重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的搖瓶發(fā)酵研究教案

1、2004年12月，第2卷，第12期Dec. 2004, Vol.2 , No. 12西北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)網(wǎng)絡(luò)版）ScienceJournalofNorthwestUniversityOnline重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子的搖瓶發(fā)酵研究馬莉，白泉，王驪麗，斯琴，耿信篤（西北大學(xué)現(xiàn)代分離科學(xué)研究所/現(xiàn)代分離科學(xué)陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710069）摘要：為了優(yōu)化重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子搖瓶發(fā)酵工藝，利用搖瓶法選擇出最佳的rhGM-CSF的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：最佳條件為培養(yǎng)溫度32C,初始pH值7.2；.4,搖床轉(zhuǎn)速200r/min,種子菌齡在OD600為1.0左右時(shí)接種，并在對(duì)數(shù)

2、生長(zhǎng)前期0.5M.8之間誘導(dǎo)4h。在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，在搖瓶中使用M9培養(yǎng)基時(shí)，rhGM-CSF的表達(dá)量占菌體總蛋白的24.3%,OD600達(dá)5.35,說明構(gòu)建的rhGM-CSF工程菌發(fā)酵的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可為rhGM-CSF的大規(guī)模生產(chǎn)提供可靠的放大依據(jù)。關(guān)鍵詞：重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；大腸桿菌；搖瓶發(fā)酵中圖分類號(hào)：TQ920.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-274X（2004）0117-08人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（humangranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,hGM-CSF）是一種重要的造血調(diào)控因子1,對(duì)

3、各種原因尤其是癌癥患者化療后引起的白細(xì)胞減少癥有明顯的療效。由于天然人GM-CSF來源有限，產(chǎn)量甚微，不能滿足科研和臨床的需要，1985年Wong等人克隆了人GM-CSFcDNA,并實(shí)現(xiàn)了表達(dá)2,1993年張智清等人在國(guó)內(nèi)首次克隆了人GM-CSFcDNA,并在大腸桿菌中獲得表達(dá)3。近年來，許多科研人員也致力于這方面的研究，并取得了成功46。本文作者也克隆出了人GM-CSFcDNA,實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。為了進(jìn)一步開發(fā)研究，實(shí)現(xiàn)rhGM-CSF的產(chǎn)業(yè)化，本文以提高其表達(dá)量和細(xì)胞產(chǎn)量為目標(biāo)，對(duì)重組大腸桿菌的搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，確定出最佳生產(chǎn)重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)條件，為以

4、后的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1 材料工程菌：菌種pDH/rhGM-CSF/DH5a,由本所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。試劑：酵母粉（Yeastextract,OXOID公司產(chǎn)品），蛋白月東（Tryptone,OXOID公司產(chǎn)品），瓊脂糖（Agarpowder,日本進(jìn)口分裝公司，上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠），氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、氯化俊均為分析純。收稿日期：2004-06-02審稿人：申煒華，女，西北大學(xué)化學(xué)系副教授。1.2 方法1.2.1 一級(jí)種子的制備選用LB培養(yǎng)基，其組成（g/L）:胰蛋白月東10.0,酵母粉5.0,氯化鈉10.0,氨茉青霉素0.1,

5、pH調(diào)至7.0,1.034M05Pa高壓滅菌20min。將種子接入其中后，于30C,200r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)過夜，OD600達(dá)1.0左右時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)接。1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)選用M9培養(yǎng)基，其組成（g/L）:胰蛋白月東5.0,酵母粉5.0,葡萄糖10.0,Na2HPO412H2O17.1,KH2PO43.0,NaCl0.5,NH4Cl1.0,氨節(jié)青霉素0.1,pH調(diào)至7.2,1.034105Pa高壓滅菌20min。1.2.3 菌體密度的測(cè)定用721型分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD600值。1.2.4 表達(dá)量的測(cè)定取500ML發(fā)酵液離心，棄上清液，向菌體中加樣品緩沖液。其組成為50mmo

6、l/LTris-HCl（pH6.8）,50mmol/LDTT,2%SDS,0.1%澳酚藍(lán)和10%甘油，然后攪拌土!勻，沸水煮5min,離心。走SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色，用Cs-930雙波長(zhǎng)掃描儀（Shimadzu）掃描測(cè)定rhGM-CSF表達(dá)量。2結(jié)果與討論2.1培養(yǎng)溫度對(duì)工程菌生長(zhǎng)的影響微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成都是在各種酶催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)中選擇培養(yǎng)溫度27、30、32、35七進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。時(shí)間/h27C,30C,x32C,35C圖1培養(yǎng)溫度對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)情況的影響Fig.1Effe

