基于納米技術(shù)的肺癌早期檢測研究

1、項(xiàng)目名稱：基于納米技術(shù)的肺癌早期檢測研究首席科學(xué)家：趙建龍 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部門：中國科學(xué)院 上海市科委一、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究內(nèi)容1、擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題本項(xiàng)目圍繞肺癌早期檢測的重大需求，采用多學(xué)科交叉、綜合的研究方法，重點(diǎn)解決納米材料的定向偶聯(lián)和有序組裝機(jī)理、低豐度樣品富集及微弱信號(hào)檢測方法以及肺癌早期預(yù)警、篩查和檢測的新模式等三個(gè)方面的關(guān)鍵科學(xué)問題： （1）納米材料的定向偶聯(lián)和有序組裝機(jī)理為了獲得性能良好的生物功能化探針，生物分子在微納米界面上組裝后應(yīng)該保持原有的生物活性，具有很好的生物相容性，這就需要研究納米結(jié)構(gòu)與生物分子的定向

2、偶聯(lián)和有序組裝機(jī)理。定向偶聯(lián)機(jī)理問題：如何實(shí)現(xiàn)生物探針在微納米界面上的定向分布，使生物分子的活性部位背對界面，使其與靶分子結(jié)合時(shí)空間位阻最小。有序組裝機(jī)理問題：如何實(shí)現(xiàn)生物探針在微納米界面上的均一分布，不重疊，不堆積，呈現(xiàn)為功能化生物分子單層，使探針發(fā)揮最佳的靶分子性能。（2）低豐度生物樣本富集及微弱信號(hào)檢測方法早期肺癌病人的腫瘤標(biāo)志物濃度很低，由于檢測靈敏度低而出現(xiàn)假陰性。另外，生物標(biāo)本（如血清等）中含有大量內(nèi)源性分子和代謝產(chǎn)物，通常這些物質(zhì)濃度遠(yuǎn)高于腫瘤標(biāo)志物的濃度，是主要的干擾因素，由于標(biāo)本成份復(fù)雜產(chǎn)生干擾而出現(xiàn)假陽性。本項(xiàng)目將研究肺癌標(biāo)志物與納米材料的相互作用機(jī)理以及在微流控芯片中的運(yùn)

3、動(dòng)特性，設(shè)計(jì)相應(yīng)的功能納米器件，分離標(biāo)本中干擾組份，保留待測分子及其活性，建立微量腫瘤標(biāo)志物的高效分離提取富集方法和體系，以達(dá)到腫瘤標(biāo)志物的高靈敏度檢測。（3）肺癌早期預(yù)警、篩查和檢測的新模式針對沒有適合中國人群的肺癌早期檢測敏感性和特異性的問題，聯(lián)合檢測多個(gè)肺癌標(biāo)志物，利用高靈敏、高通量納米檢測技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，建立肺癌早期檢測判別模型，同時(shí)提高檢測敏感度和特異性，建立與早期肺癌顯著相關(guān)的血清蛋白和核酸標(biāo)志物譜，并在高危人群中進(jìn)行驗(yàn)證，建立適合我國肺癌高危人群患者肺癌預(yù)警、篩查和檢測的新模式。2、主要研究內(nèi)容圍繞肺癌早期檢測的重大需求，針對相關(guān)的三個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問題展開研究，然后利用臨床

4、標(biāo)本對基于納米技術(shù)的肺癌早期檢測新方法進(jìn)行醫(yī)學(xué)驗(yàn)證，與影像學(xué)、痰細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行對照研究。本項(xiàng)目主要開展以下四個(gè)方面的研究：功能納米材料的制備和表面修飾、納米探針的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑、納米生物器件的研制以及臨床驗(yàn)證等研究。1.1 功能納米材料的制備和表面修飾功能納米材料的制備主要包括制備熒光量子點(diǎn)材料，用于構(gòu)建多種肺癌標(biāo)志物的同步檢測的納米器件；包括制備表面等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)和硅納米線材料，分別用于構(gòu)建表面等離子體共振傳感器和硅納米線傳感器，用于肺癌標(biāo)志物的超高靈敏檢測。（1）熒光量子點(diǎn)的制備和表面修飾利用微波輔助水相量子點(diǎn)制備技術(shù)，合成出熒光產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性強(qiáng)、粒徑分布窄的多種結(jié)構(gòu)II-VI族量子

5、點(diǎn)。選用適宜的化學(xué)或生物材料修飾量子點(diǎn)，使修飾后的量子點(diǎn)既保持原有的光學(xué)特性又具有良好的生物相容性。研究量子點(diǎn)尺寸及表面組成對其物理化學(xué)性質(zhì)特別是光學(xué)性質(zhì)的影響。（2）表面等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)的制備和表面修飾研究不同表面等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)如金納米殼、金納米星等的制備方法。研究在SiO2膠體晶膜微球表面金的沉積機(jī)理以及金納米殼層復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備方法。研究金納米殼層結(jié)構(gòu)厚度和表面裂紋以及金納米星枝角等的控制方法，及其對局域表面等離子體共振光譜（LSPR）及表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)信號(hào)的影響。 （3）硅納米線的制備和表面修飾研究光、電、溫等影響因素對納米硅材料的腐蝕作用機(jī)理，提高納米硅材料自

6、停止腐蝕的精度，發(fā)展硅納米線陣列制造的新機(jī)理和新方法；研究掩模、腐蝕、保護(hù)等關(guān)鍵工藝的相互制約關(guān)系，提高硅納米線尺寸和表面粗糙度的控制精度，研究不同基團(tuán)在硅納米線表面的硅烷化修飾技術(shù)。1.2 用于肺癌早期檢測的納米探針的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑納米探針的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑主要是為了獲得有良好生物活性和生物相容性的生物功能化探針，主要包括生物分子在熒光量子點(diǎn)、表面等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)以及硅納米線表面的定向偶聯(lián)和有序組裝。（1）量子點(diǎn)與生物分子的偶聯(lián)和有序組裝研究量子點(diǎn)與具有特異選擇或識(shí)別功能的生物分子的定向偶聯(lián)和有序組裝；重點(diǎn)發(fā)展針對腫瘤早期檢測的具有超靈敏度和特異識(shí)別能力的“納米材料-生物分子”納米生物復(fù)合探針；

7、研究這些納米生物探針同待測分子之間的相互作用及其識(shí)別能力。研究量子點(diǎn)與待檢測標(biāo)志物有特異識(shí)別的酶、抗體、基因等生物分子的有序自組裝（非簡單的物理吸附和無序偶聯(lián)），除利用分子間作用力、靜電作用實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)與生物分子的自組裝外，重點(diǎn)發(fā)展基于特定生物分子介導(dǎo)的生物分子有序組裝方法，即通過表面功能基團(tuán)或特定生物分子介導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)生物分子在量子點(diǎn)表面的定向偶聯(lián)或有序組裝。研究有效控制量子點(diǎn)的標(biāo)記數(shù)量和標(biāo)記位置的方法，獲得既具有高標(biāo)記效率又保持高活性的“納米材料生物分子”生物復(fù)合探針。研究量子點(diǎn)與不同生物分子的偶聯(lián)方式，建立一套溫和、有效的生物標(biāo)記方法，在此基礎(chǔ)上建立不同功能團(tuán)的量子點(diǎn)與抗體、酶和DNA等多種生

8、物分子的偶聯(lián)方法及其純化方法，并建立相應(yīng)的規(guī)范的操作指南。（2）生物分子在表面等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)上的可控組裝制備滿足生物傳感需要的高質(zhì)量聚苯乙烯有序多孔金納米結(jié)構(gòu)基底，研究實(shí)驗(yàn)條件對其LSPR和SERS性質(zhì)的影響；研究在金納米結(jié)構(gòu)基底的多孔層表面均勻、高效地固定抗體及配基分子的方法，以提高固定效率和固定化抗體及配基分子的穩(wěn)定性；利用LSPR位移檢測抗原-抗體、配基-生物大分子等的結(jié)合過程及結(jié)合容量等，得到生物分子相互作用的標(biāo)準(zhǔn)曲線、結(jié)合常數(shù)及檢測靈敏度等，研究非特異性吸附對分析的影響；利用基于SERS分子獨(dú)特的振動(dòng)能級和相應(yīng)的拉曼指紋圖譜檢測分子信息，并比較兩種檢測方法的結(jié)果。（3）生物分

