抗血清制備及抗體效價測定

1、摘要4【實驗過程】 3Part I . NDV 抗血清制備 3一、實驗原理 3二、實驗儀器、材料和試劑 41 .儀器 42 .材料 43 .試劑 4三、方法和步驟 4（一）NDV兔抗血清制備 41 .家兔捉拿方法 42 .家兔固定方法 43 .初次免疫 54 .二次免疫 55 .終末免疫 66 .試血 67 .頸動脈放血 68 .血清分離 69 .抗血清保存 7（二）NDV鼠抗血清制備 71 .小白鼠的捉拿和固定 72 .初次免疫 73 .二次免疫 84 .終末免疫 85 .試血 86 .放血 97 .血清分離 108 .抗血清保存 10Part n .瓊脂雙擴散實驗檢測抗體效價 10一、基本

2、原理 10二、實驗儀器、材料和試劑 101 .儀器 102 .材料 103 .試劑 10三、方法和步驟 101.滅活雞新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 101 .1%瓊脂糖配制 103 .倒平板 104 .打孔 105 .稀釋抗血清 116 .加樣 117 .孵育 118 .結果觀察 11Part m.酶聯(lián)免疫吸附試驗測定NDV抗血清效價 12一、基本原理 12二、實驗儀器、材料和試劑 121 .儀器 122 .材料 123 .試劑 12三、方法和步驟 121.雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅活抗原提取 122、抗原包被 133 .封13! 134 .洗板 135 .稀釋抗血清

3、136 .加抗血清 137 .洗板 138 .加酶標二抗 139 .洗板 1310 .顯色 1311 .終止 1312 .讀數(shù) 1413 .結果判定 14Part W.免疫印跡實驗鑒定抗體的特異性 14一、基本原理 14二、實驗儀器、材料和試劑 141 .儀器 142 .材料 143 .試劑 14(1) SDS-PAGE相關試劑： 14(2) Western blotting 相關試劑： 15三、方法和步驟 151 . SDS-PAGE 152 .轉膜 163 .免疫檢測 16(1)膜的封閉 16(2)洗膜 16(3)加入一抗 17(4)洗膜 17(5)與二級抗體作用： 17(6)洗膜 17(

4、7) Odessey近紅外成像儀掃描成像 17【實驗結果及分析】 17NDV抗血清制備及抗體效價測定摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus , NDV又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或禽肺腦炎病毒。在病毒分類學中的位置屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae ）、副黏病毒屬（Paramyxovirus ）中的一個種。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群 中迅速傳播，強毒株可使雞群全群毀滅。以新城疫病毒滅活疫苗（ Ulster 2c株）滅活油劑 苗多種途徑免疫兔和小白鼠，制備新城疫病毒抗血清。也叫免疫血清，是指含有免疫蛋白的血清?？贵w效價指抗體的物理狀

5、態(tài)及其在體內滯留時間，以其與抗原反應的多少來表示其免疫效果。此次實驗主要是進行家兔與小鼠的新城疫病毒抗血清的制備過程，并通過酶免疫吸附試驗、兔疫印跡實驗對其進行抗體效價檢測。關鍵字：NDV抗血清抗體效價免疫【實驗過程】本次實驗一共分為四個大步驟：Part I . NDV抗血清制備Part n .瓊脂雙擴散實驗檢測抗體效價Part m .酶聯(lián)免疫吸附試驗測定 NDV抗血清效價Part IV.免疫印跡實 驗鑒定抗體的特異性Part I . NDV抗血清制備一、實驗原理將具有免疫原性的物質注入健康動物體內后，抗原可刺激機體相應B細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。待動物血清中存在大量抗體時，采

6、集動物血液，分離析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗體）。由于抗原性物質通常具有多個抗原決定簇，可以刺激機體產(chǎn)生多種抗體形成細胞克隆，合成和分泌各種抗原決定簇的抗體，免疫血清中實際上是含有多種抗體的混合物，所以這種免疫法獲得的免疫血清又稱為多克隆抗體 （Polyclonal antibody , PcAb）。多克隆抗體的制備是一個復雜的過程，為了獲得特異性強，效價高的抗血清，除了抗原的因素外，還需注意動物品系的選擇、抗原注射的濃度、劑量、 次數(shù)、間隔時間及注射途徑等。對于免疫原性較弱的可溶性抗原（如蛋白質類抗原）要加入佐劑，以增強免疫性。本實驗介紹新城疫病毒（Newcastle dise