7、ctofculturetemperatureonthethegrowthofbacteria從圖1可看出，在27、30和32七培養(yǎng)時(shí)菌體密度均能達(dá)到5.00,但在32七時(shí)為最高。其原因是在較低溫度（如27七）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝緩慢，菌體不能得到充分的增殖，而在較高溫度（如35七）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，雖然生長(zhǎng)迅速，但代謝加快，生產(chǎn)期提前，對(duì)葡萄糖的利用過多，排謝出大量的代謝副產(chǎn)物（如乙酸等），抑制了菌體的生長(zhǎng)，因而菌體密度較低7。所以，以下實(shí)驗(yàn)均控制培養(yǎng)溫度在3032P。2.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)工程菌生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響基因工程菌的兩階段培養(yǎng)法是為了在擴(kuò)大菌體密度的同時(shí)，盡可能提高工程菌的表

8、達(dá)水平，因此誘導(dǎo)時(shí)機(jī)是至關(guān)重要的因素，在研究溫控誘導(dǎo)策略時(shí)應(yīng)先確定最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。圖1顯示出所用大腸桿菌pDH/rhGM-CSF/DH&在32c培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線。從圖1可見：13h為延遲期，OD600剛到0.3左右；410h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600從0.5迅速增加到4.3;1114h為穩(wěn)定期，OD60。變化不大；14h以上為衰亡期，OD600下降。以此為依據(jù)，在不同生長(zhǎng)期（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期、中期和后期），OD600在0.3、0.5、0.8、1.0、2.0左右時(shí)分別升溫至42。誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)4h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。表1誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.1Effectsofi

9、nductiontimeonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF誘導(dǎo)時(shí)OD600菌體密度OD600rhGM-CSF表達(dá)量/%0.353.65216.40.525.19120.80.815.24520.41.104.78313.22.054.23210.1由表1可見：在菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期（OD600=0.52、0.81）進(jìn)行誘導(dǎo)可獲得較高的表達(dá)量，在OD600=0.35時(shí)誘導(dǎo)，由于菌體沒有充分增殖就擔(dān)負(fù)起表達(dá)外源基因產(chǎn)物和分裂后代的雙重任務(wù)，勢(shì)必難以獲得較高的菌體產(chǎn)量，比OD600大約0.5時(shí)誘導(dǎo)的產(chǎn)量低；當(dāng)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期（OD600=1.10、

10、2.05）進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，此時(shí)菌體雖充分增殖，但由于生存環(huán)境已經(jīng)惡化，pH下降，部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少甚至缺乏，使得工程菌的活力衰弱，不能給基因表達(dá)提供大量活力旺盛的細(xì)胞。因此，最好選擇在OD600為0.50.8之間升溫誘導(dǎo)。2.3 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)工程菌生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響采用兩階段培養(yǎng)法，在菌體生長(zhǎng)到OD6000.5時(shí)升溫42c誘導(dǎo)，考察表達(dá)時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)和表達(dá)的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。10海量達(dá)表5 0 5 02 2 1150111111012345678誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間/hOD600,rhGM-CSF表達(dá)量圖2誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響Fig.2Effectsofex

11、pressiontimeonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF由圖2可看出，誘導(dǎo)45h之后，菌體密度與表達(dá)量均達(dá)最大值。這可能是因?yàn)椋赫T導(dǎo)后第23h,細(xì)菌培養(yǎng)物仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌液密度較小，細(xì)菌培養(yǎng)物還在不斷繁殖，故此階段菌體密度和表達(dá)量都處于上升期；誘導(dǎo)45h后，細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度趨于穩(wěn)定，表達(dá)也達(dá)最高；繼續(xù)誘導(dǎo)，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不足，生存環(huán)境已經(jīng)惡化，菌體密度有所下降，表達(dá)量下降幅度較大。2.4pH值對(duì)工程菌生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響培養(yǎng)基的pH值影響培養(yǎng)基中某些物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的