9、子在硅基納米界面上的可控組裝選擇生物識(shí)別探針分子（抗體、核酸等），研究其通過不同的自身攜帶基團(tuán)或衍生的基團(tuán)在硅基納米界面上的定位組裝條件；研究其在界面上的有序性、方向性和三維形態(tài)，探索各種不同性質(zhì)的生物探針在特定環(huán)境中的識(shí)別行為和捕獲行為；研究通過共組裝技術(shù)和界面封閉技術(shù)減少探針分子與硅基納米界面之間的非特異性結(jié)合，優(yōu)化硅基納米生物界面的后處理?xiàng)l件，提高其穩(wěn)定性和耐受性；最終獲取生物識(shí)別探針在一維納米材料界面上實(shí)現(xiàn)可控組裝的若干共性條件。1.3納米生物器件的研制首先針對肺癌早期檢測，選擇適當(dāng)?shù)穆?lián)合檢測肺癌標(biāo)志物；然后構(gòu)建微流控芯片用于樣品中腫瘤標(biāo)志物的富集，同時(shí)消除基質(zhì)效應(yīng)；最后出檢測靈敏度高

10、、信噪比、重復(fù)性、穩(wěn)定性和信號(hào)均一性等性能良好的納米生物器件，主要包括基于量子點(diǎn)的納米生物器件、表面等離子體共振傳感器和硅納米線傳感器。（1） 肺癌標(biāo)志物的選擇根據(jù)前期研究結(jié)果，綜合文獻(xiàn)報(bào)道，針對肺癌選擇癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白21-1片段(CYFRA 21-1)、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（SCC）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、組織多肽抗原(TPA)、細(xì)胞維生素A結(jié)合蛋白(RBP)，1-抗胰蛋白酶(1-AT)、血清鐵蛋白（FERRI）以及核酸標(biāo)志物miRNA（現(xiàn)在已在肺癌患者中檢測到的）: let- 7、miR-29、miR-205 , miR-99 b、miR-203、miR-202、m

11、iR-102 和miR-2042prec 作為早期肺癌聯(lián)合檢測標(biāo)志物。（2） 微流控分析芯片分離、富集系統(tǒng)的構(gòu)建針對臨床檢驗(yàn)待測樣品（血清標(biāo)本）具有干擾成分多、肺癌標(biāo)志物含量低等特性。利用微流控芯片和納米磁珠，研究實(shí)現(xiàn)微量肺癌標(biāo)志物的有效純化和富集的方法，主要研究納米磁珠與肺癌標(biāo)志物的相互作用，以及微流控技術(shù)對結(jié)合納米磁珠的定向富集特性。設(shè)計(jì)微流控芯片的各個(gè)功能單元，包括樣品采集、富集、反應(yīng)和分離等，同時(shí)解決微流控芯片的穩(wěn)定性和重復(fù)性問題，最后可以分離臨床標(biāo)本中干擾組份，保留待測分子及其活性。（3）基于量子點(diǎn)的多種肺癌標(biāo)志物聯(lián)合檢測生物器件的構(gòu)建為了達(dá)到多種肺癌標(biāo)志物同時(shí)檢測的目的，擬采用夾心

12、式免疫分析方法同時(shí)檢測多種肺癌標(biāo)志物。將捕獲探針與納米磁珠結(jié)合，將信號(hào)探針與熒光量子結(jié)合，固定有捕獲探針的納米磁珠和固定有信號(hào)探針的量子點(diǎn)與待測樣品中肺癌標(biāo)志物夾心結(jié)合之后，利用微磁場實(shí)現(xiàn)納米磁珠的定向分離和富集，然后通過檢測量子點(diǎn)信號(hào)的顏色和強(qiáng)度來確定肺癌標(biāo)志物的種類和豐度。光學(xué)檢測系統(tǒng)基于超光譜成像原理構(gòu)建，然后通過自主開發(fā)的檢測分析軟件解析出熒光量子點(diǎn)標(biāo)記種類和待檢測腫瘤標(biāo)志物分子信號(hào)強(qiáng)度的對應(yīng)關(guān)系，完成對檢測結(jié)果的分析。（4）表面等離子體共振傳感器選擇典型的肺癌標(biāo)志物作為典型的檢測體系，研究生物分子等在金納米結(jié)構(gòu)基底多孔層中的固定以及抗原-抗體等生物分子相互作用，探索利用LSPR和SE

13、RS兩種互補(bǔ)模式檢測樣品，在同一基底上實(shí)現(xiàn)LSPR與SERS分析技術(shù)的組合，建立基于該基底的生物納米傳感檢測新方法，用于單個(gè)肺癌標(biāo)志物生物分子的檢測。（5）硅納米線傳感器選擇多種肺癌標(biāo)志物作為模式靶，研究組裝高度有序的功能化硅納米線捕獲元件的方法，研究影響硅納米線和生物組裝效果的關(guān)鍵因素；研究傳感器的可靠性和穩(wěn)定性封裝技術(shù)，完成基于硅納米線的生物傳感器組裝，用于肺癌標(biāo)志物（蛋白標(biāo)志物或核酸標(biāo)志物）的超高靈敏檢測，可檢測單個(gè)肺癌標(biāo)志物分子。1.4 臨床驗(yàn)證臨床驗(yàn)證主要包括大樣本的回顧性研究和前瞻性研究以及生物信息學(xué)分析。（1） 回顧性研究本項(xiàng)目擬開展的臨床驗(yàn)證主要利用1500例以上肺癌病人（包括

14、Ia-Ib期，腫瘤直徑小于3cm）的血清、組織標(biāo)本和癌旁標(biāo)本以及健康對照血樣，比較新技術(shù)與常規(guī)診斷方法對腫瘤標(biāo)志物檢測的吻合度，比較新技術(shù)的檢出率與低劑量螺旋CT、常規(guī)血清腫瘤標(biāo)志物、痰脫落細(xì)胞檢測等方法對早期肺癌的檢測敏感度和特異性。通過相關(guān)性分析，確定不同病理類型、不同分化程度和不同分期（TNM）的肺癌的特征性mRNA譜，通過ROC曲線分析確定幾種標(biāo)志物聯(lián)合檢測提高肺癌早期診斷的敏感性和特異性，建立腫瘤標(biāo)志物豐度和腫瘤發(fā)病進(jìn)程的判別模型（確立“正常值范圍”），同時(shí)利用腫瘤發(fā)生前后病人的自身對照血樣進(jìn)行模型修正和校驗(yàn)。（2） 前瞻性研究利用建立的判別模型，對3000例腫瘤高危人群進(jìn)行篩查，分

15、別采用新技術(shù)和常規(guī)診斷方法，如低劑量螺旋CT、痰細(xì)胞學(xué)和常規(guī)血清腫瘤標(biāo)志物檢測對受試人群進(jìn)行檢測，比較新技術(shù)與常規(guī)診斷方法之間的吻合度。對于新技術(shù)檢測陽性的健康人隨訪24月，觀察受試者的預(yù)后，比較檢測結(jié)果與臨床預(yù)后之間的相關(guān)性，以評價(jià)新技術(shù)用于肺癌早期檢測的可行性。初步推測在3000個(gè)高危人群中待隨訪結(jié)束時(shí)可確診肺癌50-60例。（3）建立在臨床標(biāo)本的生物信息學(xué)分析方法在大量樣本的基礎(chǔ)上，將肺癌關(guān)聯(lián)標(biāo)志物隨機(jī)分群，利用生物信息學(xué)分析方法，找到哪些標(biāo)志物群可以集中體現(xiàn)在某個(gè)標(biāo)志物上，獲得最優(yōu)肺癌早期檢測標(biāo)志物組合，同時(shí)具有高敏感性和特異性。二、預(yù)期目標(biāo)1、項(xiàng)目總體目標(biāo)本項(xiàng)目面向肺癌早期檢測的重大

