酵母雙雜交操作步驟中文翻譯

1、（酵母菌儲存在-70C中，引物和質(zhì)粒DNA儲存在-20C中）概念：1 .次序車t化：指的是先將一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中（常是DNA-BD/baitplasmid）,在選擇培養(yǎng)基中選擇出陽性克隆，之后再將另外一個質(zhì)粒（ADfusionlibrary）轉(zhuǎn)化進(jìn)去。優(yōu)點：就是比共轉(zhuǎn)化使用更少的質(zhì)粒DNA,也就是節(jié)約質(zhì)粒DNA。2 .共同轉(zhuǎn)化：將兩種質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中。優(yōu)點：比次序轉(zhuǎn)化更容易操作。pGBKT7-的選擇物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7-的選擇物是：ampicillin（氨茉西林）？各種SD培養(yǎng)基：1） SD/-ade（腺喋吟）/-leu（亮氨酸）/-trp“四缺”）酵母氮源

2、（YNB：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.60g葡萄糖20g（即2%）2） SD/-leu/-trp/-his（1000ml）酵母氮源（YNB：6.7g;-leu/-trp/-hisDOsupplement0.62g;葡萄糖20g.（即2%）3） SD/-leu/-trp（1000ml）（?“二缺”酵母氮源（YNB>:6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.64g葡萄糖20g（即2%）（色氨酸）/-his（組氨酸）（1000ml）（?（購買來就配好的）；（購買來就配好的）（購買來就配好的）4） SD/-leu

3、（1000ml）酵母氮源（YNB>:6.7g;-leuDOsupplement0.69g;（購買來就配好的）葡萄糖20g（即2%）5） SD/-trp（1000ml）酵母氮源（YNB>:6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.74g;（購買來就配好的）葡萄糖20g（即2%）注意：YNBW兩種，一種含有硫酸胺，另外一種不含硫酸胺。我們這用的是含硫酸錢的。（買來就加進(jìn)去了的）。如果不含硫酸錢，那么要在終濃度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸錢，即最終在1000ml溶液中加入總量為6.7g的YN。硫酸俊。實際配制的方法是：1 .配制40%勺葡萄糖

4、貯存液（貯存在4C）,過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55C以下時，再將50ml葡萄糖貯存液加入。（過濾即可使用）2 .酵母氮源6.7g,力口DOsupplement在920ml水中溶解，調(diào)PH至5.8（大約加10MNaOH200ul即可），之后補(bǔ)水至950ml。3 .高壓完后待溫度降至55c以下，加入50ml40%葡萄糖。YPDW養(yǎng)基（1000ml）20g/L蛋白月東10g/L酵母提取物20g/L瓊脂（只有制作平板才用）20g/L葡萄糖（即2%）1xYPDA培養(yǎng)基（1000ml）20g/L蛋白月東10g/L酵母提取物0.03g/L腺喋吟（即終濃度為0.003%）腺喋吟可以耐受高溫20g/L

5、葡萄糖（即2%）實際配制的方法是：1 .配制40%勺葡萄糖貯存液（貯存在4C）,過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55C以下時，再將50ml葡萄糖貯存液加入。（李博士經(jīng)驗這一步不高壓，過濾即可使用）2 .配制0.2%的腺喋吟溶液，過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55c以下時，再將15ml腺喋吟溶液加入。（或?qū)⑾汆┮髦苯蛹舆M(jìn)去，為了方便我將直接加進(jìn)去一起高壓）3 .（蛋白月東20g;酵母提取物10g;水大約925ml）混合后，調(diào)至PH至6.5,加水至935ml,121c高壓15min。高壓的溫度和時間不能太長與太高，121c高壓15min即可?？梢栽赮PDA中力口入20g/L的瓊脂，以配成平板

6、。需要加kanamycin時，kan終濃度是10-15mg/L。（kanamycin可以20c貯存一個月,加入到平板中去可以4c貯存一個月。）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列貯存液來配制50%PEG3350:用滅菌水配，如需要可以加熱至50c以助溶。10XTEbuffer:用滅菌水配，如需要可以加熱至50c以助溶。10XLiAc:用滅菌水配，如需要可以加熱至50c以助溶。最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml為例）終濃度為配制10mlPEG/LiAc需要加入的物質(zhì)PEG400040%8mlof50%PEGTEbuffer1X1mlof10XTELiAc1X1mlof10XLiAc無