7、ase virus , NDV抗血清的制備過程。新城疫病毒（Newcastle disease virus , NDV又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或禽肺腦炎病毒。在 病毒分類學中的位置屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae ）、副黏病毒屬（Paramyxovirus ）中的一個種。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強毒株可使雞群全群毀滅。以新城疫病毒滅活疫苗（ Ulster 2c株）滅活油劑苗多種途徑免疫兔和小白鼠，制 備新城疫病毒抗血清。二、實驗儀器、材料和試劑1 .儀器5mL無菌凍存管，2.5mL和1mL注射器，塑料靜脈插管，碘酒，75%酒精棉球，剪刀，止血鉗

8、，250mL無菌三角瓶，50mL無菌尖底離心管，家兔固定槽，家兔解剖臺，棉線， 5mL 吸頭和移液器，溫箱，離心機。2 .材料家兔：1-2kg清潔級雄性或未孕雌免；小鼠： SPF級6-8周齡昆明鼠。3 .試齊I雞新城疫病毒 Ulster 2C株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司），0.01M PBS（ pH7.2 ） （8 g NaCl , 0.2 g KCl , 2.9 g Na2HPO4.12H2Q 0.2 g KH2PO4 以 NaOH 調節(jié) pH 至 7.2 , 加雙蒸水至1000 mL）,麻醉劑：普魯卡因溶液，硫柳汞。三、方法和步驟（一）NDV兔抗血清制備1 .家兔捉拿方法動物的捉拿和

9、固定是進行動物實驗的基本操作之一，正確的抓取固定動物是為了不損害動物健康，不影響觀察指標，并防止被動物咬傷，保證實驗順利進行。家兔習性溫順，除腳 爪銳利應避免被其抓傷外，較易捕捉。拿時切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。正 確的方法是用右手抓住其頸背部皮毛，輕提動物，再以左手托住其臀部， 使兔的體重主要落在左手掌心（如圖 1）。圖1.家兔的捉拿方法2 .家兔固定方法家兔的固定，依不同的實驗需要，常用兔固定箱或兔手術臺固定。兔固定箱通常由木頭、鐵皮或者樹脂材料制成，便于拆卸清洗消毒， 一般用于固定兔子狐貍貉子等。使用時時可將家兔置于兔固定箱內，在不需要幫手的情況下單人即可對兔子等動物打耳號，

10、灌藥、耳緣靜脈注射、取血、或觀察耳部血管的變化等，常用于生理、藥理和免疫等作動物整體實驗時限制實驗物的活動。（如圖2）圖2.家兔固定箱固定方法在需要觀察血壓、呼吸和進行頸、胸、腹部手術時，應將家兔以仰臥位固定于兔手術臺上。固定方法是：先以四條1cm寬的布帶作成活的圈套，分別套在家兔的四肢腕或踝關節(jié)上方，抽緊布帶的長頭，將兔仰臥位放在兔手術臺上，再將頭部用兔頭固定器固定，然后將兩前肢放平直，把兩前肢的系帶從背部交叉穿過，使對側的布帶壓住本側的前肢，將四肢分別系在兔手術臺的木柱上。（如圖3）圖3.家兔手術臺固定方法3 .初次免疫在家兔足掌、腋窩淋巴結周圍、背部兩側、頜下、耳后等部位，選擇 610處

11、免疫接種 點，采用皮下、皮內或肌肉注射，每點注射上述雞新城疫病毒 Ulster 2C株滅活疫苗0.1 - 0.2mL。如果使用沒有加佐劑的滅活新城疫病毒Ulster 2C株，也可以采用耳緣靜脈注射的方法進行免疫。（如圖4）圖4.家兔耳緣靜脈注射方法4 .二次免疫第一次免疫后間隔2周再以雞新城疫病毒 Ulster 2c株滅活疫苗采用與初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窩淋巴結周圍、背部兩側、頜下、耳后等部位，選擇 610處免疫接種點，采用皮下、皮內或肌肉注射加強免疫。5 .終末免疫第二次免疫后間隔2周再按上述二次免疫方法進行第三次免疫。6 .試血終末免疫免疫7天后經(jīng)兔耳緣靜脈采血 2mL,分離血清