16、需求，研究納米材料的制備和表面修飾、生物分子偶聯(lián)、多種肺癌標(biāo)志物的聯(lián)合檢測以及高靈敏度檢測器件的構(gòu)建，旨在相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)研究上取得突破，獲得源頭創(chuàng)新。首先探明納米材料或納米結(jié)構(gòu)與具有特異選擇或識(shí)別功能的生物分子相互作用的機(jī)制，達(dá)到生物分子的定向偶聯(lián)和有序組裝，在此基礎(chǔ)上，研制出用于多種肺癌標(biāo)志物高靈敏聯(lián)合檢測的納米量子點(diǎn)生物器件。同時(shí)，研制出基于金納米結(jié)構(gòu)的局域表面等離子共振和拉曼光譜傳感器和硅納米線傳感器，作為量子點(diǎn)生物器件輔助方法，用于肺癌標(biāo)志物的超高靈敏檢測。通過大樣本臨床驗(yàn)證，探明肺癌標(biāo)志物與腫瘤發(fā)病進(jìn)程的關(guān)系，納米生物器件的檢測敏感性和特異性均高于85%，最終在肺癌高危人群的早期檢測中

17、得到示范應(yīng)用，從而指導(dǎo)肺癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療，提高病人存活率，減小病人經(jīng)濟(jì)損失，為人民健康、國民經(jīng)濟(jì)建設(shè)、社會(huì)和諧發(fā)展作出貢獻(xiàn)。同時(shí)培養(yǎng)一批高水平青年科技人才。2、五年預(yù)期目標(biāo)（1）對解決國家重大需求的預(yù)期貢獻(xiàn)國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要明確指出：疾病防治要“重心前移，堅(jiān)持預(yù)防為主、促進(jìn)健康和防治疾病結(jié)合。本項(xiàng)目的完成可以解決肺癌的早期檢測關(guān)鍵技術(shù)，從而顯著提高肺癌治療的存活率，為人民健康和國民經(jīng)濟(jì)建設(shè)作貢獻(xiàn)。同時(shí)通過納米材料、生物、醫(yī)學(xué)、信息等多學(xué)科交叉研究，進(jìn)一步推動(dòng)納米材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，增強(qiáng)我國在納米科學(xué)領(lǐng)域的國際競爭力。（2）在理論、方法、技術(shù)等方面預(yù)期取得的進(jìn)展、突破及其科學(xué)

18、價(jià)值1）新模式：獲得肺癌早期預(yù)警、篩查和檢測的新模式，包括肺癌標(biāo)志物種類、豐度和肺癌發(fā)生的判別新模型，肺癌標(biāo)志物異常與肺癌發(fā)病進(jìn)程的關(guān)系，多種肺癌標(biāo)志物與肺癌分型、發(fā)生、發(fā)展及愈后程度的相關(guān)性。2）新方法： 肺癌標(biāo)志物富集和基質(zhì)效應(yīng)消除方法利用生物大分子與納米磁珠的相互作用，以及微流控技術(shù)對納米磁珠的定向富集，建立肺癌標(biāo)志物分離純化方法，同時(shí)減小干擾成分的影響，最終實(shí)現(xiàn)肺癌標(biāo)志物的有效富集。 肺癌標(biāo)志物的快速、聯(lián)合檢測方法采用夾心式免疫分析原理，固定有捕獲探針的納米磁珠和固定有信號(hào)探針的量子點(diǎn)與待測樣品中標(biāo)志物夾心結(jié)合之后，利用量子點(diǎn)信號(hào)的顏色和強(qiáng)度來確定標(biāo)志物種類和豐度，檢測反應(yīng)在液相中進(jìn)行

19、，具有更高的檢測速度。3）新技術(shù)（成果形式）： 多種肺癌標(biāo)志物聯(lián)合檢測技術(shù)：對早期肺癌檢測的敏感性和特異性均高于85%，對抗體的檢測限達(dá)到皮克/毫升 (pg/mL)水平，對核酸的檢測限達(dá)到單堿基差異和皮摩爾(pM)水平，實(shí)現(xiàn)4種以上腫瘤標(biāo)志物的快速聯(lián)合檢測； 基于表面等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)的傳感器：靈敏度達(dá)到單分子水平； 硅納米線傳感器：靈敏度達(dá)到單分子水平； 用于肺癌高危人群篩查的試劑盒：完成高靈敏度試劑盒的小批量生產(chǎn)，并完成1500例臨床標(biāo)本測試和醫(yī)學(xué)驗(yàn)證，完成產(chǎn)品注冊申報(bào)的準(zhǔn)備工作。（3）優(yōu)秀人才培養(yǎng)培養(yǎng)高水平學(xué)術(shù)人才：形成一支思維活躍、創(chuàng)新能力強(qiáng)的基礎(chǔ)研究團(tuán)隊(duì)，造就具有國際影響力的領(lǐng)軍

20、人物1-2名；培養(yǎng)博士、碩士150人；五年內(nèi)發(fā)表SCI、EI收錄學(xué)術(shù)論文200篇以上，領(lǐng)域內(nèi)頂級期刊上發(fā)表文章20篇，出版1本以上專著，申請發(fā)明專利50項(xiàng)。三、研究方案1、總體研究思路面向肺癌早期檢測的重大需求：本項(xiàng)目以肺癌早期檢測為最終目標(biāo)，目前的臨床診斷主要以影像學(xué)和痰細(xì)胞學(xué)為主，無法做到真正的早期檢測，而血清學(xué)檢測又缺乏單一敏感和特異的肺癌標(biāo)志物，因此，本項(xiàng)目將以多種肺癌標(biāo)志物的敏感和特異聯(lián)合檢測作為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)手段。需要解決三個(gè)方面的科學(xué)問題：納米材料的定向偶聯(lián)和有序組裝機(jī)理、低豐度樣品富集及微弱信號(hào)檢測方法以及肺癌早期預(yù)警、篩查和檢測的新模式。通過學(xué)科交叉，實(shí)現(xiàn)技術(shù)突破：在熒光量子點(diǎn)、微

21、流控芯片、表面等離子體共振傳感器、硅納米線傳感器和肺癌臨床治療的方面，我國已有較好的研究基礎(chǔ)，但相互的結(jié)合比較少，創(chuàng)新能力未得到充分發(fā)揮。本項(xiàng)目將研究三種高靈敏檢測技術(shù)，（1）熒光量子點(diǎn)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，研制納米生物器件，用于多種肺癌標(biāo)志物的敏感和特異同步檢測；（2）研制基于金納米殼的拉曼光譜傳感器，用于肺癌標(biāo)志物的超高靈敏檢測；（3）研制硅納米線傳感器，用于肺癌標(biāo)志物的超高靈敏度檢測。其中（2）和（3）作為（1）的技術(shù)補(bǔ)充。在此基礎(chǔ)上，利用臨床大樣本進(jìn)行醫(yī)學(xué)驗(yàn)證，并用于肺癌高危人群的早期檢測，獲得肺癌標(biāo)志物與肺癌發(fā)病進(jìn)程的關(guān)系，得到肺癌早期預(yù)警、篩查和檢測的新模式，以指導(dǎo)肺癌的臨床治療

22、，促進(jìn)人類健康水平的提高。（見圖1所示）圖1 項(xiàng)目的總體研究思路2、技術(shù)路線本項(xiàng)目通過學(xué)科交叉，充分結(jié)合各單位在熒光量子點(diǎn)、微流控芯片、表面等離子體共振傳感器、硅納米線傳感器和肺癌臨床治療等方面的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)技術(shù)突破。主要包括四方面內(nèi)容，（1）肺癌標(biāo)志物富集微流控芯片，用于血液樣本中肺癌標(biāo)志物的分離、純化和富集；（2）基于熒光量子點(diǎn)的納米生物器件，用于多種肺癌標(biāo)志物的敏感和特異同步檢測，通過量子點(diǎn)信號(hào)的顏色和強(qiáng)度確定肺癌標(biāo)志物的種類和豐度；（3）基于表面等離子共振金納米結(jié)構(gòu)的傳感器和硅納米線傳感器，用于超低豐度肺癌標(biāo)志物的檢測；（4）利用研制的納米生物器件，對臨床樣本進(jìn)行檢測，并與常規(guī)方法對照，

