一株牡丹內生解淀粉芽胞桿菌、其分離方法及應用

1、說 明 書 摘 要本發(fā)明公開了一株牡丹內生解淀粉芽胞桿菌、其分離方法及應用，所述的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15已于2016年1 月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號是GDMCC NO ：60008。本發(fā)明分離篩選提供的牡丹內生解淀粉芽胞桿菌是一株優(yōu)良的植物內生防病促生菌，該菌株的發(fā)酵液對盆栽牡丹具有良好的防病作用，同時有具有較好的促生作用，該生防菌株兼具防病和促生作用，通過在牡丹溫室栽培上的應用，既可以改善牡丹的生長狀況，又可以有效的控制病害的發(fā)生率。本發(fā)明改變了牡丹病害的傳統(tǒng)防治方法，采用生物防治的方法進行牡丹病害的防治，可以

2、減少化學防治對土壤及環(huán)境造成的傷害，同時降低牡丹灰霉病菌抗藥性的產生，降低牡丹栽培管理中用于病害防治的成本。摘 要 附 圖權 利 要 求 書1. 一株解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15，該菌株已于2016年1 月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號是GDMCC NO ：60008。2. 一種分離純化解淀粉芽胞桿菌的方法，其特征在于包括：步驟1：從生長狀態(tài)良好的牡丹根上剝取根皮，之后在無菌條件下用質量百分比濃度為70%的酒精浸泡，之后將根皮消毒、沖洗，在確定所述的消毒方法有效后將根皮晾干作為樣品，備用；步驟2：將樣品放入無菌研缽中研磨成勻

3、漿，之后向勻漿中加入無菌水，混勻后靜置制得混合液，備用；步驟3：把混合液轉入大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上，在溫度為30的條件下培養(yǎng)2天后，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上純化，即獲得所述的解淀粉芽胞桿菌。3. 根據(jù)權利要求2所述分離純化解淀粉芽胞桿菌的方法，其特征在于：步驟1中消毒根皮的方法是將根皮置于質量百分比濃度為20%的次氯酸鈉中消毒5-10min。4. 根據(jù)權利要求2所述分離純化解淀粉芽胞桿菌的方法，其特征在于：確定所述消毒有效的方法是隨機抽取消毒后的根皮置于TSA平板上培養(yǎng)，48h后觀察TSA平板，若培養(yǎng)基上沒有菌落生成，則消毒有效；若培養(yǎng)基上有菌落生成，則消毒無效。5.

4、 一種測定解淀粉芽胞桿菌對牡丹灰霉病菌拮抗作用的方法，其特征在于包括：確定實驗組和對照組，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）中央處接種牡丹病原灰霉菌菌絲塊，其中，實驗組在距培養(yǎng)皿邊緣處對稱點接解淀粉芽胞桿菌，對照組只接病原菌菌絲塊，在溫度為28°C的條件下恒溫培養(yǎng)5天后，待對照組菌絲長滿平板時，測量實驗組的抑菌帶寬度，根據(jù)抑菌帶寬度的大小確定解淀粉芽胞桿菌對牡丹灰霉病菌拮抗作用的強弱。6. 如權利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌在防治盆栽牡丹灰霉病菌中的應用。7. 一株防治牡丹灰霉病菌的生防菌，其特征在于包括權利要求1-6中任一項所述的解淀粉芽胞桿菌。1說 明 書一株牡丹內生解淀粉芽胞桿菌、其

5、分離方法及應用技術領域發(fā)明創(chuàng)造明屬于生物技術領域，特別涉及一種牡丹內生解淀粉芽胞桿菌、其分離方法及應用。背景技術河南洛陽是牡丹栽培面積最大、種質資源最豐富、以牡丹觀賞和藥用為一體的規(guī)?；a業(yè)化研究基地。隨著牡丹栽培面積的迅速擴展與品種的增多，牡丹病害種類逐年增多，危害愈來愈重。由于牡丹病害的蔓延造成大量牡丹植株長勢衰弱、花色衰退、丹皮產量低、品質差、造成了人力、物力與財力的嚴重浪費，是牡丹栽培中急需解決的問題。目前危害牡丹的病害主要包括牡丹灰霉病、牡丹紅斑病、牡丹黑斑病和牡丹根腐病等，目前病害的防治主要以化學防治為主，但是使用藥劑不僅污染環(huán)境，而且容易導致病菌產生抗藥性，而不得不每年增加化學

