試驗論文綜述123

1、白花丹中白花丹素-銅與牛血清蛋白作用研究綜述1 .簡介：蛋白質(zhì)是人體及體內(nèi)一切細(xì)胞的基本構(gòu)成物質(zhì)，是物質(zhì)性狀的直接表達(dá)者。血清蛋白最顯著的特征就是：作為內(nèi)源和外源性物質(zhì)的儲存和運輸性蛋白，而外源性物質(zhì)中能與血清蛋白緊密結(jié)合的物質(zhì)就是有機(jī)小分子。研究蛋白質(zhì)與配體分子之間的作用機(jī)理和作用過程，了解在小分子物質(zhì)作用下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的變化，是目前生命科學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的課題。牛血清蛋白（BSQ與人血7#蛋白（HSq具有相似的序列和構(gòu)象，因此BSA成為研究藥物與蛋白相互作用的最佳底物。通過光譜法研究小分子配合物與BSA作用的生物活性、藥物活性和化學(xué)活性具有重要意義。白花丹為自然界的植物，為多民

2、族藥材，在民間應(yīng)用廣泛。近年來，隨著生命科學(xué)、配位化學(xué)、生物無機(jī)化學(xué)和天然藥物化學(xué)之間的交叉作用，對天然藥物有效成分的金屬配合物研究受到關(guān)注。低毒、高效的金屬配合物為小有機(jī)分子，研究蛋白質(zhì)與這種有機(jī)小分子金屬配合物的作用機(jī)理將有重大意義。熒光和紫外可見光譜法是研究生物大分子，特別是蛋白質(zhì)與各種有機(jī)小分子、離子和無機(jī)化合物相互作用的重要手段。通過對熒光特征峰及其在不同條件下的位移情況、熒光偏振、同步熒光、能量轉(zhuǎn)移效率、熒光壽命、熒光猝滅、熒光增強(qiáng)等的研究，可以獲得蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的種類、結(jié)構(gòu)和所處微環(huán)境及其分布情況等有用信息，同時還可以得到外源物質(zhì)與生物大分子相互作用的有關(guān)數(shù)據(jù)。2 .方

3、法與結(jié)果：2.1 蔡青青、聶偉1等采用紅外光譜法分析鉛與牛血清蛋白的作用，此試驗使用NicoletFTIR170XkBr壓片，掃描范圍是5004000em，對各個反應(yīng)體系進(jìn)行紅外檢測。從紅外光譜圖的分析，得由Pb對就牛血清蛋白的光譜性質(zhì)有重要影響，鉛能使BSA勺羥基位置產(chǎn)生紅移現(xiàn)象，蛋白質(zhì)上的O-H,CH,，-CH:都有可能是鉛的作用位置，即鉛與牛血清蛋白能發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，產(chǎn)生多種大分子絡(luò)合物。2.2 楊昌英、劉義2等用光譜法研究了阻噪美辛、舒林酸及其金屬配合物與牛血清蛋白的相互作用。他們以曙紅Y(EosinY)為探針，采用競爭結(jié)合法考查了非雷體抗炎藥回噪美辛和舒林酸及其相關(guān)的金屬配合物與BSA

4、勺結(jié)合。在中性環(huán)境中，曙紅Y的吸收光譜隨著BSA勺加入發(fā)生明顯變化，結(jié)果表明，曙紅Y與BSA1間的結(jié)合以靜電作用為主，兩者之間可能發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。曙紅Y與BSA吉合后，抗炎藥回噪美辛，舒林酸的加入可以破壞這種結(jié)合，曙紅Y部分游離由來，其吸收值恢復(fù)，說明藥物可以同樣的方式結(jié)合到BSAh,搶占曙紅Y在BSAk的結(jié)合位點。將藥物車化為金屬配合物后，與血清蛋白的親和程度更強(qiáng)，銅(n)的配合物最為突生,推測將非雷體抗炎藥轉(zhuǎn)化為銅配合物后，有更好的藥理活性。2.3 黎泓波、王興明3采用UV-Vis光譜法研究了pH=4-28的緩沖溶液中茜素紅S（ARS）-Al（田）配合物與牛血清蛋白（BSA）的結(jié)合反應(yīng).用p

