放射損傷對外源骨髓間充質干細胞遷徙定植的影響

1、放射損傷對外源骨髓間充質干細胞遷徙定植的影響【摘要】研究機體中樞神經系統(tǒng)受放射損傷時骨髓間充質干細胞（）的遷徙定植特性的改變，從而為應用治療中樞神經系統(tǒng)放射損傷提供理論和實驗依據?！痉椒ā坑弥荦g大鼠接受線照射制作樞神經系統(tǒng)放射損傷模型；從鼠抽取骨髓，分離和擴增。中樞神經系統(tǒng)受放射損傷的大鼠個月后予靜脈輸注-。于移植后幾個時間點取腦、骨髓、肝、脾等做冰凍切片，用雙光子共聚焦紅外脈沖激光顯微鏡檢測-?！窘Y果】在最早內實驗組和對照組的骨髓中檢測到外源性陽性細胞，至第天后實驗組骨髓中陽性細胞顯著多于對照組。腦內第天未檢測到外源性陽性細胞，第天后中樞神經系統(tǒng)受放射損傷的大鼠，腦組織檢測到帶綠色熒光的外源

2、性陽性細胞；而對照組腦內一直未檢測到帶綠色熒光的外源性。實驗組和對照組脾臟在輸注后第天即檢測到大量陽性細胞，并持續(xù)存在，第天實驗組陽性細胞較對照組減少?！窘Y論】在放射損傷條件下外源性可透過血腦屏障到達腦組織，中樞神經系統(tǒng)放射損傷可誘導外源性向腦組織遷徙定植?！娟P鍵詞】放射損傷中樞神經系統(tǒng)骨髓間充質干細胞：【】（），（）【】-（），【】，【】-：；隨著干細胞工程研究的深入，細胞替代治療已成為治療損傷、遺傳缺陷性或退行性疾病的新途徑。骨髓間充質干細胞（，）是目前備受關注的一類來源于骨髓單個核細胞群，具有多向分化潛能的組織干細胞。特性穩(wěn)定，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。在體外特定的誘導

3、條件下，可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、韌帶等多種細胞-。作為神經系統(tǒng)疾病細胞治療的供體細胞應容易獲得，能夠迅速擴增，能夠在宿主腦內長期存活，易于外源基因的轉染和長期表達，。其中骨髓細胞是可能的來源之一。有實驗表明，骨髓單個核細胞能夠穿過血腦屏障，而且有助于小膠質細胞的正常轉化。而在中樞神經受損傷的狀態(tài)下，外源在體內的移行和定植特性尚未有研究報道。本文觀察到機體中樞神經系統(tǒng)受放射損傷狀態(tài)下的一些遷徙定植特性，可能為應用治療中樞神經系統(tǒng)放射損傷和其他損傷提供實驗依據。材料與方法實驗動物與試劑實驗動物健康雄性-大鼠只，平均體質量，隨機分放射實驗組和對照組，每組分個時間點。綠色熒光蛋白鼠只，平均體質

4、量，作供體。實驗動物均源自英國牛津大學實驗動物部。實驗試劑含胎牛血清的（公司）、胰蛋白酶、抗單抗、抗單抗、抗單抗、抗單抗（公司）、碘化丙啶（公司）。主要儀器雙光子共聚焦紅外脈沖激光顯微鏡（-）（公司）、冷凍切片機（公司）、實驗線照射儀-（公司）、培養(yǎng)箱（公司）。骨髓間充質干細胞分離與誘導的原代培養(yǎng)無菌條件下取綠色熒光蛋白鼠股骨骨髓，加入含有的肝素液的離心管中，充分混勻。加入適量液混勻，以（）離心，吸凈上液；再用液洗一遍（方法同前），用含胎牛血清的完全培養(yǎng)液懸浮細胞，將其接種在培養(yǎng)瓶中，、體積分數、飽和濕度的培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下每日觀察次。原代（）約貼壁細胞接近融合時，用沖洗次以除

5、去培養(yǎng)瓶中的含血清培養(yǎng)基。以適量胰蛋白酶-室溫消化（冬季室溫較低，可放入溫箱孵育），倒置相差顯微鏡下觀察，見到細胞變圓、間隙增寬、有部分細胞懸浮時即可加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。并用吸管輕輕吹打，使細胞進一步脫落。將細胞懸液移入無菌離心管中，以離心，棄去上清，加入適量完全培養(yǎng)基懸浮細胞，將細胞懸液以接種于塑料培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。即為細胞代。待代細胞生長融合達時，可繼續(xù)傳代。的鑒定培養(yǎng)至代時，約貼壁細胞接近融合時，用洗次除去培養(yǎng)瓶中含血清的培養(yǎng)基，以適量胰蛋白酶-室溫消化倒置相差顯微鏡下觀察，見到細胞變圓、間隙增寬、有部分細胞懸浮時即可加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。并用吸管輕

6、輕吹打，使細胞進一步脫落。用洗次后送流式細胞儀室檢測、。放射損傷只雄性鼠在周齡隨機分成組：實驗組腦局部接受線照射；對照組作假照射。在乙醚麻醉下，實驗組以的放射速率，接受的線照射，線透過一個在厚鉛板上直徑的孔，保證大腦、小腦和腦干均接受線照射，而其他部位免于線照射。該方法可以導致胼胝體、內囊等在照射后周間發(fā)生遲發(fā)性壞死。間充質干細胞移植與檢測取擴增第代的，去掉培養(yǎng)液，洗遍，用的的胰蛋白酶和混合液消化，用含的洗滌后制成濃度為的單細胞懸液。每只實驗鼠和對照鼠在周齡時（即放射處理后周），從尾靜脈注入細胞懸液，細胞數。移植后分別在第天、第天、第天、第天、第天將只實驗鼠和對照鼠處死，取腦、肝、脾、腎、骨髓