6、藥劑的使用，從而導致防治成本累年增加，造成人力、物力和財力的極大浪費。因此，開辟新的防病措施已成為當務之急，而生物防治以其無毒無殘留等優(yōu)點給牡丹病害的防治帶來新的希望。近年來研究表明，植物內生細菌對植物病原菌具有較好的抑制作用，這些內生細菌不僅能穩(wěn)定定殖于植物體內，不易受外界環(huán)境的影響，而且對植物具有固氮、促生、抗旱等生物功能。利用內生細菌對植物病害進行生物防治，一方面能夠避免使用化學殺菌劑在殺死病原菌的同時可能殺死在環(huán)境中起重要作用的非靶標微生物，另一方面可以避免使用其他生物菌肥帶來的植物根際土壤微生態(tài)平衡的破壞，從而促進植物對惡劣環(huán)境的適應和保證寄主植物健康生長。因此，植物內生細菌作為新的

7、生防資源，發(fā)展迅速，成為當前植物病害生物防治研究的熱點。由于目前關于牡丹內生細菌的研究非常有限，同時關于牡丹病害生物防治的研究較少，因此在實際生產中，牡丹病害的防治仍舊以傳統(tǒng)的防治方法為主，造成牡丹病害防治成本的累年增加，因此迫切需要為牡丹病害的防治尋找新途徑和新方法。由于內生細菌定殖于植物內部，所以牡丹內生細菌是理想的候選生防菌。目前植物內生菌研究已成為國內外研究的熱點，而有關牡丹內生細菌的防病促生作用未見報道。發(fā)明內容本發(fā)明的主要目的在于提供一株牡丹內生解淀粉芽胞桿菌、其分離方法及應用，以克服現(xiàn)有技術中的不足。為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案包括：一種解淀粉芽胞桿菌（Bacillu

8、s amyloliquefaciens）Mdgb15，該菌株已于2016年1 月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，其保藏號是GDMCC NO ：60008。本發(fā)明提出了一種分離純化解淀粉芽胞桿菌的方法，包括：步驟1：從生長狀態(tài)良好的牡丹根上剝取根皮，之后在無菌條件下用質量百分比濃度為70%的酒精浸泡，之后將根皮消毒、沖洗，在確定所述的消毒方法有效后將根皮晾干作為樣品，備用；步驟2：將樣品放入無菌研缽中研磨成勻漿，之后向勻漿中加入無菌水，混勻后靜置制得混合液，備用；步驟3：把混合液轉入胰蛋白胨培養(yǎng)基（TSA）平板上，在溫度為30的條件下培養(yǎng)2天后，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上純化，即

9、獲得所述的解淀粉芽胞桿菌。在一些較為具體的實施方案之中，步驟1中消毒根皮的方法是將根皮置于質量百分比濃度為20%的次氯酸鈉中消毒5-10min。在一些較為具體的實施方案之中，確定所述消毒有效的方法是隨機抽取消毒后的根皮置于TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，48h后觀察TSA培養(yǎng)基，若培養(yǎng)基上沒有菌落生成，則消毒有效；若培養(yǎng)基上有菌落生成，則消毒無效。本發(fā)明還提出了一種測定解淀粉芽胞桿菌對牡丹灰霉病菌拮抗作用的方法，包括：確定實驗組和對照組，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）中央處接種牡丹病原灰霉菌菌絲塊，其中，實驗組在距培養(yǎng)皿邊緣處對稱點接解淀粉芽胞桿菌，對照組只接病原菌菌絲塊，在溫度為28°C的條件

