L-纈氨酸的柱前衍生HPLC分析方法研究

1、L-纈氨酸的柱前衍生HPLC分析方法研究L-纈氨酸的柱前衍生HPLC分析方法討論2457202136-0090-002DOI：10.19694/ki.issn2095-2457.2021.36.0410 引言L-纈氨酸L-val和L-異亮氨酸，L-亮氨酸統(tǒng)稱為支鏈氨基酸，目前氨基酸的分析方法有分光光度法、色譜法和電化學法等。其中，分光光度法一般適合于檢測在紫外區(qū)有汲取的氨基酸，電化學法僅可檢測具有電活性的氨基酸。色譜法有離子色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和毛細管電泳法等，其中離子色譜法和高效液相色譜法是應(yīng)用最多的方法1。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，可以分為直接分析、柱前衍生化、柱后

2、衍生化等種類。與其他兩種方法相比，柱前衍生化具有所用設(shè)備簡潔，方法通用性、穩(wěn)定性好等特點，已經(jīng)得到較大的進展2。衍生化是一種利用化學變換把化合物轉(zhuǎn)化成類似化學結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。本文探討了L-纈氨酸的柱前衍生HPLC分析過程，以獲得穩(wěn)定可靠的分析方法。1 試驗方案1.1 溶液配制精確稱取0.5g2，4-二硝基氟苯DNFB，用乙醇定容至100mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。衍生化緩沖溶液的配制;精確稱取4.2g碳酸氫鈉加入至100mL容量瓶中，用高純水定容并搖勻備用。定容緩沖溶液的配制;精確稱取3.4g磷酸二氫鉀，加高純水溶解，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶，加145.5mL0.1moL/L氫氧化鈉混合，用高純水定容至刻度。流

3、淌相A的配制;乙腈。流淌相B的配制：精確稱取4.1g醋酸鈉，加約900mL高純水溶解，用醋酸調(diào)整pH至6.4，加N，N-二甲基甲酰胺10mL，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用高純水定容至刻度。L-纈氨酸樣品溶液的配制已知在生產(chǎn)L-纈氨酸過程中會產(chǎn)生的雜氨酸有丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，其中亮氨酸和異亮氨酸最難分別，只要最難分別對到達分別，就可視為全部物質(zhì)已經(jīng)分別。稱取L-纈氨酸，丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸標樣各50mg，混合溶解，用高純水定容至25mL。1.2 流淌相梯度條件的選擇設(shè)初始梯度為0min 流淌相A：B=5：95，30min結(jié)束梯度為流淌相A：B=95：5，做杰出譜圖，再將難分別的峰的洗

4、脫時間延長，反復測定，找出最正確梯度。色譜柱：THERMO C18柱;柱溫：35;進樣量：20L;流淌相流速：1.0mL/min檢測波長：UV360nm1.2.1 衍生化條件的選擇取5個棕色容量瓶，分別加入0.15mL的L-纈氨酸樣品溶液，1mL緩沖溶液，搖勻后再加入1mL衍生試劑，搖勻，將容量瓶置于40水浴中暗處恒溫加熱，分別在15min，30min，45min，60min，75min時取出1個容量瓶，放置10min待溶液冷至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始進行色譜分別。1.2.2 周密度試驗取5個棕色容量瓶，加入1.5mLL-纈氨酸樣品溶液，1mL緩沖溶液，搖勻后加

5、入1mL衍生化試劑，搖勻，將容量瓶置于50水浴中暗處恒溫加熱，在30min后取出，放置待溶液冷卻至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始按3.3.4色譜條件進行色譜分別。1.2.3 加標回收試驗稱取L-纈氨酸標樣，丙氨酸標樣，亮氨酸標樣，異亮氨酸標樣各10mg，混合溶解，用高純水定容至10mL，取5個棕色容量瓶，加入1.5mLL-纈氨酸樣品溶液，再分別加入0.05mL，0.1mL，0.15mL，0.2mL，0.25mL混合標液，1mL緩沖溶液，搖勻后加入1mL衍生化試劑，搖勻，將容量瓶置于50水浴中暗處恒溫加熱，在30min后取出，放置待溶液冷卻至室溫后，加入定容緩沖液至刻度

6、并搖勻，放置15min后開始按3.3.4色譜條件進行色譜分別。2 結(jié)果與商量2.1 流淌相梯度條件的選擇對比甲醇與乙腈的分別效果，甲醇得到的峰型較差，部分組分沒有完全分別，乙腈分別效果稍好，各峰基線分別效果好。由于L-纈氨酸樣品中雜氨酸較多，氨基酸的極性不同，用同一梯度分別多種氨基酸，保存時間相差很大，導致分析時間過長，要同時分析幾種氨基酸的含量，需要進行梯度洗脫，在保證分別效果的狀況下進行梯度洗脫削減分析時間。梯度洗脫又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析周期中，按肯定程度不斷轉(zhuǎn)變流淌相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個冗雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適合的容量因子k到達良好的分