12、，用瓊脂雙向擴散實驗測定抗體效價達1:16以上（稀釋抗體）以上時，即可放血，如效價不高，則加強免疫l次后，再行檢測。7 .頸動脈放血將免疫家兔仰面固定于家兔手術臺上，頭部放低，暴露頸部。沿氣管鈍性分離皮下組織，暴露氣管前的胸鎖乳突肌； 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，在肌束下面靠近氣管兩側，可見淡紅色搏動的頸動脈。（如圖5）圖5.兔頸部血管神經(jīng)分布圖將雙側動脈仔細分離，于每側動脈分別套入兩根棉線，一根在遠心端，一根在近心端,（圖 6 ）。圖6.兔頸部動脈血管以同法在對側動脈內80-100mL。5mL無菌移液管吸取先將一側動脈遠心端絲線結扎緊，然后在近心端用止血鉗夾住 （止血鉗頭部用細

13、塑料管包裹,避免損傷動脈）。用小的尖頭眼科剪在兩側絲線中間的動脈壁上剪開一個小口，以便插入塑 料靜脈插管（或大號鋼針頭），再用近心端棉線固定靜脈插管，避免其從動脈內滑出；輕輕 松開止血鉗，血液很快沿導管流入三角瓶， 直至血流緩慢點滴而出時, 插管放血，并將動物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血 8.血清分離將血液置室溫中凝固約 1hr ,然后置4 c過夜，使血塊收縮；用 上層血清，轉移至 50 mL無菌尖底離心管中。然后將血塊自容器壁分離，將血清全部傾入另一 50 mL無菌尖底離心管，在 4 c下2,500g 離心10分鐘，取上清液即血清部分與前 述血清混合，將混合血清 4 C 1

14、,500g離心10分鐘，棄沉淀收集血清。9.抗血清保存(1) 4c保存：將抗血清除菌后，加入 0.01 %硫柳汞或0.1 %疊氮鈉，液體狀態(tài)保存于普通冰箱，可以存放 3個月到半年，效價高時，一年之內不會影響使用。(2)低溫保存：將抗血清除菌后，加入等量甘油，放在 -20或-40, 一般保存5年 抗體效價不會有明顯下降?？贵w切忌反復凍融，反復凍融會使抗體效價顯著降低。(二)NDV鼠抗血清制備1 .小白鼠的捉拿和固定小白鼠較大白鼠溫和， 雖也要提防被其咬傷手指，但毋需戴手套捕捉。 可先用右手抓住鼠尾提起，置于鼠籠或實驗臺上，用左手的拇指和食指抓住小鼠兩耳后頸背部皮膚，將鼠體置于左手心中，拉直后肢，

15、以無名指及小指按住鼠尾部即可。有經(jīng)驗者可直接用左手小指鉤起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后項背部皮膚亦可。如操作時間較長，也可固定 于小白鼠固定板上。(如圖7)圖7.小白鼠的捉拿和固定2 .初次免疫分別在昆明鼠背部采用肌內、皮下或皮內注射雞新城疫病毒Ulster 2C株滅活疫苗0.2mL,或者腹腔注射雞新城疫病毒Ulster 2C株滅活疫苗0.2mL。(1)腹腔注射法：小鼠固定后，使腹部朝上，頸部拉直，右手持注射器(56號針頭)，從恥骨聯(lián)合上一側向頭端以30度角刺入腹腔(應避開膀胱)?？上却倘肫は?3mm再刺入腹腔，以防藥液外漏。針頭刺入部位不宜太高太深，以免刺破內臟。注射量一般為0.1

16、0.25mL/10g 鼠重。圖8.小鼠腹腔注射法(2)皮下注射法：一般兩人合作。一人左手抓住小鼠頭部皮膚，右手拉住鼠尾；另人左手提高背部皮膚，右手持住注射器（針頭號同上），將針頭刺入提起的皮下。若一人操作，左手小指和手掌夾住鼠尾，拇指和食指提起背部皮膚，右手持注射器給藥。一般用量為 0.05 0.25mL/10g 鼠重。圖9.小鼠皮下注射法（3）肌肉注射法：兩人合作時，一人抓鼠方法同上，另一人左手拉直一側后肢，右手持注 射器，注射部位多選后腿上部外側（針頭號同上）。如一人操作，抓鼠方法類似腹腔注射，只是藥液注射在肌肉內，每腿的注射量不宜超過0.1mL。（4）尾靜脈注射法：將小鼠置于待置的固定筒