10、下恒溫培養(yǎng)5天后，待對照組菌絲長滿平板時，測量實驗組的抑菌帶寬度，根據(jù)抑菌帶寬度的大小確定解淀粉芽胞桿菌對牡丹灰霉病菌拮抗作用的強弱。本發(fā)明還提出了將所述的解淀粉芽胞桿菌在防治牡丹灰霉病菌中的應用。此外，本發(fā)明還提供了一株防治牡丹灰霉病菌的生防菌，包括所述的解淀粉芽胞桿菌。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點包括：1. 本發(fā)明分離篩選提供的牡丹內生細菌解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15 GDMCC NO ：60008 是一種優(yōu)良的內生防病促生菌，該菌株的發(fā)酵液對盆栽牡丹具有良好的防病作用，同時有具有較好的促生作用，該生防菌株兼具防病和促生作用，通過在牡丹

11、溫室栽培上的應用，既可以改善牡丹的生長狀況，又可以有效的控制病害的發(fā)生率，具有良好的技術效果。2. 本發(fā)明改變牡丹病害傳統(tǒng)的防治方法，采用生物防治的方法進行牡丹病害的防治，可以減少化學防治對土壤及環(huán)境造成的傷害，同時降低牡丹灰霉病菌抗藥性的產生，降低牡丹栽培管理中用于病害防治的成本。3. 本發(fā)明提供的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15培養(yǎng)條件簡單、繁殖速度快、容易保存，易于工業(yè)化生產，具有良好的開發(fā)應用前景。附圖說明圖1是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株的菌落特征和菌體特征。其中，A圖是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株的菌落特征，B 圖是菌體革蘭氏染

12、色結果，C圖是芽孢染色結果；圖2是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株對牡丹灰霉病菌的拮抗作用結果圖。其中，A圖是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株，B 圖是對照（CK）；圖3 是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株發(fā)酵液對對離體牡丹葉片灰霉病菌的抑制作用結果圖。其中，A圖是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株發(fā)酵液，B 圖是清水對照（CK）；圖4 是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株發(fā)酵條件優(yōu)化后對灰霉病菌的拮抗作用結果圖。其中，A 圖是發(fā)酵條件優(yōu)化后，B 圖是發(fā)酵條件優(yōu)化前；圖5 是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株發(fā)酵液對盆栽牡丹防治結果圖。其中，A圖為澆灌解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株發(fā)酵液的盆栽牡丹，B圖為澆灌清

13、水的盆栽牡丹；圖6 是解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株發(fā)酵液對盆栽牡丹促生長作用結果圖。其中，A圖澆灌解淀粉芽胞桿菌Mdgb15菌株發(fā)酵液的牡丹根系，B圖為澆灌清水的牡丹根系。具體實施方式鑒于現(xiàn)有技術中的不足，本案發(fā)明人經長期研究和大量實踐，得以提出本發(fā)明的技術方案。如下將對該技術方案、其實施過程及原理等作進一步的解釋說明。實施例1：牡丹內生細菌Mdgb15分離和對牡丹灰霉病菌（Botrytis cinerea）的平板抑菌作用。本發(fā)明于2014年4月在河南省洛陽市隋唐城遺址植物園內采集牡丹植物的根部組織，具體的分離純化操作步驟如下：將采集的新鮮牡丹根部組織在自來水下沖洗干凈晾干，剝下外層根皮即為

14、丹皮，隨機稱取丹皮5g，在超凈工作臺內用70%酒精浸泡1min，再用20%次氯酸鈉表面消毒5min-10min后，無菌水沖洗三次，隨機抽取洗凈的組織印記在大豆胰蛋白胨（TSA）培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h，觀察有無菌落產生。并以此驗證消毒方法是否能全部殺死供試材料表面的微生物，確定分離結果是否有效。樣品晾干后轉入無菌研缽中研磨勻漿，加10ml無菌水混勻，靜置15min后，各取100µl汁液移入TSA平板上，每處理重復3次，30培養(yǎng)2d。定期觀察分離平板，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）平板上純化，獲得牡丹內生細菌菌株。共分離純化獲得牡丹內生細菌65株，編號分別為Mdgb1-Mdgb65

