，70 V

13、電壓下，電流約154 mA。甲醇可以加到150 ml。對(duì)大分子量如200 KD轉(zhuǎn)膜時(shí)間延長(zhǎng)6-8 h。蛋白來源：肺臟蛋白名稱可保密：ICAM-1蛋白分子量：85110 KDWB用膜類型、孔徑：0.22NC轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒流 300 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：120 min設(shè)備名字 Bio-Rad mini一抗用的santa cruz 1 mL包裝的。 比例調(diào)整到1：800做出很好的條帶。 效價(jià)會(huì)一直降低的。去年做的這個(gè)指標(biāo)，今年夏天做就不行了。 蛋白來源：成纖維細(xì)胞蛋白名稱可保密：蛋白分子量：16 KDaWB用膜類型、孔徑：0.2 um PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：0.2

14、 A恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：65 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad 蛋白來源：成纖維細(xì)胞蛋白名稱可保密：蛋白分子量：28 KDaWB用膜類型、孔徑：0.2 umPVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：0.25 A恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad 蛋白來源：人腫瘤細(xì)胞蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：80 KDWB用膜類型、孔徑：0.45 um PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)恒流，勿超過0.85 mA/cm2，同時(shí)轉(zhuǎn)多張膜電流需累加串聯(lián)轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60-90 min設(shè)備：Bio-Rad其實(shí)有些東西并不是非常嚴(yán)格的，要轉(zhuǎn)移的目的蛋白分子量小，那么轉(zhuǎn)移的時(shí)間就短一

15、些，反之，那么長(zhǎng)一點(diǎn)；蛋白量充足，可以多轉(zhuǎn)一會(huì)，蛋白量較少，那么要少轉(zhuǎn)一下，免得蛋白穿膜而過到了濾紙上而前功盡棄。 蛋白來源：人和鼠肝癌細(xì)胞總蛋白、胞漿、胞核蛋白蛋白名稱可保密：*蛋白分子量：17-116 kdWB用膜類型、孔徑：PVDF膜 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒流 200 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：3 h轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) 北京六一 24D mini 蛋白來源：CO COS7 293T蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：80 72 56 52 48 25 18KDWB用膜類型、孔徑：0.45 um PVDF膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 90 V 電流約為230-280 mA之間。

16、兩張膜串聯(lián)疊加。轉(zhuǎn)膜時(shí)間：40 min設(shè)備：Bio-Rad 法碼西亞 蛋白來源：人腫瘤細(xì)胞蛋白名稱可保密：磷酸化蛋白蛋白分子量：30-60 KDaWB用膜類型、孔徑：pall NC膜 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60-90 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 北京六一 半干轉(zhuǎn)建議：轉(zhuǎn)膜緩沖液用新鮮配制的，可先配成2倍的母液，轉(zhuǎn)膜液的多少會(huì)影響電轉(zhuǎn)的效率，一般將吸水紙潤(rùn)濕即可，不要和膜一起浸泡，這樣效果很好。 蛋白來源：人肝癌腫瘤細(xì)胞蛋白名稱可保密：notch蛋白分子量：60-120 KDaWB用膜類型、孔徑：pall NC膜 0.45 um

17、轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒流 0.3 A轉(zhuǎn)膜時(shí)間：-20度冰柜120 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 濕轉(zhuǎn) Bio-Rad建議：轉(zhuǎn)膜緩沖液用新鮮配制的，可先配成10倍或5倍的母液，保持低溫是轉(zhuǎn)膜效果的一個(gè)保證，這樣效果很好。 蛋白來源：膠質(zhì)瘤細(xì)胞總蛋白和核蛋白蛋白名稱可保密：蛋白分子量：18 KDa 、36 KDa、55 KDa、98 KDaWB用膜類型、孔徑：NC膜 PALL轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：0.35 恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad mini轉(zhuǎn)緩液的配制有點(diǎn)講究。如果蛋白大于一百多，一般參加SDS，時(shí)間延長(zhǎng)結(jié)果會(huì)更好些。由于，目前試驗(yàn)的蛋白就都不大，所以，我們都采用不加S