17、內，使鼠尾外露，并用酒精或二甲苯棉球涂 擦，或插入40 C50c溫水中浸泡片刻，使尾部血管擴張。左手拉尾，選擇擴張最明顯的 血管；右手持注射器（45號針頭），將針頭刺入血管，緩慢給藥。如推注有阻力而且局部 變白，說明針頭不在血管內，應重新插入。穿刺時宜從近為尖部1/3處靜脈開始，以便重復向上移位注射。一般用藥量為 0.10.2ml/10g ,不宜超過0.5ml/10g 。圖10.鼠尾皮下注射法3 .二次免疫第一次免疫后間隔2周分別在昆明鼠背部采用肌內、皮下或皮內注射雞新城疫病毒Ulster 2C株滅活疫苗0.2mL ,或者腹腔注射雞新城疫病毒Ulster 2C株滅活疫苗0.2mL。4 .終末免

18、疫第二次免疫后間隔2周分別在昆明鼠背部采用肌內、皮下或皮內注射雞新城疫病毒Ulster 2C株滅活疫苗0.2mL ,或者腹腔注射雞新城疫病毒Ulster 2C株滅活疫苗0.2mL。5 .試血末次注射7天后鼠眼球采血0.2mL ,分離血清，用瓊脂雙向擴散實驗測定抗體效價達1:16以上（稀釋抗體），即可放血，如效價不高，繼續(xù)加大劑量，加強 l-2 次后，常可使 效價增高。鼠眼球采血可采用以下兩種方法：(1)眼眶后靜脈叢采血：用710cm長的玻璃取血管，其一端內徑為 1 1.5 mm,另 一端逐漸擴大，細端長約 1cm即可，將其尖端折斷，使其鋒利。將取血管浸入1%肝素或其它抗凝劑溶液處理，干燥后使用

19、。采血時，右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠頭朝下將鼠旋轉離 心甩動1min ,左手拇指和食指抓住鼠兩耳之間的皮膚使鼠固定，并用中指配合，輕輕壓迫 頸部兩側，阻礙靜脈回流，使眼球充分外突，提示眼眶后靜脈叢充血。取用肝素過的醫(yī)用毛 細采血管，右手拇指、食指和中指握住毛細管，將其尖端插入內眼角與眼球之間，輕輕向眼 底方向刺入約23mm,手指旋轉捻動毛細管以刺破靜脈叢，鼠血順毛細管流入1.5mL無菌離心管中，收集鼠血。采血結束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期內可 重復采血。小鼠一次可采血 0.2 0.3 ml ,大鼠一次可采 0.5 0.1ml (圖11)。(2)眶動脈和眶靜脈取血法：右手提

20、免疫后昆明鼠鼠尾，鼠頭朝下將鼠旋轉離心甩動 1min,用鐐子拔去一側鼠眼球，用左手固定動物，壓迫眼球，盡量使眼球突出，右手用無鉤 彎鐐子或彎止血鉗迅速摘除眼球，立即將鼠倒置，頭朝下，眼眶內很快流出血液，將鼠血滴 入1.5mL無菌離心管中，收集鼠血。注意不要讓小鼠流血過多，以免死亡。一般只適用于 一次采血。大部動物采血后可以存活，可采另一側眼球取血。此法既能采取較大量的血液， 又可避免斷頭取血法中因組織液的混入導致溶血的現(xiàn)象，現(xiàn)常取代斷頭取血法。 先使動物眼球突出充血后，以彎頭眼科鐐迅速鉗取眼球，并將鼠倒置，頭向下，眼眶內很快流出血液， 讓血液滴入盛器，直至不流為止。此法由于取血過程中動物未死，

21、心臟不斷在跳動，因此取 血量比斷頭法多，一般可取鼠體重45%的血液量，是一種較好的取血方法。(3)剪尾采血：需血量少時可用此方法。將動物固定，顯露尾部，將尾塵剪去約5mm從尾根部向尾端部按摩，血即從斷端流出。若用二甲苯棉球涂擦尾部或事先將鼠尾浸在45 C水中數(shù)分鐘，使尾部血管充盈，可采到較多的血，但注意二甲苯可致溶血。也可用鋒利刀片 割破尾動脈或尾靜脈，讓血液自行流出，采血后，消毒，止血。如將動物麻醉取血量可更多 些。三根尾勢脈可交替切割，并自尾尖向尾根方向切割，小鼠每次采血約0.1ml。6 .放血小鼠也可以采取眶動脈和眶靜脈取血法放血，此外還可用如下方法：(1)斷頭取血：當需要較大量的血液，

