微生物大小及數(shù)量的測定

1、微生物大小及數(shù)量的測定、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)并掌握使用顯微鏡測微尺測定微生物大小的方法2、掌握對不同形態(tài)細(xì)菌細(xì)胞大小測定的分類學(xué)根本要求，增強(qiáng)對微生物細(xì) 胞大小的感性認(rèn)識(shí)3、學(xué)習(xí)并掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定微生物細(xì)胞或孢子數(shù)量的方法二、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母2、溶液和試劑香柏油、二甲苯、美蘭染液3、儀器和其他用品 目鏡測微尺、鏡臺(tái)測微尺、普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、軟布、血細(xì)胞計(jì)數(shù) 板、凹載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈、試管、吸管、移液槍三、實(shí)驗(yàn)原理1、測微尺： 微生物大小的測定，需要借助于特殊的測量工具顯微測微尺，它包括 目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺兩個(gè)互相配合使用的部件。鏡臺(tái)測微尺是一

2、個(gè)在特制載玻片中央封固的標(biāo)準(zhǔn)刻尺， 其尺度總長為 1mm， 精確分為 10個(gè)大格，每個(gè)大格又分為是 10個(gè)小格，共 100個(gè)小格，每個(gè)小格長 度為0.01mm，即10卩m?？叹€外有一直徑為© 3，粗線為0.1mm的圓，以便調(diào) 焦時(shí)尋找線條?？叹€上還覆蓋有厚度為0.17mm的蓋玻片，可保護(hù)刻線久用而不 受損傷。鏡臺(tái)測微尺并不直接用來測量細(xì)胞的大小，而是用于校正目鏡測微尺 每一格的相對長度。目鏡測微尺是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻 度，一般有等分為 50 個(gè)小格和 100 個(gè)小格兩種。測量時(shí)，需將其放在接目鏡中 的隔板上， 用以測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。 由于

3、不同顯微鏡或不同的目鏡 和物鏡組合放大倍數(shù)不一樣， 目鏡測微尺每小格在不同條件下所代表的實(shí)際長度 也不一樣。 因此，用目鏡測微尺測量微生物大小時(shí)， 必須先用鏡臺(tái)測微尺進(jìn)行校正，以求出該顯微鏡在一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下， 目鏡測微尺每小格所代表 的相對長度。然后根據(jù)微生物細(xì)胞相當(dāng)于目鏡測微尺的格數(shù)， 即可計(jì)算出細(xì)胞的 實(shí)際大小。球菌用直徑表示大小，桿菌用長和寬來表示大小適臺(tái)測減尺中央罄分) » 20 3 呻咻啊III伽O40904a7DNU«|訓(xùn)|吋|訕川林1川11 1巾|加| "L| 11丿且慣刪渤尺用鎮(zhèn)臺(tái)測微尺校正目覆汕即尸2、顯微鏡計(jì)數(shù)：顯微鏡計(jì)數(shù)是將少量待

4、測樣品的懸浮液置于一種特定的具有確定容積的載 玻片上又稱計(jì)菌器，于顯微鏡下直接觀察、計(jì)數(shù)的方法。目前國內(nèi)外常用的 計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們 可用于各種微生物單細(xì)胞抱子懸液的計(jì)數(shù)，根本原理相同。其中血細(xì)胞計(jì)數(shù) 板較厚，不能用油鏡，常用于個(gè)體相對較大的酵母細(xì)胞、霉菌抱子等的計(jì)數(shù)，而 后兩種計(jì)數(shù)器澆薄，可擁油鏡對細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了使用上 述這些計(jì)菌器外，還有用顆粒濃度的樣品如血液與未知濃度的微生物細(xì)胞樣 品混合后根據(jù)比例推算后者濃度的比例計(jì)數(shù)法。顯微鏡計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快 速、操作簡單，缺點(diǎn)那么是所測得的結(jié)果通