7、菌1xTE/LiAc溶液（用10x已滅菌的貯存液稀釋）10xTEbuffer:0.1MTris-HCl,10mMEDTA,pH7.5（高壓）10xLiAc:1M用稀醋酸調(diào)節(jié)PH至7.5高壓ForB-galactosidase濾膜實驗Zbuffer溶液:W2HPO4?NaH2PO4?7H2OH2OKClMgSO4最后調(diào)?7H2OPH至7.0,16.1g/L5.50g/L0.75g/L0.246g/L（如換Na2HPO4?（如換NaH2PO4?高壓，室溫下可以貯存1年14H2。則20.739g/L）2H2O貝U6.21g/L）X-gal溶液:X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至濃度為20mg

8、/ml.,N0避光保存Zbuffer/X-gal溶液：100mlZbuffer0.27ml3-mercaptoethanol（伊疏基乙醇）1.67mlX-gal貯存液ONPG容液：（即配即用）ONPG溶于Zbuffer中，終濃度4mg/ml，調(diào)PH至7.0.注意：1 .ONPG需要12h才能溶解2 .每次用之前新鮮制備。帶有B-航基乙醇的Zbuffer將0.27ml3-疏基乙酉I加入100mlZbuffer中即可為了轉(zhuǎn)化成功的小提示：1 .用一個13周齡（直徑23mm）的菌落去接種液體培養(yǎng)基。如果菌落直徑v2mm,就用多幾個菌落去接種。（也要大力渦旋使細(xì)胞團(tuán)分散開來。）2 .如果過夜或者3hr

9、之后的培養(yǎng)基明顯成塊，那么在使用之前一定要充分渦旋使培養(yǎng)基。3 .當(dāng)通過離心收集細(xì)胞的時候，使用一個離心管即可，可以更好、更充分地收集細(xì)胞。4 .為了提高轉(zhuǎn)化效率，要在1小時內(nèi)準(zhǔn)備酵母感受態(tài)細(xì)胞。如果有必要，可以在11步之后在室溫條件下儲存酵母感受態(tài)細(xì)胞幾個小時，而活性卻只有一點降低。5 .當(dāng)進(jìn)行通同轉(zhuǎn)化的時候，誘餌（BD）質(zhì)粒的量必須過度，而AD質(zhì)粒的量要不足。一般BD是AD的兩倍。（李博士：此要求一般是針對文庫篩選而言）6 .為了使菌落更好地生長，在涂布轉(zhuǎn)化復(fù)合物到瓊脂平板上時要直到所有液體被吸收?？梢赃x擇直徑5mm的無菌玻璃珠（每一個100mm的平板用5-7個玻璃珠，直徑150mm的平板

10、用7-9個玻璃珠）去促進(jìn)轉(zhuǎn)化復(fù)合物的擴(kuò)散，搖動的時候shaketheplatebackandforthnotroundandround.（科內(nèi)似并無此操作，而僅僅以玻棒涂布耳）1 .復(fù)蘇酪母：將酵母細(xì)胞接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)1-3周。（接種的時候采取四區(qū)分區(qū)畫線法）2 .酯母感受態(tài)細(xì)胞置備和轉(zhuǎn)化步驟：1 .取直徑23mm的克隆接種到1ml的YPD或SD培養(yǎng)基中。2 .劇烈振蕩或渦旋5min,使所有團(tuán)塊分散開來。3 .轉(zhuǎn)移酵母液到50mlYPD（?固體一一也有液態(tài)的，未加入瓊脂粉耳）或者SD培養(yǎng)基中。4 .置于30c搖床中，以250rpm的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)基1618h,直到OD600&g

11、t;1.55 .轉(zhuǎn)移部分過夜培養(yǎng)物（30ml）到300mlYPD培養(yǎng)基（？固體）中，使最終OD600在0.2-0.3之間。6 .30C搖床以230rpm的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)基34h直至OD為0.40.6.（IftheOD600is<0.4,somethingiswrongwiththeculture）7 .轉(zhuǎn)移酵母液至50ml離心管中，1000g室溫（2021°C）離心5min8 .棄去上清，加入2550ml無菌水或無菌的1xTE重懸酵母。9 .在1000g室溫（2021°C）條件下離心5min10 .輕輕倒出（棄去）上清11 .將細(xì)胞重懸于1.5ml新鮮準(zhǔn)備的，無菌的1x