22、而又不需繼續(xù)保存動物生命時采用此法。左手捉持動物，使其頭略向下傾，右手持剪刀猛力剪掉鼠頭，讓血液滴入盛器。小鼠可采血0.8 1.0ml ,大鼠可采用 58ml。(2)心臟取血：動物仰臥固定在固定板上，剪去心前區(qū)部位的被毛，用碘酒酒精消毒 皮膚。在左側第34肋間，用左手食指摸到心搏處，右手取連有45號針頭的注射器，選擇心搏最強處穿刺， 當針刺入心臟時，血液由于心臟跳動的力量自動進人注射器。此法要求實驗者掌握以下要點：要迅速而直接插入心臟，否則，心臟將從針尖處滑脫；如第一次沒 刺準，將針頭抽出重刺，不要在心臟周圍亂探，以免損傷心、肺；要緩慢而穩(wěn)定的抽吸，否 則，太多的真空反而使心臟塌陷。若不需保留

23、動物生命時，也可麻*醉后切開動物胸部，將注射器直接刺人心臟抽吸血液。7 .血清分離血清分離方法與（一）8相同。8 .抗血清保存抗血清保存方法與（一）9相同。Part II .瓊脂雙擴散實驗檢測抗體效價一、基本原理抗原、抗體在凝膠中擴散，并進行沉淀反應，稱為免疫擴散實驗（ immunodiffusion ）。 將抗原與其相應抗體加入含有一定電解質的瓊脂凝膠平板中鄰近孔內，抗原和抗體從小孔向四周自由擴散，當擴散到兩者濃度比例合適的部位時，出現(xiàn)白色的免疫復合物沉淀線，即雙向瓊脂擴散試驗。沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原抗體的特異性及相互間濃度比例，而且與其分子大小及擴散速度相關。如果反應材料中有兩種

24、以上的抗原抗體系統(tǒng)，則兩孔間出現(xiàn)多條沉淀線。此方法最早由Ouchterlony 提出，因此又稱為Ouchterlony 技術。本次實 驗將以WF83株酚水抗原檢測兔抗 APP抗血清效價，其中酚水抗原以APP的莢膜和脂多糖 抗原為主，本方法也是APP血清學分型的常用方法。二、實驗儀器、材料和試劑1 .儀器11cm平皿，200L微量可調移液器和吸頭，打孔器，針頭， 1.5mL eppendorf管，50 mL離心管，離心管架，溫箱，微波爐，離心機。2 .材料雞新城疫病毒 Ulster 2C株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司），上述用雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制

25、備的抗血清，未免疫家兔、昆明系小 白鼠血清。3 .試齊I0.01M PBS （ pH7.2 ） （8 g NaCl , 0.2 g KCl , 2.9 g Na2HPO4.12H2O , 0.2 g KH2PO4 , 以NaOH調節(jié)pH至7.2 ,加雙蒸水至1000 mL ）,瓊脂糖，雞新城疫病毒抗血清，氯仿。三、方法和步驟1 .滅活雞新城疫病毒 Ulster 2C株抗原提取取雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司）1mL,加氯仿500漩渦振蕩器上充分混合均勻，高速臺式離心機12000rpm離心15min ,收集上清備用。2 . 1%瓊脂糖配制稱取瓊脂糖粉0.3克

26、，放入三角瓶，加入無菌生理鹽水30mL,微波爐中小功率加熱，使瓊脂完全溶化。 3.倒平板取無菌9cm玻璃培養(yǎng)皿1個，平放于實驗臺（臺面要水平），將融化的1%瓊脂溶液趁 熱倒培養(yǎng)皿中（約加 25mL）,使瓊脂厚度達 4mm在室溫下放置使瓊脂冷卻凝固。4 .打孔先取一張一張紙，畫上將要打孔的圖樣， 通常雙向瓊脂擴散實驗打孔有雙孔、線性排列3孔、三角形排列3孔、正三角形排列4孔、十字形排列5孔、梅花形排列7孔瓊脂糖等模式（圖）。將圖樣放在瓊脂糖平板下方，將打孔器在正對圖樣為空的正上方垂直于瓊脂 糖平板上輕輕按下再用注射器針頭挑取孔中瓊脂糖，即形成加樣微孔。注意在用注射器針頭挑取孔中瓊脂糖時不要碰傷了