5、常是死菌體和活菌體的總和，且難以對運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)的活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。目前已有一些方法可以克服這些缺點(diǎn)， 如結(jié)合活菌染 色、微室培養(yǎng)以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來到達(dá)只計(jì)數(shù)活菌體的目的，或用染色處理等殺死細(xì)胞以計(jì)數(shù)運(yùn)動(dòng)性細(xì)菌等。 本實(shí)驗(yàn)以常用的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板為例對顯 微計(jì)數(shù)法的具體操作的具體操作進(jìn)行介紹。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片， 其上由4條槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中央較寬 的平臺(tái)又被一短槽橫隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng) 共分成9個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格， 一種是一個(gè)大方格分為25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分為16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分為16個(gè)中

6、方格，而每個(gè)中方格又分為25個(gè)小方格，但無論哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長為 1mm，那么每一個(gè)大方格的面積為1mm23。計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)5個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘 以25或16,就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。以25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例，設(shè)5個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍 數(shù)為B，那么:1ml菌液中的總菌數(shù)=2 5X 25X10% X BO-lOOmm17!mm doacI JV Jk jF血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造3 菌種的選取:微生物細(xì)胞的大小是微生物根本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。從 分

7、類角度來說， 對不同形態(tài)微生物細(xì)胞大小的測量有不同的要求。 例如，球菌是 用直徑范圍表示其大小， 桿菌和螺菌那么是用細(xì)胞的直徑和長度的范圍來表示， 但 桿菌測量的是細(xì)胞的直接長度， 而螺菌測量的是菌體兩端的距離而非細(xì)胞實(shí)際長 度。一般來說， 同種不同個(gè)體的細(xì)菌細(xì)胞直徑的變化范圍較小， 分類學(xué)指標(biāo)價(jià)值 更大，而長度相對來說變化范圍較大。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法適宜對能在液體中均勻分散的微生物細(xì)胞或孢子的數(shù)量 進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。 通常使用的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板不適合使用油鏡， 因此采用個(gè)體較大的 酵母細(xì)胞及霉菌孢子作為實(shí)驗(yàn)材料，以保證實(shí)驗(yàn)的觀察效果。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1菌體大小的測定：1、目鏡測微尺的安裝： 取出目鏡測微

8、尺，把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡 筒內(nèi)的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插回鏡筒內(nèi)。雙目顯微鏡的左目鏡通常配有屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，不能被取下，因此使用雙目 顯微鏡時(shí)目鏡微測尺一班都安裝在右目鏡中。2、校正目鏡測微尺： 將鏡臺(tái)測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺(tái)上。先用低倍鏡觀察，將鏡臺(tái) 測微尺有刻度的局部移至視野中央， 調(diào)節(jié)焦距，當(dāng)清晰地看到鏡臺(tái)測微尺的刻度 后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺(tái)測微尺的刻度平行。 利用推進(jìn)器移動(dòng)鏡 臺(tái)測微尺， 使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合， 然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺(tái) 測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)。用同樣的方法換成高倍顯微鏡和油鏡進(jìn)行校正，分別

9、測出再高倍鏡和油鏡 下，兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。由于鏡臺(tái)測微尺每格長10卩m，根據(jù)以下公示即可分別計(jì)算出在不同 放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每格所代表的的長度。目鏡測微尺每格長度卩m)=兩重合線間鏡臺(tái)測微尺格數(shù)x 10/兩重合線 間鏡臺(tái)測微尺格數(shù)3、菌體大小測定：目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺(tái)測微尺，換上細(xì)菌染色制片。先用低倍 鏡和高倍鏡找到標(biāo)本后， 換油鏡測定釀酒酵母的直徑和枯草芽孢桿菌的寬度和長 度。測定時(shí)， 通過轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測微尺和移動(dòng)載玻片， 測出細(xì)菌直徑或?qū)捄烷L所占目 鏡測微尺的格數(shù)。 最后將所測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺每格所代表的的長度， 即 為該菌的實(shí)際大小。值得注意的是， 和動(dòng)植物