23、以驗(yàn)證技術(shù)可行性。具體技術(shù)途徑分述如下：（1）肺癌標(biāo)志物富集微流控芯片針對臨床樣品干擾成分多、肺癌標(biāo)志物含量低等特性，利用微流控芯片和納米磁珠技術(shù)，實(shí)現(xiàn)微量肺癌標(biāo)志物的有效純化和富集，同時(shí)去除可能的背景雜質(zhì)。根據(jù)檢測對象的要求，設(shè)計(jì)微流控分析平臺(tái)的各個(gè)功能單元，包括樣品采集、富集、反應(yīng)、分離檢測等，通過模擬分析進(jìn)行有效集成；選擇石英玻璃或聚合物材料（PDMS、PMMA、SU-8等），基于MEMS加工工藝，制造微流控芯片；基于電驅(qū)動(dòng)原理，優(yōu)化電場、緩沖介質(zhì)等條件，解決反應(yīng)條件難于控制、進(jìn)樣量較少、進(jìn)樣重現(xiàn)性較差以及樣品中不同組分富集率差異等問題，解決穩(wěn)定性和重復(fù)性問題，最后用于臨床樣本中肺癌標(biāo)志

24、物的富集。芯片的具體結(jié)構(gòu)如圖2所示。圖2 肺癌標(biāo)志物富集微流控芯片（2）基于熒光量子點(diǎn)的多種肺癌標(biāo)志物聯(lián)合檢測生物器件根據(jù)需求設(shè)計(jì)和制作不同尺寸和特性的熒光量子點(diǎn)，然后在納米磁珠上偶聯(lián)上捕獲探針，在量子點(diǎn)上偶聯(lián)上信號(hào)探針。將功能化的量子點(diǎn)探針和納米磁珠探針加入待測樣本中進(jìn)行反應(yīng)和檢測。固定有捕獲探針的納米磁珠和固定有信號(hào)探針的量子點(diǎn)與待測樣品中肺癌標(biāo)志物夾心結(jié)合之后，利用微流控芯片對磁珠的定向富集，將未結(jié)合磁珠的量子點(diǎn)去除，采用光學(xué)檢測系統(tǒng)采集量子點(diǎn)的熒光圖像，通過熒光量子點(diǎn)信號(hào)的顏色和強(qiáng)度解析出肺癌標(biāo)志物的種類和豐度，完成對檢測結(jié)果的分析。 量子點(diǎn)的制備以廉價(jià)的CdCl2、Te、Na2S、Z

25、nS等為原料，利用微波輔助水相量子點(diǎn)制備技術(shù)，通過優(yōu)化半導(dǎo)體量子點(diǎn)的制備條件（反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH等），實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)的可控生長和組裝，精確控制量子點(diǎn)的生長尺寸和粒徑分布，合成出熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性強(qiáng)、粒徑分布窄的多種結(jié)構(gòu)II-VI族量子點(diǎn)如CdTe/CdS、CdSe/ZnS等。采用場發(fā)射透射電子顯微鏡、場發(fā)射掃描電鏡、X-射線單晶衍射儀等表征量子點(diǎn)的微觀結(jié)構(gòu)；利用瞬態(tài)和穩(wěn)態(tài)熒光光譜和紫外吸收光譜研究量子點(diǎn)的光物理行為和光化學(xué)穩(wěn)定性。采用原位包覆、配體交換、靜電自組裝以及二氧化硅包覆等方法對量子點(diǎn)表面進(jìn)行修飾或包裹，以減少量子點(diǎn)表面富余的離子基團(tuán)，減低量子點(diǎn)探針的非特異吸附，改善量子點(diǎn)的水溶性

26、，解決量子點(diǎn)的生物相容性問題；以人類白血病K562細(xì)胞為研究對象，考察不同濃度和不同培育時(shí)間下量子點(diǎn)對K562細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，以評價(jià)量子點(diǎn)的生物相容性。 量子點(diǎn)與生物分子偶聯(lián)和有序組裝生物分子偶聯(lián)和有序組裝主要包括量子點(diǎn)與生物分子的自組裝、復(fù)合探針的純化以及性質(zhì)鑒定和性能評價(jià)。納米生物自組裝：研究量子點(diǎn)與待檢測標(biāo)志物有特異識(shí)別的酶、抗體、基因等生物大分子的相互作用機(jī)理及其偶聯(lián)或自組裝方法。除利用分子間作用力、靜電作用實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)與生物分子的自組裝外，本項(xiàng)目重點(diǎn)發(fā)展基于特定生物分子介導(dǎo)的生物分子有序組裝方法，即通過表面功能基團(tuán)或特定生物分子介導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)抗體和基因在量子點(diǎn)表面的定向偶聯(lián)或有序組裝。例如

27、，未端標(biāo)記Biotin的DNA先聯(lián)接在量子點(diǎn)QD表面上，得到QD-DNA-biotin復(fù)合物，再與鏈霉親和素（Strepavidin）自組裝（基于biotin與avidin的特異性結(jié)合），可獲得DNA分子介導(dǎo)的有序組裝納米復(fù)合探針QD-DNA-biotin-Strepavidin；或者免疫球蛋白G（IgG）通過EDC/NHS偶聯(lián)方法與QD連接，再與特定的單抗（Ab）自組裝，可獲得IgG分子介導(dǎo)的探針QD-IgG-Ab。通過這些定向偶聯(lián)或有序組裝，可以有效解決納米材料與生物分子間因簡單的物理吸附或無序偶聯(lián)而導(dǎo)致納米生物復(fù)合探針穩(wěn)定性差和生物識(shí)別功能失效的問題，從而實(shí)現(xiàn)構(gòu)建高效的納米生物復(fù)合探針。

28、制備與純化：將熒光量子點(diǎn)與生物分子通過各種濃度配比、緩沖體系、溫度、時(shí)間進(jìn)行自組裝反應(yīng)，產(chǎn)物通過色譜技術(shù)或超濾技術(shù)等進(jìn)行純化，去除游離量子點(diǎn)和生物分子，純化探針貯存于含有多種保護(hù)組分的儲(chǔ)存緩沖液中，備用。性質(zhì)鑒定：應(yīng)用原子力顯微鏡和熒光光譜儀等鑒定納米生物復(fù)合探針的物化性質(zhì)，如尺寸大小、量子效率、分散性等；應(yīng)用免疫沉淀反應(yīng)鑒定探針的靶蛋白結(jié)合性能；通過發(fā)光效率與生物活性的時(shí)間曲線鑒定探針的穩(wěn)定性。 納米生物器件的研制選擇相對較低廉的PDMS材料基于聚合物微加工制備微流控芯片平臺(tái)，該芯片包括待測樣品采集、富集、混合、反應(yīng)、分離和檢測等功能模塊；基于磁珠分離和富集技術(shù)實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物的高效富集。設(shè)計(jì)

29、和制作微混合器實(shí)現(xiàn)反應(yīng)組分有效混合，以及提供特定的溫度條件提高反應(yīng)效率等。基于超光譜成像檢測原理，設(shè)計(jì)并制造光學(xué)檢測裝置，為提高檢測裝置的可靠性，整個(gè)裝置擬采用模塊化設(shè)計(jì)，包括光源和光學(xué)元件模塊、信號(hào)采集處理模塊、微流控芯片臺(tái)模塊、儀器自動(dòng)控制、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和顯示處理模塊，以及外殼等，達(dá)到美觀、實(shí)用和集成的要求。另外，根據(jù)標(biāo)志物臨床檢測要求，開發(fā)數(shù)據(jù)分析軟件，實(shí)現(xiàn)檢測譜圖的顯示和存儲(chǔ)，各組分相對含量的計(jì)算、比對和統(tǒng)計(jì)，并最終以常規(guī)檢驗(yàn)報(bào)告單的形式打印輸出。納米生物器件具體結(jié)構(gòu)如圖3所示。圖3 基于熒光量子點(diǎn)的多種肺癌標(biāo)志物聯(lián)合檢測生物器件（2）基于表面等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)的傳感器 表面等離子體共