27、孔周圍的瓊脂。待微孔全部打好后，將平板經(jīng)過酒精燈外火焰加熱封底（溫度不宜過高，防止瓊脂融化過多，孔塌陷）。為了測定NDV免疫血清的效價,本實驗采用梅花狀排列的小孔，孔徑為8mm,空間距為5-8mm。打好孔后用記號筆在瓊脂平板的底面將孔編號。ABCDE ¥A.兩孔，H.斷列3孔，C.三角形二？L0正三角形4孔，E,正方形5孔.R.梅花形7孔圖12.瓊脂雙擴散實驗打孔圖樣5 .稀釋抗血清取1.5mL無菌尖底12支離心管排列于離心管架上并做好標記，在每管各加生理鹽水 100吸取100人 免疫血清加入第1管，并充分混勻后吸出 100人 加入第2管，經(jīng)充 分混勻后吸出100也加入第3管中，如此

28、依次 2 X稀釋至第10管，混勻后吸出1005 棄去。此時110管血清稀釋度為1:21:64。知 兌或上洲54mL SOjiL 50HLFOjiL1:21141 出1:161:321:64圖13稀釋抗血清6.加樣在每組呈梅花狀排列的小孔的中央孔加入一滴滅活雞新城疫病毒 （30山），周圍各孔依次加入未免疫動物血清、不同稀釋度抗血清各 要使液體溢出孔外。Ulster 2C 株抗原305。加樣時注意不圖13.瓊脂雙擴散實驗加樣圖7 .孵育蓋上平板蓋放入濕盒，置37 c溫箱孵育2448h。8 .結果觀察將平板從濕盒中取出，在散射光的背景下（平板后方約15cm處用手或深色物擋?。?觀察，或在凝膠成像系統(tǒng)

29、上用白光光源觀察，看抗原孔與不同稀釋度的抗血清孔之間是否有白色沉淀線，有沉淀線為陽性，否則為陰性。圖14.瓊脂雙擴散沉淀線Part m.酶聯(lián)免疫吸附試驗測定 NDV抗血清效價一、基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay, 簡稱ELISA ）是酶免疫技 術的一種，是將抗原抗體反應的特異性與酶催化反應的高效性相結合而建立的一種技術，其基本原理是：將酶分子與抗體（或抗原）結合，當酶標記抗體（或抗原）與固相載體上的相應抗 原（或抗體）結合時，即可在底物溶液的參與下，產(chǎn)生肉眼可見的顏色反應，顏色的深淺與 抗原或抗體的量呈比例關系，用酶標儀測定其吸光值進

30、行定量分析。ELISA技術具有特異、敏感、結果判斷客觀、簡便和安全等優(yōu)點，在生物學及相關學科中應用廣泛。本次實驗以APP 分泌到細胞外的天然毒素ApxIIA 為檢測抗原，包被酶標板，通過間接ELISA方法檢測抗血清中針對毒素的抗體。二、實驗儀器、材料和試劑1 .儀器96孔聚苯乙烯酶標板，2005和10山 微量移液器和吸頭，10mL無菌小燒杯，溫箱， 酶標儀，洗板機。2 .材料雞新城疫病毒 Ulster 2C株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司），上述用雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制備的抗血清，未免疫家兔、昆明系小 白鼠血清。3 .試齊1J包被液：0.01M碳酸

31、鹽緩沖液 （1.59 g NaCO3 2.93 g NaHCO3加去離子水至 1000 mD , 洗滌?0.01M PBST （pH7.2,含 0.05 % Tween-20 的 PBS）,封閉液：含 1 %牛血清白蛋 白（BSA的PBST,酶標二抗：辣根過氧化物酶（ Horseradish peroxidase , HRP標記的 羊抗兔IgG,使用時用 PBST以1:5000稀釋，顯色液：四甲基聯(lián)苯胺（3,3 ' ,5, 5 '-Tetramethylbenzidine,TMB ）顯色液，終止液： 2M H2SO4 或 1 % SDS。三、方法和步驟1.雞新城疫病毒 Ulst

32、er 2C株滅活抗原提取取雞新城疫病毒 Ulster 2C株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司）1mL加氯仿500人,漩渦振蕩器上充分混合均勻，高速臺式離心機12000rpm離心15min ,收集上清備用。2、抗原包被取上述離心上清 100人加入用9005包被液（碳酸鹽緩沖液）稀釋，在 96孔酶標板 各孔中加入稀釋的滅活雞新城疫病毒Ulster 2C株抗原100山，在濕盒中于37 c溫箱孵育2h,或4 C包被過夜。3 .封閉取出96孔酶標板，甩干各孔中包被液，將96孔酶標板倒扣在吸水紙上叩干，每孔加入封閉液（含 1%BSA的PBST） 100此，37 c孵育1h。4 .洗板取出96孔酶標板，甩去