15、。采用平板對峙培養(yǎng)法的測定牡丹內生細菌對牡丹灰霉病菌的平板拮抗作用，具體實施方法為在直徑9cm的改良PDA培養(yǎng)基平板中央接直徑為5 mm的牡丹病原灰霉菌菌絲塊，在距培養(yǎng)皿邊緣9mm處對稱點接內生細菌菌株，對照只接病原菌菌絲塊，28°C恒溫培養(yǎng)5d后測量抑菌帶的寬度，待對照長滿整個平板時觀察結果，每個處理重復3次。試驗結果如圖1所示，內生細菌菌株Mdgb15菌株對牡丹灰霉病菌具有強烈的抑菌作用，抑菌圈平均直徑值為11.5mm。本實施方式中大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）由胰蛋白胨15g、大豆胨5g、NaCl 5g、瓊脂17g和1000ml蒸餾水組成，pH7.3；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）

16、由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、瓊脂17g和1000ml蒸餾水組成，pH7.2；改良PDA培養(yǎng)基由土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、瓊脂17g和1000ml蒸餾水組成，自然pH值。實施例2：牡丹內生細菌Mdgb15的鑒定。本發(fā)明的實施主要采用菌體形態(tài)觀察、生理生化特征測定和分子生物學手段相結合的方法對內生細菌Mdgb15進行鑒定。試驗結果如圖2所示，菌株Mdgb15在NA培養(yǎng)基上生長良好，其菌落平鋪、干燥、不透明、白色，經革蘭氏染色后，均為陽性，菌體為桿狀，產生芽孢。16S rRNA的PCR擴增結果表明，菌株Mdgb15擴增產物為1511 bp，委托上海生工生物工程公司測序，獲

17、得菌株Mdgb15 16S rRNA基因全序列，序列登錄號分別為KU570451。利用GenBank中的BLAST軟件對菌株的16S rRNA基因序列進行分析，菌株Mdgb15的16S rRNA序列與解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens具有較高的同源性，其相似性都高達99%。結合形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，將菌株Mdgb15鑒定為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽胞桿菌Mdgb15 16S rDNA 基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。實施例3：解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amy

18、loliquefaciens）Mdgb15對離體牡丹葉片灰霉病的防病作用。在NB培養(yǎng)液中接種解淀粉芽胞桿菌Mdgb15，28°C、180r/min振蕩培養(yǎng)18h，獲得拮抗菌株的活菌懸液備用。在健康的牡丹植株上，采取生長良好且大小相似的葉片，用流水輕輕沖洗數(shù)次，然后在75%的酒精中浸泡30s，無菌水沖洗干凈后，放在無菌濾紙上晾干。將拮抗菌株發(fā)酵液用無菌棉花均勻涂抹在牡丹葉片上，將葉片放入鋪有無菌濾紙（濾紙用無菌水完全浸濕）的培養(yǎng)皿中，48h后在葉片上接種一塊直徑為6mm的灰霉菌菌絲塊。以在無菌水中浸泡作為對照。每處理重復3次，25培養(yǎng)3d后，檢查葉片發(fā)病情況，計算防治效果。防治效果(%

19、)=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑×100。試驗結果如表1和圖3所示，解淀粉芽胞桿菌Mdgb15對離體牡丹葉片灰霉病有極好的防治效果。對照組牡丹葉片發(fā)病嚴重，病原菌菌絲茁壯，病部表面產生濃密灰色霉層，后期凡菌絲觸及的地方葉片腐爛。與對照組相比，拮抗菌株處理葉片上出現(xiàn)較小水漬狀病斑，無菌絲生長，生防菌對灰霉病的發(fā)生和蔓延起到了有效的控制作用，其病原菌接種后3d防病效果為44.23%，5d防病效果為37.25%。表1 解淀粉芽胞桿菌Mdgb15對牡丹離體葉片灰霉病的生防效果處理3d5d7d病斑直徑（cm）防病效果（%）病斑直徑（cm）防病效果（%）病斑直徑（cm）防病效果（