7、別目的。流淌相由幾種不同極性的溶劑組成，通過轉(zhuǎn)變流淌相中各溶劑組成的比例轉(zhuǎn)變流淌相的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品種的全部組分可在最短時間內(nèi)實現(xiàn)最正確分別。圖1 梯度洗脫示意圖第一次對所測物質(zhì)進行梯度設(shè)計時，由于不知道各個物質(zhì)洗脫時流淌相的比例，可以在一段時間內(nèi)流淌相中有機相由低比例升到高比例進行洗脫，然后再對有重峰，出現(xiàn)拖尾，分析時間過長等問題進行解決，逐步優(yōu)化，最終確定流淌相的梯度。通過試驗可以看出，丙氨酸，L-纈氨酸的峰能夠很好的分別，且峰型尖銳，但亮氨酸和異亮氨酸色譜峰重疊，不能實現(xiàn)有效分別，且它們的保存時間較長，需增加這一梯度的洗脫時間，另外10min前沒有出峰

8、，25min后不再出峰，可以將這兩段的時間縮短。 通過試驗可看出，亮氨酸和異亮氨酸基本分別，但保存時間在12min到20min之間沒有物質(zhì)出峰，可以削減這一段分析時間，以提高分析效率。通過試驗可看出，各個物質(zhì)分別效果好，峰型尖銳，對稱性良好，且分析時間較短，分析效率較高。因此HPLC確定的色譜條件為：色譜柱：THERMO C18柱250×4.6mm，5m;柱溫：35;進樣量：20L;流淌相流速：1.0mL/min;檢測波長：UV360nm。2.2 衍生化條件的選擇高效液相色譜的化學衍生法是指在肯定條件下利用某種試劑通稱化學衍生試劑或標記試劑與樣品組份進行化學反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物有利于色譜

9、檢測或分別。本試驗接受柱前衍生化進行L-纈氨酸的分析討論，具體方案：取5個棕色容量瓶，分別加入0.15mL的L-纈氨酸樣品溶液，1mL緩沖溶液，搖勻后再加入1mL衍生試劑，搖勻，將容量瓶置于40水浴中暗處恒溫加熱，分別在15min，30min，45min，60min，75min時取出1個容量瓶，放置10min待溶液冷至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始進行色譜分別。用此方法測定50，60，70時的峰面積。以衍生化時間為橫坐標，峰面積為縱坐標，做出各個氨基酸在各溫度下的折線圖，找出最正確衍生化溫度和衍生化時間。從上述圖中可以看出，一開始衍生化產(chǎn)率較低，隨著衍生化時間的增加，

10、衍生化產(chǎn)率升高，峰面積先上升再趨于穩(wěn)定，最正確衍生化時間為30min;隨著溫度的升高，峰面積先增大，隨著溫度的上升，衍生物穩(wěn)定性較差，峰面積略有下降，最正確衍生化溫度為50，所以衍生化溫度為50，衍生化時間為30min時各個氨基酸的峰面積到達最大值，檢測效果最好。因此，確定衍生化條件為：取0.15mL氨基酸樣品于10mL棕色容量瓶中，加入配制好的衍生化緩沖液1mL，搖勻后再加入衍生化試劑1mL，搖勻，將容量瓶置于50水浴中暗處加熱30min后取出，放置待溶液冷卻至室溫后，加入定容緩沖液至刻度并搖勻，放置15min后開始進行色譜分別。3 結(jié)語本試驗接受的是高效液相色譜儀，HPLC法具有方法敏捷多

11、樣、靈敏度高、分析時間較短等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域氨基酸的檢測。用柱前衍生化HPLC法測定發(fā)酵液中L-纈氨酸的含量敏捷多樣靈敏度高、分析時間段、周密度高。接受C18柱，梯度洗脫的分別模式，UV檢測，經(jīng)衍生化試劑衍生化進行檢測。用DNFB作為衍生化試劑，價格低，衍生物穩(wěn)定，適合于定量測定。試驗系統(tǒng)的考察了流淌相條件，衍生化條件，線性關(guān)系，周密度以及加標回收等。最正確試驗條件為：色譜柱：THERMO C18柱 250×4.6mm，5m，柱溫：35，進樣量：20L，流淌相流速：1.0mL/min，檢測波長：UV360nm，流淌相梯度條件：25%A+75%B0min，40%A+60%B10min，40%A