實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的使用和活菌觀察

1、實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的使用和活菌觀察一、目的要求1、了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造。2、學(xué)習(xí)顯微鏡的正確使用維護(hù)。3、學(xué)習(xí)活細(xì)菌形態(tài)的觀察方法。二、實(shí)驗(yàn)說明顯微鏡是微生物研究的工具，顯微鏡種類繁多，有光學(xué)顯微鏡、相差、暗視野、熒光及電子顯微鏡等。 但它們的原理和結(jié)構(gòu)基本相同。下面以普通光學(xué)顯微鏡為例簡要介紹其原理及結(jié)構(gòu)。（一）原理一般顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由兩部分組成（圖1-1）（ 1）成像系統(tǒng)由目鏡（ a）、棱鏡 (b)、物鏡（ c）組成。物鏡將標(biāo)本作第一次放大， 然后目鏡再將第一次放大的實(shí)像作第二次放大。 棱鏡是專為改變光路用的，物鏡光束經(jīng)棱鏡后轉(zhuǎn)向與垂直方向成 45° 角。（ 2）照明系統(tǒng)由聚光鏡

2、（ d）、可變光欄（ e）、集光鏡（ f）和光源（ g）組成。光源可選用自然或人工光源，人工光源由鎢鹵素?zé)舭l(fā)出，經(jīng)集光鏡平行光，然后聚光鏡將外來光線聚在標(biāo)本上，從而照明了標(biāo)本，便于觀察。（二）結(jié)構(gòu)由光學(xué)部分（反光鏡、聚光器、物鏡和目鏡） 和機(jī)械部分（鏡座、鏡筒、鏡臂、轉(zhuǎn)換器、鏡臺、推動器、粗動螺旋和微動螺旋） 組成（圖1-2），主要部分件有：（ 1）目鏡 通常備有 5×、 10×、 16×，一般選用 10×。（ 2）物鏡 它對分辯力有著決定性影響。 一般有低倍鏡（10×）、高倍鏡（ 40×）和油鏡（ 100×），通常按順序安

3、裝在轉(zhuǎn)換器上。（ 3）聚光鏡 具有使樣品明亮的集光作用，同時還影響物像的分辯力和反差， 若將聚光鏡的光圈開放到超過物鏡的數(shù)值孔徑時， 便產(chǎn)生光斑，若收擾光圈，分辯力下降但反差增大。常用聚光鏡為二透鏡， N.A=1.2 ，并帶有可變光欄和濾光片架。（ 4）載物臺 又稱鏡臺，載放樣品用。一般都裝有一個推進(jìn)器，可由移動手輪作橫向或縱向移動載玻片。（ 5）粗調(diào)旋轉(zhuǎn) 是調(diào)節(jié)載物臺或鏡筒上下移動的裝置。細(xì)調(diào)旋扭轉(zhuǎn)動一圈的升降值為 0.2mm，刻值為 0.002 mm。（二）顯微鏡性能1、數(shù)值孔徑顯微鏡分辯力的高低決定于光學(xué)系統(tǒng)的各種條件，但起決定性影響的是物鏡。物鏡的性能可用數(shù)值孔徑（N.A 來表示）。數(shù)

4、值孔徑又叫開口率，它與顯微鏡的分辯力成正比，與焦深成反比，與鏡像亮度平方根成正比。N.A=n.sin a2式中： n物鏡與標(biāo)本間的介質(zhì)折射率。a物鏡的鏡口角，即光源投射到透鏡上的光線和軸之間的最大夾角（圖1-3 ）。事實(shí)上， a 總是小于 180°，所以 sin a的最大值小于 1。由于2空氣的折射率為 1 所以，干燥物鏡的數(shù)值也徑總是小于 1，一般為 0.05-0.95 ，油鏡物鏡如用香柏油（折射率為 1.515 ）作介質(zhì)，則數(shù)值孔徑最大可接近 1.5 。雖理論上數(shù)值孔徑的極限等于所用介質(zhì)的折射率，但實(shí)際上從透鏡的制造技術(shù)看是達(dá)不到的。 退常在實(shí)用范圍內(nèi)，高級油鏡的最大數(shù)值孔徑為

5、1.4 （圖 1-4 ）。2、分辨力 分辨力系指分辨物體細(xì)微結(jié)構(gòu)的能力。通常用（ D）表示， D= ，可見光波長為 0.4-0.8 m，平均為 0.55 m。若2N.A用數(shù)值孔徑為 0.65 的物鏡，則 D= 0.55 =0.44m這表明被檢物體2×0.65或其上某結(jié)構(gòu)在 0.44 或其上某結(jié)構(gòu)在 0.44 m以上時，以上時可被觀察到，若小于 0.44 或其上某結(jié)構(gòu)在 0.44 m以上時，就看不清楚。若用數(shù)值孔徑為 1.25 物鏡，則 D=0.22 或其上某結(jié)構(gòu)在 0.44 m以上時，若被被檢物大于此數(shù)值，即可視見，由此可見 D值愈小，分辨力愈高，物像愈清晰。因此降低波長，增大折射和