30、振金納米材料的規(guī)?；苽浜捅砻嫘揎椑米越M裝和膠體還原化學(xué)技術(shù)規(guī)?；苽涑鼍哂泻侠砗?殼比的金納米殼材料，使其產(chǎn)生的等離激元共振吸收峰的峰波長位置位于近紅外光區(qū)并適合全血分析的要求；完善金納米殼材料表面生物功能化途徑；研究抗體等生物分子在金納米殼材料表面的固定的方法；通過對金納米殼材料的功能化修飾，將生物分子識(shí)別作用和金納米殼材料的光學(xué)特性巧妙地結(jié)合在一起。對金納米殼表面進(jìn)行功能化修飾可以增加穩(wěn)定性、生物相容性，排除非特異性干擾，可以使其更好地與生物體系結(jié)合，提高其生物分子識(shí)別能力。通過LSPR吸收峰位置變化定量分析全血體系中肺癌標(biāo)志物；建立基于LSPR原理的肺癌早期診斷新方法。 用于肺癌早期

31、檢測的納米探針的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑完善有序排列、厚度可控及大面積均勻的SiO2膠體晶膜的制備體系，制備滿足各種需要的不同微球直徑和厚度的氨基化SiO2膠體晶膜；以吸附的GNPs為核，選擇不同還原劑，還原AuCl4-，控制反應(yīng)速度和沉積時(shí)間，在SiO2膠體晶膜微球表面沉積金制備金納米殼層復(fù)合結(jié)構(gòu)。通過控制微球直徑、金納米殼層結(jié)構(gòu)的厚度以及表面裂紋等調(diào)控LSPR，研究SERS對于LSPR吸收峰波長的依賴性；制備滿足生物傳感檢測需要的高質(zhì)量聚苯乙烯有序多孔金納米結(jié)構(gòu)基底并研究各種實(shí)驗(yàn)條件對其LSPR和SERS性質(zhì)的影響，通過調(diào)節(jié)LSPR使SERS信號(hào)最優(yōu)化；在聚苯乙烯有序多孔金納米結(jié)構(gòu)基底的多孔層表面均勻、

32、高效地固定抗體及配基分子，提高固定效率和固定化抗體及配基分子的穩(wěn)定性，研究靶標(biāo)分子在不同孔徑多孔層中的微流體性質(zhì)；利用LSPR位移檢測抗原-抗體、配基-生物大分子等的結(jié)合過程及結(jié)合容量等，得到生物分子相互作用的標(biāo)準(zhǔn)曲線、結(jié)合常數(shù)及檢測靈敏度等，研究非特異性吸附對分析的影響；利用基于SERS分子獨(dú)特的振動(dòng)能級和相應(yīng)的拉曼指紋圖譜檢測和鑒別分子信息，比較兩種檢測途徑的分析結(jié)果，證明LSPR與SERS的互補(bǔ)性等。 基于等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)傳感器的研制通過控制SiO2膠體微球直徑、膠體晶膜厚度、金納米殼層的厚度以及表面裂紋等調(diào)節(jié)基底LSPR吸收峰波長位置使SERS信號(hào)最優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、可重復(fù)的有序金

33、納米殼結(jié)構(gòu)SERS基底的規(guī)?；圃?；在基底多孔層表面形成均勻及高穩(wěn)定的吸附肺癌標(biāo)志分子層，減小環(huán)境中的背景噪音，提取增強(qiáng)光學(xué)信號(hào)信號(hào)；最終研制出基于納米金結(jié)構(gòu)拉曼光譜傳感器，用于肺癌標(biāo)志物的高靈敏度定量分析。傳感器結(jié)構(gòu)如圖4所示。 圖4 基于金納米結(jié)構(gòu)的肺癌標(biāo)志物拉曼光譜傳感器示意圖（3）硅納米線傳感器硅納米線傳感器主要利用探針分子和被分析物特異結(jié)合在硅納米線表面，產(chǎn)生電場或者電勢的變化，實(shí)現(xiàn)針對特定基團(tuán)的生物檢測。它的主要優(yōu)點(diǎn)是超高靈敏度、直接電讀出、無標(biāo)記、易于與電路實(shí)現(xiàn)整體集成。該傳感器主要包括硅納米線制備、功能探針有序組裝和傳感器構(gòu)建。 硅納米線的制備基于硅材料的工藝選擇性，采用IC工

34、藝構(gòu)建自對準(zhǔn)的硅納米線腐蝕掩模版，可以實(shí)現(xiàn)硅納米線尺寸的精確可控和批量加工制造。本方法主要是通過工藝選擇性來制造納米線，與具體的工藝參數(shù)相關(guān)性非常小，完全可以在實(shí)現(xiàn)納米線準(zhǔn)確定位的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)硅納米線尺寸的精細(xì)控制。具體是：選用低摻雜SIMOX SOI圓片，通過氧化、光刻工藝，以氧化硅為掩膜，利用TMAH對硅進(jìn)行腐蝕形成（111）面。再使用低溫化學(xué)氣相沉積（LPCVD）生長Si3N4，保護(hù)已腐蝕的出的硅（111）面。在距離該面不遠(yuǎn)的地方光刻開出窗口，腐蝕二氧化硅直到接近已形成的硅(111)面的上端。使用TMAH溶液腐蝕表層硅，形成橫截面為等腰三角形的三棱柱。最后，淀積鋁制作電極，完成硅納米線的制

35、作。 生物分子在硅納米線表面的有序組裝選擇生物分子（以DNA探針為例），利用其本身攜帶或衍生的基團(tuán)實(shí)現(xiàn)其與硅納米線表面的偶聯(lián)；設(shè)計(jì)DNA探針分子支架末端修飾方案，使修飾端與硅納米線表面實(shí)現(xiàn)共價(jià)偶聯(lián)。優(yōu)化各項(xiàng)偶聯(lián)條件，使該復(fù)合結(jié)構(gòu)中的生物分子保持后續(xù)生物反應(yīng)活性（探針的生物識(shí)別性能和生物分子的滾環(huán)復(fù)制性能）；同時(shí)減少探針分子與硅納米線之間的非特異性結(jié)合，優(yōu)化該納米生物復(fù)合結(jié)構(gòu)的后處理?xiàng)l件，提高其穩(wěn)定性和耐受性。具體包括：將抗體加入磷酸納緩沖液（含 PNGase F 酶）中進(jìn)行酶解去糖基化。然后加入胃蛋白酶瓊脂糖、Triton X-100，振蕩反應(yīng)，用醋酸納緩沖液洗脫產(chǎn)物，超濾濃縮并轉(zhuǎn)移至磷酸鈉溶

36、液中，得到純的F(ab)2。上述溶液經(jīng)2-巰基乙胺處理，然后經(jīng)磷酸鈉緩沖液透析過夜，然后過柱脫鹽，除凈巰基乙胺，得到的Fab；5端修飾功能基團(tuán)（氨基或炔基等）；將官能團(tuán)修飾的Fab（蛋白質(zhì)探針）和DNA 寡核苷酸，通過化學(xué)鍵合實(shí)現(xiàn)定向偶聯(lián)在特定的納米界面區(qū)域內(nèi)；首先在特定區(qū)域組裝Fab，然后在其余區(qū)域裝配DNA 寡核苷酸。組裝完成后，加入納米界面封閉液（含有酪蛋白、隨機(jī)DNA序列、兩親有機(jī)分子等）對界面進(jìn)行鈍化。鑒定方法：免疫分析法鑒定Fab探針與靶分子的結(jié)合性能，計(jì)算親和常數(shù)，統(tǒng)計(jì)活性變化情況；比色與電泳法結(jié)合鑒定DNA 的組裝效率。 硅納米線傳感器的研制通過控制生物分子在硅基納米線表面的有

