
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文檔簡介
1、精選文檔試驗四 血涂片的制備與染色【目的】 把握血涂片的制備和染色方法(preparation and staining of thin blood films)。【原理】 將一小滴血液均勻涂在玻片上,呈單層緊密分布,制成薄血片。用含天青B和伊紅的Romannowsky類染料進行染色。細胞中的堿性物質(zhì)如RBC中的血紅蛋白及嗜酸性粒細胞胞質(zhì)中的嗜酸性顆粒等與酸性染料伊紅結(jié)合染成紅色;細胞中的酸性物質(zhì)如淋巴細胞胞質(zhì)及嗜堿性粒細胞質(zhì)中的嗜堿性顆粒等與堿性染料亞甲藍結(jié)合染成藍色;中性粒細胞的中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結(jié)合,染成淡紫紅色?!酒鞑摹?載玻片 使用前,必需認真清洗,并用乙醇或軟布清潔
2、。2推片 選擇邊緣光滑的載玻片,在兩角分別作斜線標記,然后用玻璃切割刀裁去兩角,制成約15mm寬度的推片。3吸耳球。4顯微鏡。5酒精燈或Bunsen燈。6采血針。7注射器和針頭?!驹噭?瑞氏(Wright)染液(1)液:包含瑞氏染料1.0g、純甲醇(AR級以上)600ml、甘油15ml。將全部染料放入清潔干燥的乳缽中,先加少量甲醇漸漸地研磨(至少30min),以使染料充分溶解,再加一些甲醇混勻,然后將溶解的部分倒入潔凈的棕色瓶內(nèi),乳缽內(nèi)剩余的未溶解的染料,再加入少許甲醇細研,如此多次研磨,直至染料全部溶解,甲醇用完為止。再加15ml甘油密閉保存。(2)液:磷酸鹽緩沖液(pH6.46.8),包
3、含磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.3g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)0.2g、蒸餾水加至1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH,塞緊瓶口貯存。如無緩沖液可用新穎蒸餾水代替。2吉姆薩染液 包含吉姆薩染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。將吉姆薩染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器內(nèi),每天混勻3次,連續(xù)4天,最終過濾備用。3瑞-吉復合染液(1)I液:包含瑞氏染料1g、吉姆薩染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。將瑞氏染料和吉姆薩染料置潔凈研缽中,加少量甲醇,研磨片刻,再吸出上液。如此連續(xù)幾次,共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中,每天早、晚各搖3min,共5d,以后存放1周即能使用
4、。(2)液:即磷酸鹽緩沖液(pH6.46.8)。包含無水磷酸二氫鉀6.64g、無水磷酸氫二鈉2.56g,加少量蒸餾水溶解,用磷酸鹽調(diào)整pH,加水至1000ml?!緲吮尽?EDTA抗凝靜脈血或末梢血?!静僮鳌?采血 (1)靜脈采血法:用EDTAK2抗凝12h內(nèi)的標本,使用玻棒、毛細管、注射針頭等在距載玻片一端1cm處加1滴抗凝血,直徑約4mm。(2)皮膚采血法:選擇第三、四手指,并先采紅細胞、白細胞計數(shù),再采血1滴置潔凈玻片上用于血涂片制備。2制作涂片 左手平執(zhí)載玻片,或放在類似桌子等平坦地方,右手持推片從后方移動接近血滴,使血液沿推片邊緣開放,將推片與載玻片呈3045角,用均勻速度向前將血液推
5、成厚薄適宜的血涂片(圖1-12),血涂片應呈舌狀,頭、體、尾三部分,且清楚可見。全部血液必需在推片到達末端前用完。貧血病人推片速度要快。圖1-12 血涂片制備示意圖3干燥涂片 (1)空氣干燥:將推好的血涂片在空氣中晃動,使其快速干燥。(2)加熱干燥:握住涂片,在距離酒精燈或Bunsen燈火焰上方50mm處晃動,但不能直接對著火焰。4標記涂片 在載玻片的一端用記號筆編號,注明患者姓名或門診/住院號。5染色(1)瑞氏染色法:待血涂片干透后,用蠟筆在兩端畫線,以防染色時染液外溢。然后將玻片平置于染色架上,滴加染液(I液)35滴,使其快速蓋滿血涂片,約0.51min后,滴加等量或稍多的緩沖液(液),輕