12、吸收和代謝。因此，各種微生物都有最適生長(zhǎng)的pH值范圍，超出這個(gè)范圍，菌體的生長(zhǎng)就會(huì)受到影響甚至停止。在工程菌的搖瓶發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的初始pH值是一個(gè)重要參數(shù)，它對(duì)于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源基因的高效表達(dá)都有影響8。本實(shí)驗(yàn)中采用初始pH值分另為6.67.6的培養(yǎng)基，考察對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。006 Do陛量達(dá)表OD600,rhGM-CSF表達(dá)量圖3培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響Fig.3EffectsofinitialpHofculturemediaonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF從圖

13、3中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始pH值對(duì)工程菌生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響趨勢(shì)基本一致，均有一個(gè)最優(yōu)值，當(dāng)pH為7.2時(shí)，rhGM-CSF的表達(dá)處于最佳，當(dāng)pH在7.4時(shí)的菌體密度最高，表達(dá)量稍稍次之。一般情況下，E.coli表達(dá)外源蛋白的最適pH為6.06.59,而在此優(yōu)化的初始pH在7.2或7.4。這是因?yàn)閾u瓶發(fā)酵過程中，不斷產(chǎn)生乙酸等代謝廢物，使得培養(yǎng)基的pH下降。因此，培養(yǎng)基的初始pH應(yīng)控制在7.27.4。2.5 接種量對(duì)工程菌生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接入適量的種子，由于種子液中含有大量的體外水解酶類，有利于對(duì)基質(zhì)的利用，可以縮短生長(zhǎng)的延遲期，并且

14、使生產(chǎn)菌迅速占據(jù)了整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，可減少雜菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。但是，如果接種量過多，往往使菌體生長(zhǎng)過快，一方面會(huì)使培養(yǎng)液粘度增加，造成溶解氧不足，影響產(chǎn)物的合成，另一方面會(huì)加劇工程菌質(zhì)粒的丟失，使菌體表達(dá)外源蛋白的能力下降10o同樣，如果接種量過小，就會(huì)使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，不利于外源基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中采用不同的比例接種，考察對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.2EffectsofinoculumvolumesonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF接種量/%OD600表達(dá)量/%13.

15、5515.324.2717.935.3421.645.1219.354.8716.9從表2可見，無論從發(fā)酵菌體量還是從rhGM-CSF表達(dá)量上看，當(dāng)接種量為3%時(shí)兩者均為最高，因此采用適當(dāng)?shù)慕臃N量有利于重組菌的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)，以后實(shí)驗(yàn)中采用3%的接種量。2.6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)工程菌生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響如表3所示。表3搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.3EffectsofrotationalspeedonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF轉(zhuǎn)速/rmin-1OD60

16、0rhGM-CSF表達(dá)量/%1404.23516.11604.76418.71805.01620.42005.12522.62205.20521.5表3結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)速的提高，rhGM-CSF菌體密度也提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為220r/min時(shí)，菌體密度最高，而菌體表達(dá)量先增加后降低，轉(zhuǎn)速為200r/min時(shí)表達(dá)最好。這說明轉(zhuǎn)速越高，旋轉(zhuǎn)時(shí)發(fā)酵液與空氣接觸面積越大，氧氣傳質(zhì)越快，供氧量能夠滿足菌體生長(zhǎng)的要求11;當(dāng)轉(zhuǎn)速低時(shí)供氧量不足，菌體生長(zhǎng)緩慢，rhGM-CSF表達(dá)量較低，因此可以提高搖床轉(zhuǎn)速來提高外源蛋白的產(chǎn)量。通常生產(chǎn)中需要考慮的是rhGM-CSF的產(chǎn)量，因此需綜合考慮菌體密度和rhGM-CSF

17、表達(dá)量這兩個(gè)因素作為優(yōu)化指標(biāo)。OD600與細(xì)胞干重成正比，所以用OD600乘以rhGM-CSF表達(dá)量的數(shù)值，表征其產(chǎn)量。200r/min和220r/min時(shí)，該數(shù)值分別為115.8和111.9,可見200r/min優(yōu)于220r/min,所以搖床轉(zhuǎn)速選定在200r/min左右。2.7 種子菌齡對(duì)工程菌生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響種子液質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵的作用，若將過于年輕的種子接入搖瓶中，往往會(huì)出現(xiàn)前期生長(zhǎng)緩慢、整個(gè)發(fā)酵過程周期延長(zhǎng)、產(chǎn)物形成的時(shí)間推遲等現(xiàn)象，甚至?xí)蚓w量過少而在發(fā)酵中結(jié)球，造成異常發(fā)酵。然而，菌齡過老，又會(huì)引起菌種生產(chǎn)能力的下降。因此，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中將不同菌齡的種