37、序性、方向性和三維形態(tài)，實(shí)現(xiàn)硅基納米線表面的高可控生物組裝制造。完成生物探針分子在硅基納米線表面的密度調(diào)控組裝后，通過測量硅納米線傳感器源漏電流值，并比較結(jié)合目標(biāo)檢測物前后的源漏電流值，就可以得到肺癌標(biāo)志物的特異性響應(yīng)。主要包括：采用硅烷化試劑APTES乙醇溶液和羧基活化劑實(shí)現(xiàn)硅納米線表面硅烷化，然后進(jìn)行miRNA探針組裝，測量miRNA雜交緩沖液和參比的結(jié)果，得到對目標(biāo)檢測物的特異性響應(yīng)。（4）臨床醫(yī)學(xué)驗(yàn)證研制出的納米生物器件提供給醫(yī)院進(jìn)行臨床試驗(yàn)應(yīng)用和考核，利用大樣本腫瘤病人（目前已有的肺癌血清和組織標(biāo)本）和健康對照血樣（大致相同的人數(shù)）和組織標(biāo)本（肺癌患者手術(shù)的癌旁組織），檢測樣本的腫瘤

38、標(biāo)志物豐度，通過相關(guān)性分析，確定不同病理類型、不同分化程度的肺癌的特征性microRNA譜，通過ROC曲線分析，確定幾種肺癌標(biāo)志物聯(lián)合檢測提高肺癌早期診斷的敏感性和特異性，建立腫瘤標(biāo)志物豐度和腫瘤發(fā)病進(jìn)程的判別模型。利用建立的判別模型，對腫瘤高危人群進(jìn)行篩查、隨訪24個(gè)月，評價(jià)它們在腫瘤早期檢測中的價(jià)值。具體的方案如圖5所示。 圖5 生物標(biāo)記物（以核酸為例）判別模型的建立路線示意圖根據(jù)相關(guān)臨床標(biāo)本選擇標(biāo)準(zhǔn)選擇肺癌標(biāo)本、癌旁組織標(biāo)本及肺癌患者和健康對照組（非吸煙者）的血清標(biāo)本和痰標(biāo)本，進(jìn)行核酸提取和蛋白提取，利用研制納米生物器件，針對以上的核酸和蛋白標(biāo)本進(jìn)行檢測，與病理類型、細(xì)胞分化程度、分期（

39、TNM分期）進(jìn)行相關(guān)性分析，并通過ROC曲線分析確定幾種標(biāo)志物聯(lián)合檢測提高肺癌早期診斷的敏感性和特異性，建立腫瘤標(biāo)志物豐度和腫瘤發(fā)病進(jìn)程的判別模型。利用該判別模型進(jìn)行高危人群的篩查，高危人群的招募期限為1年，共招募3000人，入組標(biāo)準(zhǔn)： 吸煙指數(shù)在400以上、年齡大于40歲者; 有肺癌和其他惡性腫瘤家族史者; 有職業(yè)暴露史者（煤煙、油煙、放射線、石棉）。有慢性肺部疾病者（如肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺疾?。?。同時(shí)招募健康對照者（人數(shù)未定），其入組標(biāo)準(zhǔn)為：同高危人群性別、年齡匹對無吸煙和被動(dòng)吸煙史、無腫瘤家族史、無慢性肺部疾病者。入組時(shí)檢查項(xiàng)目：對招募的患者行外周血和低劑量螺旋CT（胸部檢查

40、），血樣行蛋白標(biāo)志物和微RNA檢查。其他任何處理取決于就診醫(yī)生。在隨訪24月期間內(nèi)患者分為分為以下幾組（如有任何癥狀，檢查和治療取決于就診醫(yī)生），至患者確診時(shí)，記錄病理類型、分化程度、TNM分期、核酸和蛋白標(biāo)志物濃度、其它任何不良事件（其它惡性腫瘤等），檢查流程如圖6所示。 圖6 利用建立的判別模型進(jìn)行肺癌高危人群篩查流程大臨床標(biāo)本生物信息學(xué)分析方法：根據(jù)大規(guī)模臨床驗(yàn)證，利用貪婪算法搜索支持向量機(jī)分類器狀態(tài)下，對樣本分類的準(zhǔn)確率最高的特點(diǎn)，將肺癌關(guān)聯(lián)標(biāo)志物隨機(jī)分群，利用貪婪算法測試和評估訓(xùn)練樣本集和預(yù)測樣本集中，找到哪些標(biāo)志物群可以集中體現(xiàn)在某個(gè)標(biāo)志物上，哪些標(biāo)志物群對特異性的肺癌類型有較高的

41、特異性和敏感性，從而獲得最優(yōu)肺癌診斷標(biāo)志物組合。在此基礎(chǔ)上，獲得肺癌早期預(yù)警、篩查和檢測新模式，完成肺癌早期檢測的應(yīng)用流程制訂，用于指導(dǎo)肺癌高危病人的篩查和檢測。3、可行性分析本項(xiàng)目根據(jù)設(shè)定的研究目標(biāo)和研究內(nèi)容，凝聚了一支來自國內(nèi)主要優(yōu)勢單位的多學(xué)科緊密配合的創(chuàng)新群體，中科院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所、東南大學(xué)、南京郵電大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院和香港城市大學(xué)深圳研究院等單位聯(lián)合申請，各單位在各自的領(lǐng)域具有扎實(shí)的研究基礎(chǔ)，符合優(yōu)勢互補(bǔ)，強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合的要求。在項(xiàng)目預(yù)研過程中，各單位之間就已開展通力合作，形成了科研能力強(qiáng)的研究聯(lián)合體，已經(jīng)具備了開展本項(xiàng)目的軟硬件條件。聯(lián)合申請

42、單位對項(xiàng)目的科學(xué)問題和研究內(nèi)容進(jìn)行了長期的調(diào)研、分析和討論。除了注重科學(xué)前沿性之外，密切關(guān)注國外最新發(fā)展動(dòng)態(tài)，確保項(xiàng)目的學(xué)術(shù)思路正確、技術(shù)途徑可行。各單位在國家自然科學(xué)基金、國家863計(jì)劃等的資助下，已經(jīng)開展了肺癌早期檢測相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物、熒光量子點(diǎn)、探針標(biāo)記、微流控技術(shù)、表面等離子體共振傳感器和硅納米線傳感器等相關(guān)的基礎(chǔ)研究，并取得了一些創(chuàng)新成果，為本項(xiàng)目打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)。與本項(xiàng)目相關(guān)的主要研究成果如下：（1）在肺癌早期檢測的臨床研究方面在肺癌早期診斷方面曾先后承擔(dān)國家自然基金和衛(wèi)生部肺癌早期診斷課題，用改良的二步PCR方法檢測痰脫落細(xì)胞中K-ras基因的突變，提高敏感性約20。研究發(fā)現(xiàn)非小

43、細(xì)胞肺癌hTERT表達(dá)陽性率為86.3%，與c-myc mRNA表達(dá)存在顯著相關(guān)，能輔助診斷肺癌、判斷肺癌預(yù)后。與上海市腫瘤研究所的合作研究檢測肺癌基因甲基化的發(fā)生和轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株WT1、RASSF1A、MYDO1、GMGT、RAR基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生甲基化與非小細(xì)胞肺癌顯著相關(guān)，同時(shí)，這些基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平有不同程度的降低甚至不轉(zhuǎn)錄，對輔助診斷肺癌有積極的作用。為下一步臨床驗(yàn)證和示范應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。天津腫瘤醫(yī)院擁有肺癌新鮮組織標(biāo)本2700例，肺癌患者血清標(biāo)本2500例，組織標(biāo)本和血清配對標(biāo)本800例，可以用于進(jìn)行大規(guī)模臨床試驗(yàn)。（2）在熒光量子點(diǎn)和微流控芯片方