6、輕搖動玻片或用吸球?qū)恃科禋?,使染液充分混合?10min后用流水沖去染液,待干。(2)吉姆薩染色法:將固定的血涂片置于被pH6.46.8磷酸鹽緩沖液稀釋1020倍的吉姆薩染液中,浸染1030min(標本較少可用滴染)。取出用流水沖洗,待干燥后顯微鏡檢查。(3)瑞一吉復合染色法:操作步驟同瑞氏染色法,只是染色時將瑞一吉復合染液液和液替代瑞氏染液的液和液。6觀看結(jié)果 將干燥后的血涂片置顯微鏡下觀看。用低倍鏡觀看血涂片體、尾交界處的血細胞。在顯微鏡下,成熟紅細胞染成粉紅色;血小板染成紫色;中性粒細胞胞質(zhì)染成粉紅色,含紫紅色顆粒;嗜酸性粒細胞含大的桔黃色顆粒;嗜堿性粒細胞胞質(zhì)含有大量深紫藍色顆粒
7、;單核細胞胞質(zhì)染成灰藍色;淋巴細胞胞質(zhì)染成淡藍色?!玖粢馐马棥?1瑞氏染液 新穎配制的染液偏堿,染色效果較差,經(jīng)在室溫下貯存肯定時間,美藍漸漸轉(zhuǎn)變?yōu)樘烨郆后方可使用,這一過程稱染料成熟。放置時間愈久,天青B愈多,染色效果愈好,但必需蓋嚴瓶口,以免甲醇揮發(fā)或氧化成甲酸。甲醇必需用AR(無丙酮)。染液中也可加中性甘油3ml,防止甲醇揮發(fā),使細胞染色較清楚。2采血(1)不能采集以下部位的血液:示指或拇指血液。感染部位血液,如甲溝炎。耳垂部位血液,含單核細胞太多。(2)不能使用肝素抗凝標本。(3)玻片必需清潔、干燥、無塵。新玻片:應在清潔液中浸泡過夜,然后用水沖洗,最終用蒸餾水沖洗。已用過的玻片:應在
8、60清潔液中加熱20min,然后用水沖洗,最終用蒸餾水沖洗。邊緣裂開、表面有劃痕的玻片不能再用。(4)使用玻片時,只能手持玻片邊緣,切勿觸及玻片表面,以保持玻片清潔、干燥、中性、無油膩。3制作涂片 很多因素可影響血涂片的厚度,針對不同患者應有的放矢,對血細胞比容高、血粘度高的患者應接受小血滴、小角度、慢推;而貧血患者則應接受大血滴、大角度、快推。涂片質(zhì)量不佳及可能緣由見表1-1,圖1-13。表1-1 涂片質(zhì)量不佳及可能緣由涂片質(zhì)量不佳可能緣由不規(guī)章間斷和尾部太長推片污染、推片速度不連續(xù)、載玻片太臟有空洞載玻片污染脂肪、油脂白細胞和血小板尾部分布不規(guī)章制片技術(shù)差涂片太長或太短推片角度不佳涂片沒有
9、尾部血滴太大涂片很短血滴太小涂片沒有邊緣空隙推片太寬有細胞退變現(xiàn)象固定延遲、固定時間太短、甲醇污染血涂片厚血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快白細胞破損推片時用力過猛圖1-13 血涂片質(zhì)量比較(A為涂片質(zhì)量好,B、C、D、E、F、G、H、I為涂片質(zhì)量差)4干燥涂片 血涂片干透后方可固定染色,否則細胞尚未堅固地吸附在玻片上,在染色過程中簡潔脫落。5染色步驟(1)操作留意事項及操作不當?shù)暮蠊姳?-3。表1-2 染色操作留意事項及操作不當?shù)暮蠊僮髁粢馐马棽僮鞑划數(shù)暮蠊尤疽簯m量過少則易蒸發(fā)沉淀,一旦染料沉積在血涂片上,則不易沖洗,使細胞深染不易檢查。沖洗時不能先倒掉染液,應以流水沖洗染料鎮(zhèn)
10、靜在血涂片上沖洗時間不能過久脫色沖洗完的血涂片應立放于支架上剩余水分浸泡脫色(2)染色時間與染液濃度、室溫及細胞多少有關(guān)。染液淡、室溫低、細胞多則染色時間要長;反之,可削減染色時間。必要時可增加染液量或延長時間。沖洗前,應先在低倍鏡下觀看有核細胞是否染色清楚,核質(zhì)是否分明。應當在具體實踐中摸索合適的時間,特殊是在更換染液時。每批染色液和緩沖液,均需試染,以便把握染色時間和加緩沖液的比例。6結(jié)果觀看 低倍鏡下觀看血涂片應厚薄適宜,細胞不重疊,頭尾及兩側(cè)有肯定的空隙,一些體積大的特殊細胞常在血涂片的尾部消滅。如有可能,干燥后的血涂片先用中性樹膠封片后再觀看,不僅能長期保存血涂片,而且觀看效果更佳。染色質(zhì)量不佳及緣由見表1-3。表1-3 染色質(zhì)量不佳及可能緣由染色效果可能緣由訂正措施太藍涂片太厚、沖洗時間太短、中性水pH太高、染色時間太長、稀釋染液重復使用、貯存染液暴露于陽光在含1硼酸的95乙醇溶液沖洗2次,用中性水沖洗,待干鏡檢太紅沖洗時間太長、中性水pH太低、貯存染液質(zhì)量不佳、涂
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