5、H428的B-R緩沖溶液配制一定物質(zhì)的量濃度BSAARSffiAl（田）溶液；在一系列10mL比色管中,分別加入一定量的上述BSAARSF口Al（田）溶液，以pH4-28的B-R緩沖溶3定容，搖勻，放置4h,以B-R緩沖溶液為參比，掃描吸收光譜；應(yīng)用平衡透析物質(zhì)的量比法、普通物質(zhì)的量比法和雙波長法等方法，以相應(yīng)B-R緩沖溶液為參比，掃描吸收光譜或測定吸光度.研究發(fā)現(xiàn)，ARS-Al（m）-BSA的最大吸收波長為510nm,比ARS1移82nm,比ARS-BSA1移75nm,比ARS-Al（m）配合物紅移74nm.ARS-Al（田）-BSA三元配合物的結(jié)合比為nARS：nAl（田）：nBSA=6：

6、4：1,物質(zhì)的量吸光系數(shù)£為265X104L-mol-1cm-1,ARS-Al（田）配合物與BSA乍用的條件平衡常數(shù)K為880X108Lmol-1.ARS-Al（田）配合物與BSAi間的作用力主要為配位鍵和電荷力.2.4 肖厚榮，盛良全4等應(yīng)用熒光光譜研究了水楊酸與牛血清蛋白（BSA）分子間的相互作用。移取2mL80X10-6molL-1的BSA于1cm石英比色池中，用微量注射器（范圍：15以L）或可調(diào)式移液管逐次加入2,4,8,16,24,32,72以L的水楊酸溶液進(jìn)行熒光滴定，每次加入溶液后混合均勻，在30c下作用10min,以282nm為激發(fā)波長,在M-850型熒光分光光度計上

7、記錄300500nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。研究表明：水楊酸對BSA內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)制屬于形成化合物所引起的靜態(tài)猝滅，猝滅常數(shù)Ksv為1097X104（molL-1）-1;水楊酸與BSA反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)為7377X104,結(jié)合位點數(shù)為1,當(dāng)水楊酸濃度較低（摩爾比小于1:1）時，它與Trp殘基或其附近基團(tuán)結(jié)合但并不引起Trp殘基微環(huán)境的改變；根據(jù)Frster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，計算了授體-受體間的結(jié)合距離和能量轉(zhuǎn)移效率。2.5 羅紅斌、張靜5等應(yīng)用熒光光譜研究了巖白菜素與牛血清白蛋白（BSA）分子間的相互作用。移取2mL2.5X10-6mol,L-1的BSA于1cm石英比色池中，用可調(diào)式移液器逐次加

8、入2,4,8,10,16,20,，100以L的巖白菜素溶液進(jìn)行熒光滴定，每次加入溶液后混合均勻，在30c下作用10min,以292nm為激發(fā)波長，在M2850型熒光分光光度計上記錄300500nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。結(jié)果表明，巖白菜素對BSA內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)制屬于形成化合物所引起的靜態(tài)猝滅，猝滅常數(shù)Ksv為1.905X104Lmol-1;巖白菜素與BSA反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)為2.083X104,結(jié)合位點數(shù)為1.由熱力學(xué)參數(shù)確定了巖白菜素與牛血清白蛋白的結(jié)合作用主要為靜電作用.實驗還發(fā)現(xiàn)隨著巖白菜素的加入,BSA的猝滅值與巖白菜素濃度在1.5X10-51.5X10-4molL-1的范圍內(nèi)呈良好的線性

9、關(guān)系，檢由限2.0X10-6molL-1,可用于巖白菜素的測定。2.6 杜娜娜、張坤等用紫外吸收光譜和熒光光譜研究了異煙肺（INH）與牛血清蛋白（BSA）的相互作用。2.6.1 紫外吸收光譜的測定取2只1cm的比色皿，樣品池中加入1mL1x10-5molL-1BSA和1mL0.1molL-1pH=8.0的緩沖液，參比池中加入1mL二次蒸播水和1mL0.1mol,L-1pH=8.0的緩沖液，然后向2只比色皿中依次用微量注射器加入不同量的INH并攪勻，5min后記錄室溫下BSA在190330nm的紫外吸收光譜.取2只1cm的比色皿，樣品池中加入3.5mL0.065mg-mL-1的BSA溶液（相應(yīng)的