20、%）Mdgb151.6144.232.2837.253.6126.88CK2.89-3.67-5.00-本實施方式中NB培養(yǎng)基由牛肉膏3g、氯化鈉5g、蛋白胨5g和1000ml蒸餾水組成，pH=7.0左右。實施例4：解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15發(fā)酵條件的優(yōu)化。本發(fā)明的實施主要采用單因素實驗，分別改變發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源種類、氮源種類、無機鹽種類、初始pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉速及培養(yǎng)時間，經培養(yǎng)后，測定菌株發(fā)酵液抑菌活性，抑菌活性的測定采用濾紙片法，以抑菌活性的大小判斷生防菌株的培養(yǎng)條件。（1）發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化分別以1.0%的蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、

21、可溶性淀粉和玉米淀粉代替NB培養(yǎng)基中的碳源，其他成分不變。以4%的接種量將種子液分別接種到液體培養(yǎng)基中（250mL三角瓶裝液100mL），在30、180r/min條件下培養(yǎng)48 h 后取樣，采用濾紙片法測定抑菌活性，每處理3 次重復。根據(jù)抑菌活性最大時確定碳源的種類。在固定碳源的基礎上，分別以1%蛋白胨、酵母提取粉、牛肉浸膏、酵母浸膏、硫酸銨和氯化銨代替NB培養(yǎng)基中的氮源，培養(yǎng)條件同上，篩選抑菌活性最大時的氮源。在固定碳源和氮源基礎上，分別添加0.5%的NaCl、CuSO4、CaCl2、MgSO4、ZnCl2 和Fe(SO4)26H2O用于篩選無機鹽，培養(yǎng)條件同上，篩選抑菌活性最大時的無機鹽。

22、（2）發(fā)酵條件的優(yōu)化將含有最佳碳、氮源和無機鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別設為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和9.0；置于30下，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，采用濾紙片法測定發(fā)酵液的抑菌活性，確定抑菌活性最大時的初始pH值。調節(jié)含有最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為最佳，分別置于28、31、34、37和40，180r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h后，測定抑菌活性，確定抑菌活性最大時的培養(yǎng)溫度。確定最佳初始pH值和培養(yǎng)溫度，設定不同的轉速為90、110、130、150、170和190r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h后，測定抑菌活性，確定抑菌活性最大時的搖床轉速。將菌株接種到含有最佳碳、

23、氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，調節(jié)pH值為最佳，置于最佳培養(yǎng)溫度下，采用最佳搖床轉速振蕩培養(yǎng)。與接種后12、24、36、48、72 和96 h后分別取樣測定抑菌活性，獲得菌株最佳培養(yǎng)時間。試驗結果表明，解淀粉芽胞桿菌Mdgb15發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母提取粉，最佳無機鹽為NaC1，其抑菌活性的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖20g L-1，酵母提取粉1.0g L-1，NaCl 0.3g L-1；最適宜的培養(yǎng)基初始pH為6-7，最適培養(yǎng)溫度為31，最適搖床轉速為130r/min，培養(yǎng)24h后生物量達到最大值，抑菌活性最大時最佳培養(yǎng)時間為48h，在最佳培養(yǎng)條件下，如圖4所示，菌株發(fā)酵液對牡丹灰

24、霉病病原菌抑菌帶寬度可達到17.5mm。實施例5：解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15對盆栽牡丹的生防作用。本發(fā)明實施的試驗材料為牡丹品種“趙粉”4年生實生苗，植株生長健壯、形態(tài)基本一致，無病蟲害。將盆栽好的“趙粉”(土壤要求滅菌，盆高28cm，盆口直徑31cm，盆底直徑22cm)用生防菌液澆灌處理，每盆澆灌菌液20ml（OD600=2），72h后再接種灰霉病孢子懸浮液（孢子濃度為105/ml），每個處理3盆，設置3次重復，24-27保濕培養(yǎng)7d后調查發(fā)病情況，記錄病情指數(shù)，計算防病效果。以清水處理接種病原菌為對照。灰霉病病害分級標準見下表。病情指

