脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗原理與操作步驟總(精)

1、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的實驗原理與操作步驟大全日期:2012-06-25來源:互聯(lián)網(wǎng) 作者:青嵐點擊:3644次摘要：細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀 法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)、 病毒介導(dǎo)白轉(zhuǎn)染等，理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 方法是具有高轉(zhuǎn)染效率、對細(xì)胞的毒性作用小等，本文主要介紹細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用的方 法-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理和操作步驟等。找產(chǎn)品，上生物幫>> >>細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等，理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法 是具有高轉(zhuǎn)染效率、對細(xì)胞的毒性作用小等，本文主要介紹細(xì)

2、胞轉(zhuǎn)染常用的方法- 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理和操作步驟 等。脂質(zhì)體(lipofectin regeant, LR 試劑是 陽離子脂質(zhì)體 N-1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA 和 Dioleoyl photidye- thanolamine(DOPE的混合物1:1(w/w。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng) 細(xì)胞中，是目前條件下最方便的 轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法 比它高 5100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各 種細(xì)胞。用LR進行轉(zhuǎn)染時，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞

3、適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做:第一，先要固定一個DNA的量和 DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時間，DNA可從15小刑孵育時間6小時開始， 按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定 出轉(zhuǎn)染時間(224小時。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為 宜。細(xì)胞種類:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為 受體細(xì)胞。一、脂質(zhì)體（liposome轉(zhuǎn)染方法原理脂質(zhì)體（liposome轉(zhuǎn)染方法原理：脂質(zhì)體（liposome作為體內(nèi)和體外輸送載體的 工具，已經(jīng)研究的十分廣泛，用合成的陽離子脂類包裹DNA，同

4、樣可以通過融合而進 人細(xì)胞。使用脂質(zhì)體將DNA帶人不同類型的真核細(xì)胞，與其它方法相比，有較高 的效率和較好的重復(fù)性。中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹 DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶 正電的陽離子脂質(zhì)體，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電 的DNA自動 結(jié)合到帶正電的 脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì) 胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被 導(dǎo)入細(xì)胞。二、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟1、操作步驟方法一：（1細(xì)胞培養(yǎng):取6孔培養(yǎng)板（或用35mm培養(yǎng)皿，向每孔中加入2mL含12 105 個細(xì)胞培養(yǎng)液，37c CO2培養(yǎng)至40%60%匯合時（匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì) 胞。（2轉(zhuǎn)染液制

5、備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液（為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量A 液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10 N g DNA,終量100 N L, B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2- 50卜gLR終量100卜L15輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn) 象，但并不妨礙 轉(zhuǎn)染（如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應(yīng)酌情減量。（3轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備:用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。（4轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37c溫箱置624小時，吸除無血 消轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(5其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。注意:轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對

6、轉(zhuǎn)染效率有很大影響。2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下方法二:(1以5 105細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24小時，使其達到 5060%板底面積。(2在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物 方法如下：在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA 。旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。室溫下放置510分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。(3棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直 接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37c培養(yǎng)35小時。(4再于 每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)1424小時，(5吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮1

7、0%FCS的DMEM , 2mL/孔，再培 養(yǎng)2448小時。(6用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：(1接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。(2DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前 (2、(3步驟。(3在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM , 37 c培養(yǎng)48小時。（4吸出DMEM ,用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,使細(xì)胞生長一定時間,篩選轉(zhuǎn)染 克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進行。三、個人經(jīng)驗：本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉(zhuǎn)染單層貼壁細(xì) 胞。（別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的 protocol1、轉(zhuǎn)

8、染前1天將0.52 >05細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生 素的完全培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合達9095%。2、準(zhǔn)備復(fù)合物（1將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。（2將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻， 室溫孵育5分。注意：必須在25分內(nèi)進行。（3 5分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無血清培養(yǎng)基（最好清洗細(xì)胞2次。4、將復(fù)合物（總體積100ul加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。5、將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育46h后,可以更換含血清培養(yǎng)液

9、去除復(fù)合物（也可不 用。6、2448h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達情況。7、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細(xì)胞以1:10（或更高比例 傳代，1天后更 換篩選培養(yǎng)基篩選。8、優(yōu)化:要保證細(xì)胞匯合率達 9095%（比較高；DNA/Lipofectamine2000比率1: 0.51:5，一般細(xì)胞 1:23.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的主要優(yōu)點是可用將 DNA轉(zhuǎn)染至懸浮或者鐵壁細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 效率相對 較高、對基因片段大小的限制較小等，但是陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞的毒性相對較高，為了防止其毒性，要摸索好如下實驗條件： 脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例、細(xì)胞轉(zhuǎn)染時間等。脂質(zhì)體是由脂雙分子層組成的顆粒，可介導(dǎo)基因穿過細(xì)胞膜。 通過脂質(zhì)體介

10、 導(dǎo) 比利用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進行 基因轉(zhuǎn)移 具有以下明顯的優(yōu)勢：脂質(zhì)體與基因的復(fù)合過 程 比較容易；易于大量生產(chǎn)；脂質(zhì)體是非病毒性載體，與細(xì)胞膜融合將目的 基因?qū)?入細(xì)胞后,脂質(zhì)即被降解，無毒,無免疫原性；DNA或RNA可得到保護,不被滅 活或被核酸酶降解；脂質(zhì)體攜帶的基因可能轉(zhuǎn)運至特定部位；體外和 體內(nèi)試 驗都表明，接近染色體大小的DNA片段也能被轉(zhuǎn)運至宿主基因組中并增長;轉(zhuǎn)染過程方便易行，重現(xiàn)性好。脂質(zhì)體是具有雙層膜的封閉式粒子，自身聚集性脂類分子包封內(nèi)水相介質(zhì)，可分 為大、小多層，寡多層和單室脂質(zhì)體，醫(yī)學(xué)應(yīng)用較多為小單室脂質(zhì)體?；谥|(zhì)體 作為藥物載體系統(tǒng)的經(jīng)驗，理想的用于轉(zhuǎn)運基因的脂質(zhì)體，對于

11、質(zhì)粒DNA具有高包 封率，保護DNA不被血漿核酶降解的特點,它們粒徑分布范圍窄，粒徑平均為100 nm或者更小。為使脂質(zhì)體接近血管外區(qū)域，故采用具有廣泛的結(jié)合潛力脂類，這種 特殊脂類可促進與細(xì)胞膜融合和域提高脂質(zhì)體在循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性。第1種為傳統(tǒng)上的脂質(zhì)體，人們可控制具體外行為，但不能控制具體 內(nèi)行為，它們很快被 滅活或被固定;第2種為無活性脂質(zhì)體（即不與外界作用，由于 聚合物包封于表面的立體穩(wěn)定性而抑制其相互作用 ；第3種脂質(zhì)體表面結(jié)合 抗原、 凝集素或其他基團，由于表面結(jié)合的特定配基，也可特定地相互作用；第4種為反應(yīng)活 性脂質(zhì)體，如離子型、靶敏感型和融合性脂質(zhì)體，這種脂質(zhì)體有時 指相轉(zhuǎn)變的多孔 脂質(zhì)體,脂質(zhì)體內(nèi)有 離子敏感亞基,Ca2+其他金屬 離子敏感性 脂質(zhì)體,也包括陽 離子脂質(zhì)體，陰離子脂質(zhì)體。陰離子脂質(zhì)體不屬于有反應(yīng)活性 類