10、緩沖溶液配制）,參比池中加入3.5mL不同酸度的緩沖溶液作空白，然后在2只比色皿中分別用微量注射器加入10以L0.48mgmL-1的INH并攪勻，自樣品池中加入INH開始計時，于230nm進(jìn)行動力學(xué)掃描，獲得相互作用的動力學(xué)曲線.2.6.2 熒光光譜的測定取一只1cm的比色皿，加入0.2mLBSA儲備液及2.0mLpH=8.0的緩沖液，用微量注射器依次加入不同量的INH儲備液并攪勻，測量時選擇的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為280nm和340nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10nm,相互作用5min,測量25C、30c下BSA的熒光光譜.2.6.3 INH與BSA的同步熒光測定用2.6.2同樣的25c的測試

11、體系，固定激發(fā)和發(fā)射波長間隔A入分別為20nm和60nm,相互作用5min,記錄同步熒光光譜.熒光光譜表明，INH對BSA的熒光有較強(qiáng)的猝滅作用.通過結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)的計算，證明這種熒光猝滅機(jī)理符合靜態(tài)機(jī)制，INH和BSA形成了1：1穩(wěn)定復(fù)合物；考察不同溫度和酸度下的猝滅作用，進(jìn)一步證實其靜態(tài)猝滅行為和疏水作用機(jī)制,紫外吸收光譜和同步熒光光譜表明，INH與BSA的相互作用使蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象發(fā)生變化，而同步熒光光譜顯示兩者的結(jié)合位點更接近于色氨酸.2.7 玄光善、吳效楠7等應(yīng)用熒光光譜法研究了乙酰水楊酸和牛血清蛋白（BSA）分子間的相互作用。在10mL容量瓶中，依次加入1g/L的BSA溶液0

12、.8mL和不同量的10-3mol/L乙酰水楊酸溶液，隨后加入5mL醋酸緩沖溶液并用蒸儲水稀釋到刻度。以285nm為激發(fā)波長，記錄在300450nm波長范圍的發(fā)射光譜。研究表明乙酰水楊酸可猝滅BSA的熒光，同時自身的熒光增強(qiáng)并存在一個等發(fā)射點，表明兩者之間形成穩(wěn)定的復(fù)合物并發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。乙酰水楊酸和BSA分子間的結(jié)合常數(shù)為1.35X103,結(jié)合數(shù)0.87,靜電引力是結(jié)合反應(yīng)的主要的作用力。同時觀察了乙酰水楊酸的加入對BSA構(gòu)象的影響。對于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜，A入=15nm時只顯示酪氨酸殘基的光譜特性，而由A入=60nm時僅表現(xiàn)色氨酸殘基的光譜特性。因為殘基的最大吸收波長與其所處的環(huán)境有關(guān)，因此

13、由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)想的變化。BSA和乙酰水楊酸的混合溶液的同步熒光光譜表明僅有BSA酪氨酸的殘基的熒光強(qiáng)度降低而沒有發(fā)射波長的位移，對A入=60nm時也有類似的情況。說明乙酰水楊酸的加入對BSA的構(gòu)象幾乎沒有改變。2.8 陳克海、王玉蓮8等用紫外、熒光和圓二色光譜研究了不同溫度下長春新堿（VCR）與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用。8.1熒光光譜的測定取2.5mL5XlO-6rno卜L-1的BSA§液（用O.05molL_1Tris_Ha緩沖液配制，內(nèi)含o.1Ino卜L-1Nacl,pH7.40）加入到光徑為10mm勺石英比色池中，依次加入一定體積的VC曲液進(jìn)行熒光滴

14、定（總體積小于80正，），輕輕搖勻，296K寸靜置3IIlino以280nnl為激發(fā)波長，選擇合適的狹縫寬度，在熒光分光光度計上記錄285450啪波長范圍的熒光發(fā)射光譜。303和310K按同樣的方法處理。2.8.2圓二色光譜（CD）的測定移取300肛L5X106m01.L_1BsA溶液到光徑為1mm的圓形比色池中，用微量進(jìn)樣器加入適量的vCR容液,296K靜置作用3mh,在CDk測定200260m范圍內(nèi)的圓二色譜。掃描速度為20魁min，響應(yīng)時間為4s。通過熒光猝滅數(shù)據(jù)算得在296,303和310K寸，vcR與BSA的猝滅常數(shù)KW分別為2.0X104,1.7X104和1.5X104L-Inol