7、，標本置液氮后作冰凍切片，檢測-在各組織的分布情況。切片以碘化丙啶染色（），用甘油封片，為減少熒光物質的光漂白作用，用雙光子共聚焦紅外脈沖激光顯微鏡（-）檢測。結果的鑒定結果培養(yǎng)至代的生長旺盛、貼壁良好、呈均勻一致的旋渦狀，移植前取細胞懸液用流式細胞儀檢測細胞表面標志顯示、陽性，、陰性。放射損傷結果對實驗組以的放射速率進行線照射，造成海馬和內囊變性。組織學檢查顯示，與對照組比較，實驗組海馬變性、神經元減少。間充質干細胞移植后遷徙和定植情況移植后分別在第天、第天、第天、第天、第天，取腦、肝、脾、腎、骨髓，作冰凍切片，用雙光子共聚焦紅外脈沖激光顯微鏡檢測-在各組織的分布情況，每個樣本數個視野陽性細

8、胞數，計算其平均值。結果顯示：實驗組和對照組在輸注后第天腦內均未檢測到綠色熒光陽性的外源性陽性細胞。移植后第天實驗組海馬出現陽性細胞，第天最為明顯；而對照組腦組織中未見有陽性細胞（圖），經秩和檢驗，兩組差異有顯著性。實驗組和對照組在移植后第天脾臟組織中出現大量的陽性細胞，并且一直持續(xù)至，在第天對照組脾臟陽性細胞明顯高于實驗組，經檢驗差異有顯著性。實驗組和對照組骨髓均在移植后第天即出現陽性細胞，但實驗組多于對照組，經檢驗，在第天、第天、第天兩組差異有顯著性意義。肝臟在輸注后第天即在實驗組和對照組出現陽性細胞，之后各時間點均見陽性細胞，且實驗組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義（）。腎臟僅在第天時間點出現

9、陽性細胞，且兩組間差異無統(tǒng)計學意義（，表）。討論神經元的特性決定了神經元在損傷壞死后難以再生。隨著細胞移植研究的不斷深入和應用，細胞替代治療已成為治療損傷、遺傳缺陷性或退行性疾病的新途徑，使神經組織的再生成為可能。以往在神經領域的細胞移植研究多數用相應神經部位的直接注射，這種方法在動物實驗有較好的可行性，但在臨床應用時有很大的局限性和危險性。有實驗表明，骨髓單個核細胞能夠穿過血腦屏障。根據這一特性，應用外周移植治療中樞神經系統(tǒng)損傷存在著可能。本文在原有對放射性腦損害研究的基礎上，觀察中樞神經放射損傷對外周移植后遷徙定植特性的影響。外源性的遷徙本研究顯示在輸注-后內，實驗組和對照組骨髓中均檢測到

10、陽性細胞，推測性可以直接向骨髓遷徙。比較放射照射組和對照組腦內陽性細胞可反映出外源性在中樞神經放射損傷下的遷徙特性。結果顯示：放射照射組在外周輸注-后第天在海馬區(qū)檢測到-，第天最為明顯；而未受到放射照射的對照組，移植后腦內一直未檢測到外源的陽性細胞?？梢?，一方面外源性有穿過血腦屏障的能力，這與以往文獻報道相符，但在對照組未見有外源性穿過血腦屏障到達腦組織，這說明只有在損傷等因素改變了血腦屏障特性使之一定程度開放的前提下，外源性才能穿過血腦屏障；另一方面，觀察到外源性穿過血腦屏障后有向病損部位定向遷徙的特性。和把成年雄性小鼠的骨髓或反轉錄病毒載體標記的骨髓移植給亞致死量放射線照射的雌性小鼠，后便

11、在受體雌鼠的腦內發(fā)現供體骨髓來源的神經細胞，以后供體骨髓來源的神經細胞逐漸增多。原位雜交和免疫組化法檢測發(fā)現，供體骨髓來源的神經細胞表達小膠質細胞和星形膠質細胞的特異性標志。等研究顯示基質源因子-（-）有促進向受損組織遷徙的作用。外源性的定植外源性在受體內的定植很大程度上決定于其在骨髓的定植情況。本研究顯示：與對照組比較，實驗組骨髓中外源陽性細胞明顯增多?？梢姺派鋼p傷有誘導外源性在骨髓的定植作用，其機理尚未明了，可能在放射損傷時存在趨化因子受體（）的高表達，而后者有促進向骨髓中遷徙融合的作用，。此外，實驗組和對照組從移植后第天，脾臟均見大量-，兩組無差異。這種現象一直持續(xù)至第天，兩組脾臟仍可見大量-。可見，外源性移植后大量細胞將在脾臟被清除，而且這一狀態(tài)一直持續(xù)，這關乎著外源細胞的永久定植的可能性。比較一致的研究結果是移植后具有免疫耐受性不會引起宿主的免疫排斥反應。有報道表明，和細胞均表達組織相容性復合物而缺乏組織相容性復合物，免疫原性較弱。但異體在受體內的遠期歸宿仍然沒有定論。本研究顯示實驗組和對照組在各時間點都有大量-在脾臟持續(xù)存在，這是否是在受體中的歸宿有待進一步研究。而在第天實驗組脾臟中-較對照組顯著減少，這是否提示經放射處理的大鼠在