44、面在納米材料的制備上，已掌握多種制備技術(shù)，合成了納米金、量子點(diǎn)、石墨烯、金屬氧化物等多種納米材料，尤其開發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微波輔助水相量子點(diǎn)制備技術(shù)，實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)的可控生長和量子點(diǎn)尺寸與分布的精確控制，制備了高質(zhì)量核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)，相關(guān)研究成果發(fā)表在Adv Mater、Small、Biomaterials、Chem Mater和J Mater Chem等雜志上。通過量子點(diǎn)與生物分子的分子間偶聯(lián)或自組裝，已實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)對Avidin、Strepavidin、IgG、DNA等多種生物分子的有序自組裝，利用這類具有高亮信號(hào)特性和高特異性的“量子點(diǎn)生物分子”復(fù)合探針，不僅能成功標(biāo)記人胚胎期腎細(xì)胞HEK2

45、93T的骨架蛋白actin，而且量子點(diǎn)的熒光性能和光穩(wěn)定性均優(yōu)于熒光染料分子FITC；另外，利用構(gòu)建的量子點(diǎn)熒光探針QD-IgG或QD-avidin，結(jié)合微流控芯片技術(shù)，已實(shí)現(xiàn)在血清樣本中對腫瘤標(biāo)志物CEA和AFP的高靈敏分析和定量檢測，其檢測限達(dá)到250 fM，比染料探針FITC-IgG提高10000倍，也比常規(guī)ELISA提高近10倍。表明基于量子點(diǎn)的微流控芯片不僅具有超靈敏分析能力，而且在血清樣本中也具有良好的特異性（Nano Research-2008-v1-p490、ACS Nano-2010-v4-p488、Chem Commun-2010-v46-p6126）。由此可見，利用新型量

46、子點(diǎn)熒光探針，并結(jié)合具有“多元多指標(biāo)”檢測能力的微流控芯片技術(shù)，是極有可能實(shí)現(xiàn)肺癌在臨床上的早期診斷。發(fā)展了微量樣品富集、核酸擴(kuò)增及電泳分離檢測等功能的集成化微流控芯片，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了檢測儀器，并用于臨床尿蛋白、血脂蛋白的快速分離和分析，其中尿蛋白檢測儀可以同時(shí)快速檢測尿液中多種微量蛋白，用于腎病綜合癥等重要疾病的診斷，獲得醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊證書（注冊號(hào)：浙食藥監(jiān)械準(zhǔn)字2005第2400516）；血脂蛋白檢測儀可以同時(shí)檢測血液中的低密度脂蛋白，用于冠心病等的快速診斷，目前已經(jīng)完成臨床試驗(yàn)，醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊證書正在審批。（3）表面等離子體共振傳感器方面制備出孔徑可調(diào)的三維有序大孔（3DOM）聚苯

47、乙烯基底，建立了一種用3DOM聚苯乙烯材料作為固定生物分子基底的免疫分析新方法。利用衍射峰位移研究了3DOM敏感材料的微流體性質(zhì)和蛋白質(zhì)分子在多孔層里的結(jié)合過程、結(jié)合容量、特異性分子識(shí)別反應(yīng)及檢測靈敏度等。制備出能同時(shí)耦合金納米殼（GNPs）的LSPR和光子晶體的衍射光學(xué)特性的新型微納結(jié)構(gòu)敏感材料，該復(fù)合材料不僅再現(xiàn)了GNPs的LSPR峰，而且也復(fù)制了模板的衍射峰。兩個(gè)特征峰的可逆疊加呈現(xiàn)出有趣的光學(xué)“開關(guān)”能力，為監(jiān)控微環(huán)境的改變提供了一個(gè)新的三維檢測平臺(tái)。相關(guān)工作分別發(fā)表在Chem. Mater.、Langmuir上。制備出具有可調(diào)光學(xué)性質(zhì)的GNSs，控制GNSs核-殼比可使其LSPR位于

48、光譜的近紅外區(qū)(700-1300 nm)，該光譜區(qū)域是光學(xué)傳輸透過生物組織的最佳區(qū)域。將GNSs組裝到APTES修飾的玻璃基底表面，制備出新型自組裝GNSs敏感膜。利用GNSs對周圍介質(zhì)介電常數(shù)改變的敏感性，研制出一種適合于全血樣品分析的生物傳感器，并實(shí)現(xiàn)了全血體系中生物素與鏈霉親和素的相互作用的實(shí)時(shí)檢測。相關(guān)工作發(fā)表在Biosens. Bioelectron.上。（4）硅納米線傳感器方面項(xiàng)目組于2003年發(fā)明了一種基于各向異性濕法腐蝕技術(shù)的納米線加工技術(shù)，通過采用傳統(tǒng)的光刻、刻蝕和沉積技術(shù)，利用Si（111）面的自停止腐蝕和硅納米線的自限制氧化特性，成功地制造了寬度在100nm以下的硅納米線

49、，并于2005年獲得了發(fā)明專利。該技術(shù)由于完全采用現(xiàn)有半導(dǎo)體工藝，工藝簡單，特別適合批量制造的需要。近一年以來，對這種自上而下的硅納米線開展了表面硅烷化研究，目前已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)了表面自組裝單分子膜層，并通過硅納米線表面單鏈DNA探針修飾，實(shí)現(xiàn)了對1 fM DNA分子的響應(yīng)?？傊?，本項(xiàng)目符合國家中長期科學(xué)與技術(shù)發(fā)展規(guī)劃，瞄準(zhǔn)了肺癌早期檢測重大需求，立足于早發(fā)現(xiàn)、早治療，為節(jié)省治療費(fèi)用、挽救人們生命、促進(jìn)和諧發(fā)展作出貢獻(xiàn)。在已有的研究基礎(chǔ)上，整合相關(guān)領(lǐng)域的科研人員，所提出的學(xué)術(shù)思路和技術(shù)路線充分考慮了原理與技術(shù)的可行性，考慮了成果的創(chuàng)新性和總體水平。因此，本項(xiàng)目研究技術(shù)路線先進(jìn)可行，具備了取得重大突

50、破的條件。4、創(chuàng)新點(diǎn)（1）多種肺癌標(biāo)志物的高靈敏、快速檢測方法采用夾心式免疫分析原理，固定有捕獲探針的納米磁珠和固定有信號(hào)探針的量子點(diǎn)與待測樣品中標(biāo)志物夾心結(jié)合之后，通過量子點(diǎn)信號(hào)的強(qiáng)度來確定標(biāo)志物的種類和豐度。由于利用高亮信號(hào)特性的水溶性量子點(diǎn)作熒光標(biāo)記物，構(gòu)建新型“量子點(diǎn)生物分子”納米生物復(fù)合探針，獲得超強(qiáng)標(biāo)記信號(hào)，可以獲得高靈敏度檢測。由于檢測反應(yīng)在液相體系中進(jìn)行，因此，可以獲得很快的檢測速度。（2）微量生物樣品分離、純化和富集方法針對臨床樣品具有干擾成份多、肺癌標(biāo)志物豐度低等特性，基于微流控技術(shù)的樣品富集技術(shù)可有效地提高分析效率和檢測靈敏度，并降低對檢測器件的要求。根據(jù)待測生化分子的物

51、理和化學(xué)特性，利用納米磁珠與待測生物分子特異結(jié)合分離標(biāo)本中干擾組分，消除基質(zhì)效應(yīng)，保留待測分子及其活性。通過優(yōu)化電場、緩沖介質(zhì)等條件，可以解決樣品中不同組分富集率差異等問題，實(shí)現(xiàn)微量肺癌標(biāo)志物的分離、純化和富集，用于低豐度肺癌標(biāo)志物的檢測。5課題設(shè)置本項(xiàng)目圍繞肺癌早期檢測的三個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問題展開研究，同時(shí)，利用大規(guī)模臨床標(biāo)本對肺癌早期檢測技術(shù)進(jìn)行臨床驗(yàn)證，與影像學(xué)和痰細(xì)胞學(xué)等常規(guī)方法進(jìn)行對照研究。本項(xiàng)目主要開展以下四個(gè)方面的研究：功能性納米材料的制備及表面修飾、納米探針的構(gòu)筑、納米生物器件的研制以及臨床醫(yī)學(xué)驗(yàn)證等。圍繞項(xiàng)目的研究內(nèi)容，設(shè)置4個(gè)課題，每個(gè)課題的研究內(nèi)容相對獨(dú)立，前一課題依次為后一課