18、DS的轉(zhuǎn)緩液，跑出來的條帶也很整齊、干凈。 蛋白來源大腸癌205蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：92 kd，43 kdWB用膜類型、孔徑：0.45pvdf轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：90 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn)，天能。 蛋白來源：大鼠腦組織蛋白名稱可保密：BDNF28 KDa、Bactin42 KDa、LaminB72 KDa，以及磷酸化蛋白保密 43 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF0.45膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad Mini轉(zhuǎn)膜緩沖液：25甲醛 覺得這個(gè)濃度的甲醛可以有效降低電轉(zhuǎn)的熱量，而且使膜對(duì)蛋

19、白的吸附效果較好，Marker轉(zhuǎn)到膜上很鮮艷。 用立春紅染色效果也很好。  蛋白來源：表達(dá)產(chǎn)物蛋白名稱可保密：蛋白分子量：29 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：0.3 A 恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：80 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 濕轉(zhuǎn) Bio-Rad 蛋白來源：cell lysate, culture medium蛋白名稱可保密：蛋白分子量：15-50 kDWB用膜類型、孔徑：NC，PVDF， 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓， semi-dry轉(zhuǎn)膜時(shí)間：about 2h is ok if the protein is small and the volt

20、age can keep 100 V， if not increase to 3-4 h。轉(zhuǎn)膜設(shè)備： Bio-Rad 蛋白來源：肺臟、肝臟等。蛋白名稱可保密：actin蛋白分子量：43 kDWB用膜類型、孔徑：NC膜PALL 0.22 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒流 200 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：4560 min設(shè)備名字 Bio-Rad mini用的santa cruz 分裝和整裝的都可以。效價(jià)一般1：1000-1：3000左右，可穩(wěn)定較長(zhǎng)一段時(shí)間。 蛋白來源肺臟蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：19 kd,35 kdWB用膜類型、孔徑：0.2pvdf轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒流25

21、0轉(zhuǎn)膜時(shí)間：150 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad mini 蛋白來源：大鼠血管蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：140 kdWB用膜類型、孔徑：0.45pvdf轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒流，200 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：210 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備:濕轉(zhuǎn),北京六一 蛋白來源：心肌蛋白名稱可保密：蛋白分子量：90 kDa，70 kDa,12.6 kDaWB用膜類型、孔徑：NC轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：70 v 240 min，120 min，60 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：伯樂濕轉(zhuǎn) 蛋白來源：腦蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：16 KD 60 KDWB用膜類型、孔徑：16的用0.

22、22的PVDF，60的用0.45的NC轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：20 V轉(zhuǎn)膜時(shí)間：16的30 min，60的90 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：Bio-Rad 半干 蛋白來源：子宮內(nèi)膜癌組織蛋白名稱可保密：蛋白分子量：156.8WB用膜類型、孔徑：NC膜轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒流400mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：90 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad 蛋白來源：真核表達(dá)蛋白名稱可保密：多種，30個(gè)以上蛋白分子量：40-200 kDWB用膜類型、孔徑：PVDF轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓100 V電流在280 mA至350 mA之間轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 minM<100kD,60-100min (100kD&l

23、t;M<200kD)轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) 蛋白來源：大鼠腎臟蛋白名稱可保密：保密蛋白分子量：130 kDWB用膜類型、孔徑：0.45NC膜 PALL轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒流 350 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：120min設(shè)備名字 Bio-Rad mini一抗用的sigma 羊抗大鼠，0.2 mL包裝的，打折后價(jià)格3000多，有些貴哦。比例調(diào)整到1：1500左右條帶可，用BSA封閉。但是背景稍高。 蛋白來源：腦組織蛋白名稱可保密：蛋白分子量：38 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜，轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：80 v恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間：180 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad mini&

