測(cè)序結(jié)果分析

1、.abi機(jī)器會(huì)認(rèn)為該處有兩個(gè)峰TT質(zhì)粒污染(Twoplasmid)PCR雜帶測(cè)序結(jié)果為信號(hào)的強(qiáng)弱默認(rèn)的值，種情況會(huì)出現(xiàn)N:有雜合子，有雜峰可用軟件chrosmas打開(kāi)，一種顏色的峰代表一個(gè)堿基，峰的高低表IN表示機(jī)器沒(méi)法判讀是哪種堿基，原因是：雜峰的信號(hào)高于機(jī)器51*5PUT|gFV77THGTNOUT。T。T專(zhuān)曲丁F9r-T6三gJ扃占q金因此不能判斷確定是哪個(gè)峰，需要人工判讀。反應(yīng)已結(jié)束。釘子峰產(chǎn)生的原因是樣品或毛細(xì)管內(nèi)有灰塵等固體小顆粒序列凌亂原因：測(cè)序反應(yīng)失敗。解決辦法：改進(jìn)條件，重做反應(yīng)。注意兩個(gè)關(guān)鍵因素：引物與模板之間的比例：3.2pmol:200ng。模板DNA的純度和用量：1.

2、62.0rC匚二工匯口口七丁。C1FirCTT-CL_T峰特別弱原因：殘余的Dye太多，純化不夠。有測(cè)序反應(yīng)，但效率低下信號(hào)太弱解決辦法：純化充分。避開(kāi)引物峰，確定新的分析起點(diǎn)1、PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)出現(xiàn)重疊峰問(wèn)題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點(diǎn)（1-1）或兩個(gè)位點(diǎn)（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果移碼）解決方法：將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T載體）中挑單克隆測(cè)序，或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序。問(wèn)題圖2（PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長(zhǎng)度不一）解決方法：主要原因是PCR產(chǎn)物沒(méi)有純化，含有部分序列一致的兩種以上長(zhǎng)度不一的片段,將PCR產(chǎn)

3、物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序，便可解決。I可題圖3（測(cè)序引物有堿基缺失）CT7招；CUTtTW；CTCN1TTGCTTCCCG775KG!TCMTC測(cè)序引物有堿基缺失（一般是引物的5端缺失），和模板的堿基缺失即圖1有些類(lèi)似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測(cè)序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測(cè)序一開(kāi)始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開(kāi)始就是嚴(yán)重的峰形重疊。解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化2、克隆測(cè)序時(shí)出現(xiàn)峰形重疊CCGCC13G034CC-GCQ(fGTTCGTTGG-TCT<><3白。TCCCIQQGTCC70

4、H原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測(cè)序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是是送測(cè)序的菌液污染解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質(zhì)?；蛩途涸俅螠y(cè)序。3、樣品有雜合/突變位點(diǎn)AGOCT<3HUCCTHUHOTOTGTG模板中有雜合型突變，也就說(shuō)模板本身在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增出來(lái)的雜合位點(diǎn)。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測(cè)序圖形中其他的位黑占一般都是罩一的峰形，然后突然在某一偃I位黑占出垣重疊峰（如圖中箭所示）。解決方法：建議將DNA片段克隆到載體再測(cè)序。4、polyA/T和C/Gcluster導(dǎo)致的套峰和測(cè)序信號(hào)衰減TTK.TTTMCCCCTrTTCT<JTTrTTTTT(JTTaTaCl-TTTTT-TT7TTTTTTTTT7HCCG：CC：RACE測(cè)序時(shí)經(jīng)常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測(cè)序；或者構(gòu)建載體進(jìn)行測(cè)序。5、基因中含有重復(fù)序列c(7rec；fecicccicccr«rrcccrtcccr:tctxcjrrc:ccctocc:en.e:333bb可能的原因：樣品中含有重彳復(fù)序列導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣，會(huì)導(dǎo)致Frame滑動(dòng)，較短的重彳復(fù)序列會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)移碼；而較