52、題的研究基礎(chǔ)，同時(shí)后一課題的結(jié)果是對前一課題的驗(yàn)證和反饋，課題之間相互促進(jìn)。本項(xiàng)目設(shè)置4個(gè)課題：課題1：功能性納米材料的制備和表面修飾課題2：用于肺癌早期檢測的納米探針的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑課題3：基于納米探針的肺癌早期檢測器件的設(shè)計(jì)和制造課題4：用于肺癌早期檢測納米生物器件的醫(yī)學(xué)驗(yàn)證課題1：功能性納米材料的制備和表面修飾研究目標(biāo)： 研制出光學(xué)及表面性質(zhì)穩(wěn)定，靈敏高效的CdTe/CdS、CdSe/ZnS等熒光量子點(diǎn)，研制出表面性能穩(wěn)定、可靠的等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)和硅量子線材料，納米材料或納米結(jié)構(gòu)與目標(biāo)生物大分子具有良好的結(jié)合性能，解決納米材料表面官能團(tuán)、缺陷等對結(jié)合效率、器件性能等的影響。申請發(fā)明專利

53、13項(xiàng)，發(fā)表SCI、EI收錄文章60篇，其中領(lǐng)域內(nèi)頂級期刊發(fā)表文章5篇，培養(yǎng)博士、碩士研究生40名，出版專著1本。主要研究內(nèi)容：1）熒光量子點(diǎn)的制備和表面修飾：利用微波輔助水相量子點(diǎn)制備技術(shù)，進(jìn)一步優(yōu)化半導(dǎo)體量子點(diǎn)的制備條件，實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)的可控生長和組裝，精確控制量子點(diǎn)的生長尺寸和粒徑分布，合成出熒光產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性強(qiáng)、粒徑分布窄的多種結(jié)構(gòu)II-VI族量子點(diǎn)如CdTe/CdS、CdSe/ZnS等。利用瞬態(tài)和靜態(tài)熒光光譜和紫外吸收光譜研究量子點(diǎn)的光物理行為和光化學(xué)穩(wěn)定性。選用適宜的化學(xué)或生物材料修飾量子點(diǎn)，解決納米量子點(diǎn)生物相容性的問題。2）等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)的制備和表面修飾：研究不同微球直徑

54、和厚度的氨基化SiO2膠體晶膜的制備方法。研究在SiO2膠體晶膜微球表面金的沉積機(jī)理以及金納米殼層復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備方法。研究微球直徑、金納米殼層結(jié)構(gòu)厚度和表面裂紋的控制方法，及其對表面拉曼光譜信號(hào)的影響。 3）硅納米線的制備和表面修飾：探索硅材料腐蝕工藝中光、電、溫等影響因素精確控制的新原理和新方法，提高硅材料自停止腐蝕的精度；研究掩模、腐蝕、保護(hù)等關(guān)鍵工藝的相互制約關(guān)系，提高納米線尺寸的可控性，獲得具有良好一致性的硅納米線的批量制造工藝。承擔(dān)單位：南京郵電大學(xué)、東南大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：汪聯(lián)輝學(xué)術(shù)骨干：范曲立、董曉臣、韋瑋、徐麗娜經(jīng)費(fèi)比例：23%課題2：用于肺癌早期檢測的納米探針的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑研究目標(biāo)

55、：闡明納米材料與生物分子的相互作用機(jī)制，建立一種新的納米材料對不同生物分子的納米標(biāo)記方法，構(gòu)建針對肺癌早期檢測的的具有超靈敏度和特異識(shí)別能力的納米探針；申請發(fā)明專利14項(xiàng)，發(fā)表SCI、EI收錄文章60篇，其中領(lǐng)域內(nèi)頂級期刊發(fā)表文章5篇，培養(yǎng)博士、碩士研究生40名。主要研究內(nèi)容：1）量子點(diǎn)與生物分子的偶聯(lián)及識(shí)別功能研究量子點(diǎn)與具有特異選擇或?qū)Ｒ蛔R(shí)別的酶、抗體、avidin、DNA/RNA等生物分子的偶聯(lián)和組裝。除利用分子間作用力、靜電作用實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)與生物分子的有序組裝外，主要擬通過量子點(diǎn)的特定功能團(tuán)與生物分子實(shí)現(xiàn)可控的分子鍵偶聯(lián)。即利用量子點(diǎn)表面上自由功能基團(tuán)如羧基和氨基，在偶聯(lián)試劑作用下與生物

56、分子的氨基、羧基或磷酸基偶聯(lián)。利用這些偶聯(lián)和組裝技術(shù)，構(gòu)建用于針對腫瘤早期檢測的具有超靈敏度和特異識(shí)別能力的“量子點(diǎn)-生物分子”納米生物復(fù)合探針，并對構(gòu)建的探針產(chǎn)物進(jìn)行嚴(yán)格純化和分析；探索復(fù)雜的生物環(huán)境條件如pH、離子強(qiáng)度、鹽濃度等對量子點(diǎn)熒光探針的熒光性能、光和化學(xué)穩(wěn)定性的影響；研究偶聯(lián)方式、偶聯(lián)條件、偶聯(lián)效率（每個(gè)量子點(diǎn)平均偶聯(lián)生物活性分子數(shù)量）等因素對量子點(diǎn)探針識(shí)別能力的影響。2）生物分子在等離子體共振金納米結(jié)構(gòu)上的可控組裝制備滿足生物傳感需要的高質(zhì)量聚苯乙烯有序多孔金納米結(jié)構(gòu)基底，研究實(shí)驗(yàn)條件對其LSPR和SERS性質(zhì)的影響；研究在金納米結(jié)構(gòu)基底的多孔層表面均勻、高效地固定抗體及配基分

57、子的方法，以提高固定效率和固定化抗體及配基分子的穩(wěn)定性；利用LSPR位移檢測抗原-抗體、配基-生物大分子等的結(jié)合過程及結(jié)合容量等，得到生物分子相互作用的標(biāo)準(zhǔn)曲線、結(jié)合常數(shù)及檢測靈敏度等，研究非特異性吸附對分析的影響；利用基于SERS分子獨(dú)特的振動(dòng)能級和相應(yīng)的拉曼指紋圖譜檢測分子信息，并比較兩種檢測方法的結(jié)果。3）生物分子在硅基納米界面上的可控組裝選擇生物識(shí)別探針分子（抗體、核酸等），研究其通過不同的自身攜帶基團(tuán)或衍生的基團(tuán)在硅基納米界面上的定位組裝條件；研究其在界面上的有序性、方向性和三維形態(tài)，探索各種不同性質(zhì)的生物探針在特定環(huán)境中的識(shí)別行為和捕獲行為；研究通過共組裝技術(shù)和界面封閉技術(shù)減少探針

58、分子與硅基納米界面之間的非特異性結(jié)合，優(yōu)化硅基納米生物界面的后處理?xiàng)l件，提高其穩(wěn)定性和耐受性；最終獲取生物識(shí)別探針在一維納米材料界面上實(shí)現(xiàn)可控組裝的若干共性條件。承擔(dān)單位：東南大學(xué)、南京郵電大學(xué)、香港城市大學(xué)深圳研究院課題負(fù)責(zé)人：錢衛(wèi)平學(xué)術(shù)骨干：康學(xué)軍、楊夢甦、趙強(qiáng)、董 健經(jīng)費(fèi)比例：23%課題3：基于納米探針的肺癌早期檢測器件的設(shè)計(jì)和制造研究目標(biāo)：研制出用于肺癌標(biāo)志物（核酸和蛋白）的高靈敏、高特異檢測的納米生物器件，其中基于量子點(diǎn)的納米生物器件可檢測腫瘤組織和血液中的肺癌標(biāo)志物，至少實(shí)現(xiàn)4種肺癌標(biāo)志物的快速聯(lián)合檢測，蛋白靈敏度達(dá)pg/mL，核酸靈敏度達(dá)pM；、表面等離子體共振傳感器和硅納米線傳感器可以檢測單個(gè)生物分子；構(gòu)建完成集成微流控分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)微量肺癌標(biāo)志物的高效富集，以及標(biāo)本的快速電泳分離和檢測；