25、數(shù)=（各級病葉數(shù)×各級代表值）/(調查總葉數(shù)×最高級代表值)×100防治效果%=病原菌對照病情指數(shù)-單個處理病情指數(shù)病原菌對照病情指數(shù)×100表2 牡丹灰霉病病情分級病級病情描述0級全株葉片健康，無病斑1級全株1/4以下葉片發(fā)病，平均每個復葉上的病斑數(shù)在2個以下，病斑不連成片2級1/4-1/2葉片發(fā)病，平均每個復葉上有3-5個病斑3級1/2-3/4葉片發(fā)病，平均每個復葉上有6-10個病斑，斑點密集；或1/3以上葉片枯焦4級3/4以上葉片發(fā)病，平均每個復葉上有10個以上病斑，斑點密集并相連成片，或1半以上葉片枯焦5級全株死亡試驗結果表明，解淀粉芽胞桿菌Md

26、gb15對盆栽牡丹灰霉病具有較好的防治效果，在病原菌接種5d、7d和10d后，澆灌生防菌Mdgb15的盆栽牡丹其病情指數(shù)顯著降低，如表3和圖5所示其防治效果分別為70.2%、72.2%、62.8%。與50%多菌靈可濕性粉劑500倍液的防治效果基本無差異，表明生防菌株Mdgb15有效的防治盆栽牡丹灰霉病。表3 生防菌Mdgb15發(fā)酵液對盆栽牡丹灰霉病的防治效果處理5d7d10d病情指數(shù)防病效果（%）病情指數(shù)防病效果（%）病情指數(shù)防病效果（%）50%多菌靈WP500倍液5.376.4a10.873.9a23.665.6aMdgb15菌株發(fā)酵液6.770.2a 11.572.2a25.562.8aC

27、K22.5-41.5-68.7-實施例6：解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15對盆栽牡丹的生防作用。本發(fā)明實施采用的試驗材料為牡丹品種“鳳丹白”2年生實生苗，植株生長健壯、形態(tài)基本一致，無病蟲害。將盆栽好的“鳳丹白”( 土壤要求滅菌，盆高28cm，盆口直徑31cm，盆底直徑22 cm)用生防菌液澆灌處理，每盆澆灌菌液20ml（OD600=2），以清水處理為對照。每處理重復3次。30d后晾干后量取株高和莖粗，觀察其促生作用。試驗結果表明生防菌株Mdgb15對盆栽牡丹具有明顯的促生作用，如表4和圖6所示，澆灌生防菌株Mdgb15的盆栽牡丹生長1個月后，

28、牡丹生長更快更健壯，葉片顏色深綠，株高顯著增加，且根系更為發(fā)達，植株鮮重有顯著增加。表4 生防菌Mdgb15發(fā)酵液對盆栽牡丹的促生作用處理株高（cm）新枝長度（cm）根頸粗度（mm）主根長度（cm）鮮重（g）Mdgb15發(fā)酵液328.5 5.8421.328.5CK23.54.44.851621.8本發(fā)明從牡丹根部分離獲得了一株對牡丹灰霉病具有較好防效的生防內生細菌解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） Mdgb15，確定菌株抑菌活性最好的最優(yōu)培養(yǎng)條件，明確生防菌株對于盆栽牡丹灰霉病的防治效果，同時了解生防菌株對盆栽牡丹的促生效果，從而為牡丹病害的生物防治提供了

29、新途徑和新方法。以上所述的僅是本發(fā)明的一些實施方式，應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明的創(chuàng)造構思的前提下，還可以做出其它變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。說 明 書 附 圖圖1圖2圖3波長圖4圖5波長圖6序 列 表 說 明 書 SEQUENCE LISTING<110> 洛陽理工學院<120>一株牡丹內生解淀粉芽胞桿菌、其分離方法及應用<130> 20160202<160> 1<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 1511<212>

30、DNA<213>解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15<400> 1 cggctacctt gttacgactt caccccaatc atctgtccca ccttcggcgg ctggctccat 60aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 120caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 180tcacgcagtc gagttgcaga ctg

31、cgatccg aactgagaac agatttgtgg gattggctta 240acctcgcggt ttcgctgccc tttgttctgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 300aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 360ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 420aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgccccc 480gaaggggacg tcctatctct aggattgtca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 540cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 600agtttcagtc