33、封閉液，每孔添加PBST 200山，浸泡1min ,甩干后再重復洗滌操作2次，將96孔酶標板倒扣在吸水紙上叩干或拍干。5 .稀釋抗血清取1.5mL無菌尖底離心管9支排列于離心管架上并做好標記，在第1管中加入洗滌液297山，其余各管各洗滌液150吸取3山免疫血清加入第1管，并充分混勻后吸出 150人加入第2管，經(jīng)充分混勻后吸出 150也加入第3管中，如此依次 2 X稀釋至第9 管，此時19管血清稀釋度為1:1001:25600。如 L 兔史金請I 知 rL1 馴jiL150VL IIW|jL JWjiL1Q 鄴 LlOfipL lODpLmoouw rmri 耐 wihMooi；l之飄刖|：然電

34、則圖15稀釋抗血清6 .加抗血清在12孔酶標板條第1-9孔依次加入1:1001:25600各稀釋度抗血清各 100山，第 10、11孔每孔加入10051:100稀釋的未免疫動物血清作為陰性對照，第12加PBST作為空白對照，將酶標板平放在 37 c培養(yǎng)箱溫浴1hr。1；1<00h 4Q01：覃gE8011 b其0b MOOh 2制MHi片. 感恨對 會西.圖16加抗血清7 .洗板操作同步驟4 ,需重復4次。8 .加酶標二抗在酶標板各孔加入 1:5000 稀釋的HRP標記羊抗兔IgG 1005，將酶標板平放在 37 C 孵育1hr。9 .洗板操作同步驟5 ,需重復至少5次。10 .顯色在酶

35、標板各孔加入 TMB顯色液1005，將酶標板置室溫避光靜置10min。11 .終止在酶標板各孔加入 50 L 2M H2SO,終止反應。12 .讀數(shù)在405nm波長下以12孔為空白孔調零，測定光密度值。13 .結果判定P/N =檢測孔 OD值/陰性孔OD值，P/N>2.1為陽性，P/N<1.5為陰性，介于其間為可 疑。效價判定：以出現(xiàn)陽性孔的最高稀釋度作為待檢血清效價。Part IV.免疫印跡實驗鑒定抗體的特異性一、基本原理免疫印跡（Western blotting ）最早是由 Towbin 等于 1979 年將 Southern blotting 技術擴展到蛋白質領域，并與特異靈

36、敏的免疫分析技術相結合而發(fā)展的技術。它的基本原理是將凝膠電泳與固相免疫結合起來，其主要的操作分為三個過程：1）將抗原物質經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離；2）將分離的組分從 PAGE凝膠上轉移到固相基質上，如硝酸纖維素膜等， 此過程稱為印記，以利于隨后的檢測反應的進行；3）對轉移后的組分分別進行免疫檢測，與抗血清一起孵育，使一級抗體與待檢測的抗原決定簇結合，再與經(jīng)熒光素、酶或核素標記的第二抗體反應，顯示出蛋白組分區(qū)帶，并可對其進行定量。WorkflowSampJe Preparation圖17.免疫印跡實驗流程圖二、實驗儀器、材料和試劑1 .儀器電泳儀，垂直電泳槽，電轉膜儀，水平搖床，無菌培養(yǎng)皿

37、，凝膠成像系統(tǒng)或相機2 .材料雞新城疫病毒 Ulster 2C株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司），上述用雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制備的抗血清，未免疫家兔、昆明系小 白鼠血清。3 .試齊I（1） SDS-PAGE®關試劑：5XTris-甘氨酸電泳緩沖液：75.5g Tris 堿，470g甘氨酸，250mL 10% SDS加去 離子水溶解定容至 5000mL;：1.5mol/L (pH8.8)： Tris 堿181.7g 溶于去離子水中，用 HCl調pH值至8.8 , 定容至1000mL; 1.0mol/L Tris-HCl 緩沖?( pH6.8

38、) : Tris 堿 121.1g 溶于去離子水中，用 HCl 調 pH值至6.8 ,定容至1000mL;10%i硫酸?。?g過硫酸俊溶于10mL去離子水中，4c保存；2XSDS 凝膠加樣緩沖液：10mL 1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8),3.1g 二硫蘇糖醇(DTI), 4g SDS, 0.2g 澳酚藍，20mL甘油，定容至 100mL;30臊丙烯酰胺母液：將 145g丙烯酰胺和5g N,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于 300mL去 離子水中，加熱至 37 c溶解，定容至500mL, 4c避光保存?zhèn)溆?；考馬斯亮藍染色液：450mL甲醇，450mL去離子水，100mL冰乙酸