18、子液按3%的接種量接于M9培養(yǎng)基中，培養(yǎng)OD600至0.5左右，升溫至42c誘導(dǎo)表達(dá)4h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。表4種子菌齡對(duì)菌體生長(zhǎng)和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.4EffectsofinoculumageonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF種子菌齡OD600終止OD600rhGM-CSF表達(dá)量/%0.54.68916.11.05.13223.81.54.72520.42.04.48918.5由表4可見，種子液OD600在0.5立.0時(shí)，隨種子液濃度增高，發(fā)酵液的終止OD600先升后降，而rhGM-CSF的表達(dá)量亦有一最佳值。綜合考慮細(xì)胞密度

19、和rhGM-CSF的表達(dá)量，選擇種子菌齡的OD600為1.0左右時(shí)較為合適。3結(jié)論通過對(duì)工程菌pDH/rhGM-CSF/DH5口搖瓶發(fā)酵工藝條件的研究，確定出搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度32C；初始pH值7.2；4;搖床轉(zhuǎn)速200r/min；種子菌齡在OD600為1.0左右時(shí)進(jìn)行接種；培養(yǎng)至OD6000.5-0.8,升溫至42c誘導(dǎo)表達(dá)4h。用選定的優(yōu)化條件，發(fā)酵3批，結(jié)果見表5,電泳結(jié)果見圖4,rhGM-CSF的表達(dá)量平均24.3%,平均OD600可達(dá)5.35。由此可見，用我們構(gòu)建的工程菌發(fā)酵的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可為rhGM-CSF的大規(guī)模生產(chǎn)提供可靠的放大依據(jù)。表5優(yōu)化條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)

20、果Tab.5Theexperimentalresultsunderoptimalconditions實(shí)驗(yàn)批次OD600rhGM-CSF表達(dá)量/%15.44524.224.75.23823.95.369平均5.350二0.11224.3二0.4rhGM-CSF圖4搖瓶?jī)?yōu)化條件下SDS-PAGE圖Fig.4TheSDS-PAGEunderoptimalconditionsinshakingflask參考文獻(xiàn)：1 METALFD.Thegranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactorsJ.Science,1985,229:16-22.2 WONGGG,WIT

21、EKJS.HumanGM-CSF:molecularcloningofthecomplement。”DNAandpurificationofthenaturalrecombinantproteinsJ.Science,1985,228：810-815.3張智清，張穎，路秀華，等.人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子cDNA5'端的修飾提高其在大腸桿菌的表達(dá)J.病毒學(xué)報(bào)，1993,9(2):136-143.4王嘉璽，鄒民吉，黃碧蓮，等.人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)J.生物工程學(xué)報(bào)，1995,11(1):33-38.5姚軍，甘人寶，張倩，等.人GM-CSFcDNA的克隆

22、和在大腸桿菌中的表達(dá)J.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1996,28(3):265-271.6段淑敏，李福勝，楊新科，等.大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF發(fā)酵純化工藝研究J.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，1996,9(3):124-128.7劉社際，葛永紅，楊立明.培養(yǎng)溫度對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)密度和rhG-CSF表達(dá)的影響J.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，1999,12(1):29-31.8張嗣良，李凡超.發(fā)酵過程中pH及溶解氧的測(cè)量與控制M.上海：華東化工學(xué)院出版社，1992.9熊宗貴.生物技術(shù)制藥.第1版M.北京：高等教育出版社，1999.90.10曾浩，鄒全明.重組大腸埃希菌發(fā)酵工藝的影響因素及策略J.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志

23、，2003,15(1):57-59.11楊海波，蘇志國(guó).腫瘤壞死因子基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化J.生物學(xué)雜志，1999,16(4):17-19.(編輯張銀玲)AstudyonthefermentationtechnologyofrecombinantE.coliexpressinghumangranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor(hGM-CSF)inshakingflaskMALi,BAIQuan,WANGLi-li,SIQin,GENGXin-du(InstituteofModernSeparationScience,ShaanxiKeyLaboratoryofModernSeparationScience,NorthwestUniversity,Xi'an710069,China)Absract:FermentationtechnologyofrecombinationE.coliexpressinghumangranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor(hGM-CSF)withshakingflaskwasoptimizedforrhGM-CS