24、#160; 蛋白來源：真核表達(dá)蛋白名稱可保密：蛋白分子量：約35 kD雙亞基WB用膜類型、孔徑：0.22 um PVDF轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒流200 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn)Bio-rad,天能，六一轉(zhuǎn)膜時(shí)間其實(shí)不需要那么長(zhǎng)的，轉(zhuǎn)膜沒轉(zhuǎn)上一般原因不在這里，可能是轉(zhuǎn)膜液的原因：有些蛋白SDS可能影響其與膜的結(jié)合，復(fù)原型電泳因巰基乙醇的原因也可能導(dǎo)致后面的抗體不結(jié)合這是我最近的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，還有一抗的選擇很重要，一定要選識(shí)別線性表位的抗體，才能用于做WB。 蛋白來源：細(xì)菌蛋白蛋白名稱可保密：全部的可溶性蛋白蛋白分子量：11-170 KDWB用膜類型、孔徑：0.45

25、 NC轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒流300 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間：80 min 蛋白來源： 骨肉瘤細(xì)胞蛋白名稱可保密：蛋白分子量： 72 kDaWB用膜類型、孔徑： PVDF膜(0.45 um)轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流： 半干轉(zhuǎn) 恒流200 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間： 20-30 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：Bio-Rad 型號(hào)忘了，就是有4個(gè)插孔的電泳儀。建議改良方向：低溫很重要，新鮮的電轉(zhuǎn)液也很重要。蛋白來源：骨肉瘤CELL LINE蛋白名稱可保密：Beta actin蛋白分子量：42 kDaWB用膜類型、孔徑：Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)

26、轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn)，恒壓22 v轉(zhuǎn)膜時(shí)間：90 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：X-cell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen)建議改良方向：轉(zhuǎn)膜過程冰水浴，保持低溫，Transfer Buffer重復(fù)使用。  蛋白來源：腎瘤細(xì)胞蛋白分子量：39 kDaWB用膜類型、孔徑：Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒壓100 v轉(zhuǎn)膜時(shí)間：50 min 蛋白來源：MCF7蛋白名稱可保密：蛋白分子量：70 kDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜GE轉(zhuǎn)膜方式恒壓、

27、恒流：濕轉(zhuǎn) 100伏轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：伯樂小轉(zhuǎn)膜儀 蛋白來源：pichia 分泌表達(dá)蛋白名稱可保密：細(xì)胞因子等蛋白分子量：17到30 kDaWB用膜類型、孔徑：millipore PVDF 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn) 恒壓：100 V轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 min這個(gè)條件除了100 KDa的預(yù)染maker轉(zhuǎn)的不好，剩下的條帶都非常清晰。正向前面ycwzq說的，感覺時(shí)間不是很重要，只要蛋白別太小或太大，在一個(gè)比擬寬的時(shí)間和電壓范圍都能轉(zhuǎn)上。當(dāng)然這些還有一個(gè)重要的影響因素就是所用的蛋白轉(zhuǎn)印緩沖液。  所以建議把自己用的轉(zhuǎn)印緩沖液的配方也貼上，便于分析

28、交流。我先說我的吧，是大師兄師姐的配方，我用了感覺還不錯(cuò)，但是100 KDa以上的轉(zhuǎn)的不好。蛋白轉(zhuǎn)印緩沖液pH8.2:Tris堿1.93 g，甘氨酸9 g，甲醇200 ml，加水定容至1000 ml。 蛋白來源： 大鼠坐骨神經(jīng)蛋白名稱可保密：蛋白分子量： 30 kDaWB用膜類型、孔徑： PVDF膜(0.2 um)轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流： 濕轉(zhuǎn) 恒流300 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間： 45 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備: Bio-Rad 蛋白來源：小鼠胚胎成纖維蛋白名稱可保密：蛋白分子量：36 KDa、55 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜 0.45轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：0.3 A 恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60