39、，2.5g考馬斯亮 藍R250 ,溶解后定容至 1000mL;脫色緩沖液：450mL甲醇，450mL去離子水，100mL冰乙酸，定容至 1000mL;其它：預染蛋白質 Marker ,正丁醇（2） Western blotting相關試劑：轉膜緩沖液：2.9g 甘氨酸，5.8g Tris 堿，0.37g SDS 200mL甲醇，定容至1000mL;洗滌液：含 0.5 % Tween 20 的 TBS°TBS(pH8.0)：稱取 1.21g Tris 堿，8.77g NaCl, 充分溶解，調 pH至8.0后，定容至1000mL;封閉液：含10%脫脂奶的PBST溶液；一級抗體：雞新城疫病

40、毒Ulster 2C株滅活疫苗免疫家兔制備的抗血清，使用前用PBST 以 1:100 稀釋；二級抗體：IRDye800標記的羊抗兔IgG ,使用前用PBST以1:15000 稀釋；終止液：滅菌去離子水三、方法和步驟1. SDS-PAGE(1)夾好灌制聚丙烯酰胺凝膠的玻璃板；(2)配制12%的SDS丙烯酰胺分離膠10mL,在燒杯中依次加入：滅菌去離子水3.3mL30%f烯酰胺溶液 8mL 4mL1.5mol/L Tris (pH8.8) 2.5mL10% SDS 0.1mL10%i硫酸錢 0.1mLTEMED0.004mL搖勻后用移液器加入到兩塊玻璃板的間隙中；(3)在分離膠上加入正丁醇0.3m

41、L ,置37 C約30min ;(4)待分離膠聚合后，傾出覆蓋層的正丁醇液體，用去離子水淋洗凝膠表面 23次，用濾紙片吸凈殘留液體；(5)配制5%濃縮膠3mL,在燒杯中依次加入：滅菌去離子水2.1mL30%f烯酰胺溶液8mL 0.5mL1.0mol/L Tris (pH6.8)0.38mL10% SDS0.03 L10%i 碩酸錢0.03mLTEMED0.005mL37 C約 10min 。搖勻后加到分離膠上，立即插入梳子，置(6)待凝膠完全聚合后拔出梳子，固定于電泳裝置。加電泳緩沖液，直至蓋住點樣孔；(7)取10 d L NDV與等體積的2 XSDS凝膠加樣緩沖液混合，加入已經(jīng)預制好的 SD

42、S-PAGE交點樣孔中；(8)將電泳裝置與電源相接，將電壓調到80V (約30min ),待指示澳酚藍泳動至分離膠時，將電壓調到120V,待澳酚藍泳動至分離膠底部時關掉電源(約 90min),取出聚丙烯 酰胺凝膠。2.轉膜(1)待電泳結束后，戴上手套，取下凝膠，確定樣品所在泳道，切除濃縮膠，測量實際電轉所用膠塊大小(長X寬)；(2)剪切6張濾紙和1張硝酸纖維素濾膜，濾紙和硝酸纖維素濾膜的大小需同凝膠 的大小完全相等或略小于凝膠；(3)將硝酸纖維素濾膜浸于去離子水中，使其完全濕潤，剪去一個角落作為記號，將6張濾紙浸泱于電轉緩沖液中；(4)按照如下順序于安裝電轉移裝置(如圖 15所示)：塑料夾板(黑色)海綿墊3張濾紙凝膠硝酸纖維素濾膜 3張濾紙海綿墊塑料夾板(白色)，每加一層，需要精確對齊，并用一玻璃棒作滾筒以擠出所有氣泡。擺放好后，將夾板固定于電轉槽中， 連接電源，根據(jù)凝膠面積按 0.65mA/cm2接通電流, 將電轉槽放置于冰水混合物中電轉移1h。圖18.電轉移裝置安裝示意圖3.免疫檢測(1)膜的封閉電轉移結束后，取出硝酸纖維素濾膜放入潔凈平板中，加入封閉液(含 10%脫脂奶的 PBST)10mL平放于水平搖床上室溫作用1h。(2)洗膜把硝酸纖維素濾膜放入一個新的平板中