Primer3在線引物設計攻略

1、Primer3在線引物設計攻略開始之前：其實非常簡單，不需要你下載任何軟件，但是你得有一臺電腦能上網。當然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本次討論范圍。另外，要先對PCR目的序列的長度有個大致估計，好了，馬上開始吧：第一步：找到Primer3的站點。你不用記住這個站點，但是要記住“Primer3”這個詞，然后打開GOOGLE頁，輸入Primer3,跳出來的第一個項目就是了“Primer3Input0.4.0”，網址是。第二步：貼上模板序列。進入Primer3站點，可以看到一個引物設計的界面。（如下圖）在“Pastesourcesequencebelow（5

2、'->3'”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進去。注意是5'->3'方向的，數(shù)字或者空格都沒關系，軟件會自動過濾的。第三步：重要參數(shù)設定。首先是“ProductSizeRanges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調整的就是這個參數(shù)。默認的參數(shù)實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調整。第二個參數(shù)是“PrimerSize”，默認值一般可以用，但是，當你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數(shù)是“PrimerTm”這個和PrimerSize差不多

3、。第四步：Pickprimers：點一下這個按鈕，符合你大小預期的primer就出來了，看看Primer3Output的界面，多么漂亮！你要的primer出來了，而且有primer在序列上的位置比對圖，還要primer本身的信息，包括位置，長度，TmGC?量，任何位置互補堿基數(shù)，3'端互補堿基數(shù)，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），還要產物大小，兩引物間任意互補堿基數(shù)，兩引物間3'端互補堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設定的范圍內，但還不是最佳，將會給出警告。比如（隨便舉例，本人在做一個超長引物）：WARNING:Leftprimerisunacce

4、ptable:High3'stabilityOLIGOstartlentmgc%any3'seqLEFTPRIMER33TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHTAAAGGGTTAATTTGPRIMER138834CATGCTTTATTTACACACATSEQUENCESIZE:1388INCLUDEDREGIONSIZE:1388PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:,PAIR3'COMPL:第五步：引物設計檢驗：可以僅僅設計一對引物，只要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾

5、掉一個就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的書寫反向仍然是5'->3'）如果符合設定的條件，軟件將對給出引物評分，同時給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當對自定義引物做些調整即可，警告信息也讓你做實驗的時候心中有數(shù)。對于文獻發(fā)表的引物，最好都要檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無意誤導。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產物跨過內含子，這樣避免潛在DNA寸RT-PCR勺干擾。實際做引物的時候，要把內含子都去掉，僅僅把外顯子序列放入源序列框中，并且通過自定義引物設計的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內含子和外顯子以及電子PCR將另做說明。至于設計出來的引物的實際效果，根據(jù)我的經驗，一般情