10、一樣， 同一種群中的不同細(xì)菌細(xì)胞之間也存在個(gè)體 差異，因此在測定每一種細(xì)菌細(xì)胞的大小時(shí)應(yīng)至少隨機(jī)選擇 10 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測量， 然后計(jì)算平均值。4、測定完畢： 測量完畢后取出目鏡測微尺，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺(tái) 測微尺分別用擦鏡紙擦干凈，放回盒內(nèi)保存。2顯微鏡計(jì)數(shù)1、菌懸液稀釋：按照實(shí)驗(yàn)所需倍數(shù)稀釋菌懸液，本實(shí)驗(yàn)將釀酒酵母稀釋了 20 倍，得到的適 合計(jì)數(shù)的菌懸液。2、檢查血細(xì)胞計(jì)數(shù)板： 在加樣前，應(yīng)先對血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。 假設(shè)有污物， 可用自來 水沖洗，再用 95%的乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或用電吹風(fēng)吹干。計(jì)數(shù)板上的計(jì)數(shù)室的刻度非常精細(xì)，清洗時(shí)切勿使用刷子等

11、硬物，也不可 用酒精燈火焰烘烤計(jì)數(shù)板。3、加樣品： 將清潔枯燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片， 再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀 酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴， 讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì) 數(shù)室，再用鑷子輕壓蓋玻片， 以免因菌液過多將蓋玻片頂起而改變了計(jì)數(shù)室的容 積。加樣后靜置5min，使細(xì)胞或抱子自然沉降。取樣時(shí)先要搖勻菌液，加樣時(shí) 計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。4、顯微鏡計(jì)數(shù) ： 將加有樣品的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室 所在位置， 然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。 假設(shè)發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀， 需重新調(diào)節(jié)稀 釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)有 5-10 個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)

12、數(shù)室 選5個(gè)中格可選4個(gè)角和中央的1個(gè)中格中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的 菌體一般只數(shù)上方或右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小到達(dá)母細(xì)胞的一半時(shí)， 即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣 品的含菌量。5、清洗:使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及蓋玻片按前面介紹的程序進(jìn)行清洗、枯燥， 放回盒中，以備下次使用。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、目鏡測微尺的標(biāo)定結(jié)果:物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺(tái)測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長度/卩m低倍鏡105510高倍鏡4045112.4油鏡1001112、微生物大小的測定酵母菌大小的測定組別123平均值長度卩m枯草芽抱桿菌大小測定組別123平均值寬

13、度卩m0.80.7長度卩m3、酵母菌數(shù)量的測定稀釋20倍，計(jì)數(shù)板25中格*16小格實(shí)驗(yàn)次數(shù)各中格中菌數(shù)總菌數(shù)稀釋倍數(shù)平均值菌數(shù)個(gè)/mL145231六、實(shí)驗(yàn)小結(jié)：實(shí)驗(yàn)成功應(yīng)注意的事項(xiàng)有：1 、微生物大小測定時(shí)，觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，否那么難以找到鏡臺(tái)測微尺的 刻度；換高倍鏡和油鏡校正時(shí)，務(wù)必十分細(xì)心，防止接物鏡壓壞鏡臺(tái)測微尺和損 壞鏡頭。2、使用鏡臺(tái)測微尺進(jìn)行校正時(shí)，假設(shè)一時(shí)無法直接找到測微尺，可先對刻尺 外的圓圈線進(jìn)行準(zhǔn)焦后再通過移動(dòng)標(biāo)本推進(jìn)器進(jìn)行尋找。3 、細(xì)菌個(gè)體微小，在進(jìn)行細(xì)胞大小測定時(shí)一班應(yīng)盡量使用油鏡， 以減少誤差。4、細(xì)菌在不同的生長時(shí)期細(xì)胞大小有時(shí)會(huì)有較大變化，假設(shè)需自己制樣進(jìn)行細(xì)

14、胞大小測定時(shí)，應(yīng)注意選擇處于對數(shù)生長期的菌體細(xì)胞材料。5 、活細(xì)胞是透明的，因此在進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)或懸滴法觀察時(shí)均應(yīng)適當(dāng)減低視野 寬度，以增大反差。6、進(jìn)行顯微技術(shù)時(shí)應(yīng)先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計(jì)數(shù)室后將其移 至視野中央，再換高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。七、思考題：1 為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測微尺重新對目鏡測 微尺進(jìn)行校正？答：由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實(shí)際表示 的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時(shí)須先用置于鏡臺(tái)上的鏡臺(tái)測 微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。 2在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一細(xì)菌的 大小時(shí)，其測定結(jié)果是否相同？為什么？答：不相同，不同放大倍數(shù)下測量的精度不同。3結(jié)合你的實(shí)