29、 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 濕轉(zhuǎn) Bio-Rad mini墊子變薄時(shí)，可用三層纖維墊，也沒問題。 蛋白來源：小鼠前列腺癌細(xì)胞蛋白名稱可保密：P53 P21 RAD51 GAPDH蛋白分子量：53 KDa、21 KDa、37 KDa、36 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜 0.45轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓110 v轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 濕轉(zhuǎn) Bio-Rad mini 蛋白來源：HEK293總蛋白蛋白名稱可保密：*蛋白分子量：200KDWB用膜類型、孔徑：PVDF膜 0.2 um (用甲醇預(yù)先處理)轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓 25 V轉(zhuǎn)膜時(shí)間：過夜 (16-20 hour

30、s)轉(zhuǎn)膜設(shè)備:biorad mini 蛋白來源：人前列腺癌細(xì)胞蛋白名稱可保密：*蛋白分子量：40 KDWB 用膜類型、孔徑：PVDF膜 0.45 um (用甲醇預(yù)先處理)轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓 20 V， 限制最高電流0.3 A。轉(zhuǎn)膜時(shí)間：過夜 (16-20hours)轉(zhuǎn)膜設(shè)備：biorad semi-dry 蛋白來源：組織蛋白名稱可保密蛋白分子量：42 KDaWB用膜類型、孔徑：PVDF膜0.22轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：350 mA 恒流轉(zhuǎn)膜時(shí)間：60-90 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad 蛋白來源：E.Coli BL21蛋白名稱可保密：蛋白分子量：4 kd

31、WB用膜類型、孔徑：PVDF 0.22 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓15 v轉(zhuǎn)膜時(shí)間：O/N轉(zhuǎn)膜設(shè)備: Bio-Rad Mini 濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜液的配制：for 1 L transfer buffer， 200 ml Methanol，14.4 g Glycine，3.03 g Trizma-base。用了Trcine-gel SDS Page，效果不錯(cuò) 蛋白來源：腎臟蛋白名稱可保密：蛋白分子量：23 kdWB用膜類型、孔徑：PVDF 0.45 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓20 v轉(zhuǎn)膜時(shí)間：35 mins轉(zhuǎn)膜設(shè)備: Bio-Rad 半干 蛋白來源： 來自MDCK增殖的流感病毒裂解

32、物蛋白名稱可保密：PB1蛋白分子量： 96 kd 注意，10% SDS-PAGE，冰上電泳。用預(yù)染marker觀察100kd的條帶跑到膠的正中間位置時(shí)，才開始轉(zhuǎn)膜，否那么轉(zhuǎn)膜效率降低WB用膜類型、孔徑： NC膜， 0.45轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓，100V轉(zhuǎn)膜時(shí)間： 2 hours轉(zhuǎn)膜設(shè)備: BIO-rad 轉(zhuǎn)膜設(shè)備。其間，準(zhǔn)備一個(gè)冰盒，將電泳槽半埋到冰里。轉(zhuǎn)膜液的配制：如甲醇的比例和是否加SDS以及多大質(zhì)量濃度等： 2.9 g甘氨酸，5.8 g tris，0.37 g SDS，200 ml甲醇。 蛋白來源：腎臟蛋白名稱可保密：蛋白分子量：9 kdWB用膜類型、孔徑：PVDF 0.22 um轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：恒壓20 v轉(zhuǎn)膜時(shí)間：30 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備: Bio-Rad 半干 蛋白來源： 軟骨細(xì)胞蛋白名稱可保密：b-actin蛋白分子量： 43 kdWB用膜類型、孔徑： PVDF膜， 0.45轉(zhuǎn)膜方式恒壓、恒流：濕轉(zhuǎn)，恒流，350 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間： 85 min轉(zhuǎn)膜設(shè)備: BIO-rad 轉(zhuǎn)膜設(shè)備。其間，準(zhǔn)備一個(gè)冰盒，將電泳槽半埋到冰里。轉(zhuǎn)膜