15、-1,結(jié)合常數(shù)Ko分別為1.5X104,9.5X103和4.9X103Lmol-1,結(jié)合位點數(shù)分別為o.9786,0.949。和O.8911,表明VC電BSA可具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，但結(jié)合能隨著溫度的升高而降低，是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。圓二色光譜(CD)數(shù)據(jù)表明相互作用后BsA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變：BSA勺口-螺旋的含量從33.5%下降到29.7%,p折疊的含量從13.6%升高到18.4%。通過Van'tHoff方程，計算由熱力學(xué)常數(shù)始變(力和嫡變(4切分別為：一62.7kJmol-1和一129.38J(rnorlK)一，表明氫鍵和范德華力在VC電BSA吉合中處于主導(dǎo)作用。2.9王興明、

16、董發(fā)勤9等研究了鋅試劑一Cu(11)金屬配合物與牛血清蛋白作用。在一系列10mL:匕色管中，分別加入一定量的ZCNCu(1)、BSA§液(3種溶液均分別用系列B-Rg沖溶7配制)，以相應(yīng)B-Rg沖溶液定容，搖勻，放置5min,以水為參比，測定其吸收光譜。在一系列10mL:匕色管中，分別加入一定的量ZCNCu(1)、BS烯液(3種溶液均用pH4.25的B一磁沖溶7配制)，以pH4.25的B裱沖溶液定容，搖勻，放置5rain,應(yīng)用摩爾比法、雙波長法等，以水或試劑空白為參比，測定其吸收光譜或吸光度。綜上所述，ZCWCu(1)金屬配合物與BSA&pH4.25的緩沖溶液中以分子間靜電引

17、力為主、分子間疏水力為輔結(jié)合形成三元藍(lán)色締合物，最大吸收峰發(fā)生了明顯的紅移。同時，電子轉(zhuǎn)移配合物的形成，也是ZCNCu(n)BSAE元締合物的吸收峰較明顯紅移的重要原因。根據(jù)結(jié)合數(shù)和條件結(jié)合常數(shù)的測定結(jié)果，可推測ZCN-Cu(1)金屬配合物在BSA#子中的作用位點。認(rèn)為5個ZCN-Cu(1)金屬配離子(每個帶2個單位的負(fù)電荷)可與2個BS吩子結(jié)合，即每個ZCN-Cu(1)金屬配離子與2分子蛋白質(zhì)結(jié)合。每個蛋白質(zhì)分子的作用位點為5個部位，一是BS吩子中的質(zhì)子化而帶正電荷的精氨酸的服基、脯氨酸的叱咯基和組氨酸的咪嚏基，二是BS的子中水溶性較差的氨基被質(zhì)子化的酪氨酸和胱氨酸分別與ZCN-Cu(1)金

18、屬配離子中的苯基以疏水力靠近，并導(dǎo)致兩者靜電引力的產(chǎn)生和增強(qiáng)(發(fā)色基團(tuán)基本無變化)。摩爾比法和雙波長法測定的結(jié)果基本一致，該研究結(jié)果對于進(jìn)一步探索BSA的性能、構(gòu)象及其定量測定具有重要參考價值。3、參考文獻(xiàn)1蔡青青h,聶偉，梁瑩h,董鐵有鉛與牛血清蛋白的相互作用及模擬透析性能1.河南科技大學(xué)a.化工與制藥學(xué)院；b.環(huán)境工程研究所，河南洛陽471003;2,鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南鄭州4500012楊昌英劉義朱軍成劉松秀光譜法研究呷深美辛，舒林酸及其金屬配合物與牛血清蛋白的相互作用1（三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，宜昌443002）2（武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,武漢430072）3黎泓波1,王興明1,劉海萍1,董發(fā)勤1,康明1,丁立生2茜素紅S-Al（田）配合物與牛