6、加大鏡口角可提高分辨力。紫外光顯微鏡和電子顯微鏡就是利用短波光和電子波來提高分辨力以檢視較小的物體。3、放大倍數(shù)顯微鏡放大倍數(shù)（ V）等于物鏡放大率（ V1）和目鏡放大率（ V2）的乘積 V=V2×V2。4、焦深在顯微鏡下觀察一個標(biāo)本時，焦點(diǎn)對在某一像面時，物像最清晰，這像面為目的面。在視野內(nèi)除目的面外，還能在目的面的上面和下面看見物像， 這兩個面之間的距離稱為焦深。 物鏡的焦深和開口率及放大率成反比，即開口率和放大率愈大，焦深愈小。因此調(diào)節(jié)高倍鏡比調(diào)節(jié)低倍鏡要仔細(xì)，否則容易使物像滑過而找不到。三、實(shí)驗(yàn)器材顯微鏡、載玻片、蓋玻片、酒精燈、接種環(huán)、凹玻片、香柏油、二甲苯。培養(yǎng) 24-3

7、6h 的枯草芽孢桿菌斜面菌種、酵母菌標(biāo)本片、細(xì)菌標(biāo)本片。四、實(shí)驗(yàn)方法步驟（一）顯微鏡使用1、取鏡打開鏡箱、右手握住鏡臂，取出顯微鏡，用左手托住鏡座放于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺上。鏡檢者姿勢應(yīng)端正，一般左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄。觀察時兩眼必須同時睜開，以減少疲勞。2、調(diào)光一般采用散射光，如光線弱時可用日光燈光作光源。（ 1）將低倍鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭與載玻臺相距 0.5cm。（ 2）左眼看目鏡，觀察光源強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)反光鏡（一般用平面鏡，若光線弱時可用凹面鏡）、光圈與升降聚光鏡使視野內(nèi)光線均勻明亮。若用顯微鏡燈，則調(diào)節(jié)光源開關(guān)、光圈及升降聚光鏡即可。3、低倍鏡觀察將待測標(biāo)本置載物臺上，用卡尺

8、夾住，移動推動器，使觀察標(biāo)本處于物鏡正下方。轉(zhuǎn)動粗螺旋，使載物臺上升（或鏡筒下降）至距標(biāo)本 0.5cm 處，由目鏡觀察，然后慢慢下降載物臺 （或上升鏡筒）直至出現(xiàn)模糊像后，用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)至物像清晰為止。4、高倍鏡觀察低倍鏡觀察至清晰物像后，將觀察的部位移至視野中央，轉(zhuǎn)換高低鏡，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)至物像清晰。5、油鏡觀察（ 1）在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴一滴香柏油，然后將油鏡轉(zhuǎn)至正下方（ 2）小心上升鏡臺（或下降鏡筒），從側(cè)面注視鏡頭慢慢浸在香柏油中，幾乎與標(biāo)本相碰。應(yīng)特別小心不能將油鏡鏡頭壓在標(biāo)本上，更不能用力過猛以免壓碎玻片或損壞鏡頭。（ 30 由目鏡觀察，全開虹彩光圈，調(diào)節(jié)光源使視野光線達(dá)到最亮。

9、（ 4）慢慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，直至視野出現(xiàn)模糊物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)至清晰。 如油鏡頭已離開油層而未見物像時， 必須重復(fù)上述步驟。（ 5）觀察完畢，下降載物臺。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用一張擦鏡紙沾少許二甲苯， 擦去鏡頭上殘留油跡， 最后用一張擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。 切忌用手或其它紙擦鏡頭， 沾有香柏油的載玻片用廢紙將油擦干，放在指定的地方以便統(tǒng)一處理。（ 6）用細(xì)菌和酵母菌標(biāo)本片分別在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察。（二）活細(xì)菌觀察生活的細(xì)菌在顯微鏡下是透明的， 不易觀察。因此觀察時應(yīng)減弱光照、增加反差，才能獲得較好的效果。如果光照很強(qiáng)，細(xì)菌和周圍液體的差別就難以辯別。觀察活細(xì)菌常用下面兩種方法。1、取凹玻片一塊放在實(shí)驗(yàn)臺上，用尖頭鑷夾蓋玻片一塊平放桌上, 滴一小滴蒸餾水于蓋玻片中央 , 用無菌操作方法取少許菌體放在水滴中 , 小心地把蓋玻片翻轉(zhuǎn)過來 ., 使水滴懸在蓋玻片底下 , 再把它放在凹玻片的凹窩上， 輕輕地按一下， 使其和凡士林粘緊使水滴剛好懸在凹窩中（圖 1-5 ）。鏡檢時，先用低倍鏡對著水滴的邊沿， 用粗螺旋慢慢下降載物臺（或提升鏡筒）。由于水滴與玻片的折射率不同，這樣就容易調(diào)節(jié)好焦距，便于找到菌體。然后轉(zhuǎn)高倍鏡，用微動螺旋仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距，觀察活細(xì)菌的運(yùn)動和形態(tài)