12、TE/1xLiAc（在實驗開始之前置備）（至此酵母感受態(tài)細(xì)胞制備完畢）12 .向無菌的1.5ml微量離心管中加入質(zhì)粒DNA各0.1ug和0.1mg鮮魚精載體DNA,之后輕輕混勻。13 .再向每管中加入0.1ml酵母感受態(tài)細(xì)胞，并且震蕩混勻。14 .向每一管加入600ul無菌PEG/LiAc溶液，高速振蕩混勻。15 .30C搖床以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30min16 .向每一管加入70ulDMSO輕輕顛倒混勻，不要震蕩。17 .42C水浴熱激15min18 .取出后在冰上冷卻1-2min19 .1000rpm室溫離心5min,棄去上清。20 .用0.5ml無菌的1XTE重懸酵母。21 .取合

13、適體積的菌液（一般是100ul）涂在選擇性的SD培養(yǎng)基的平板上，在30c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天。（將克隆分成三份涂與不同平板上，1/3涂在SD/-His/-Leu/Trp,1/3涂在SD/Rde/4His/-Leu/口rp,最后1/3涂在SD/-Leu/干rp上。）（科內(nèi)僅涂布二缺與四缺板）（在21步之后涂一個二缺板和一個四缺板）因為在二缺板中AH109能生長，說明BD和AD已經(jīng)轉(zhuǎn)進(jìn)去了。如果在四缺板中能生長，說明誘餌和文庫肯定有作用，接著做一個“-gal實驗。如果是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到Y(jié)187中的話，21步之后涂一個二缺板就行了。如果酵母能生長的話就接著做一個3-gal。所以有的人同時轉(zhuǎn)化兩種菌種。這樣

14、就完全可以確定兩蛋白是否有作用了。之后計算轉(zhuǎn)化率，如果轉(zhuǎn)化率達(dá)到10的6次方以上，那么就可以接著做后面的檢驗實驗。三.a和B-gal實驗：（我就做B-gal試驗，要注意如果做B-gal的話，這時候菌種要換成Y187,而不是之前的AH109（在protocol的2428頁）1 .試齊1J：2 .原理：ONPG為無色物質(zhì)，在3-半乳糖昔酶的作用催化下生成黃色的onitrophenol（硝基苯酚）,在420nm（OD410）處有光吸收。Na2CO3可以提高PH值，使酶變性，從而終止反應(yīng)。（Na2CO3在配制時，不需要高壓）3 .實驗方法一.Colony-liftFilterAssay（濾膜分析或濾膜

15、試驗）（這是定性試驗）a）將要測試的菌株（直徑1-3mm）轉(zhuǎn)接到新的選擇性SD培養(yǎng)基中，30c培養(yǎng)2-4天。b）準(zhǔn)備Zbuffer/X-gal溶液。c）為每一個要測試的平板準(zhǔn)備好一張無菌的Whatman濾紙，置于100mm或150mm無菌平板中用2.5-5mlZbuffer/X-gal溶液浸泡。d）用無菌的鐐子小心地將無菌Whatman濾紙覆蓋到平板表面，要使所有的待測菌株都有部分沾到濾紙上。e）用注射器在濾紙上打3個或更多的不對稱的孔，以標(biāo)志方向。f）濾紙放入液氮中0.51min至結(jié)冰，之后再放置于室溫融化，如此反復(fù)凍融3次。g）小心地將帶有菌株的濾紙放到預(yù)浸泡的濾紙上，有菌株一面向上，注意

16、兩層濾紙中間不要有氣泡。h）平板放到30c培養(yǎng)箱中，觀察其是否變藍(lán)。一般陽性克隆在0.58h內(nèi)會變藍(lán)，超過8h容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。二.LiquidCultureAssay（以O(shè)NPG為底物的液體培養(yǎng)法）（這是定量試驗）1） 在合適的SD培養(yǎng)基中制備5ml過度培養(yǎng)物。注意：你所選用的SD培養(yǎng)基要適合你所用的系統(tǒng)和質(zhì)粒。2） 在進(jìn)行實驗當(dāng)天，將ONPG以4mg/ml的濃度溶于Zbuffer中，振蕩12h確保完全溶解。3） 大力渦旋過夜培養(yǎng)基1min以分散細(xì)胞團(tuán)塊，立即轉(zhuǎn)移2ml（0.5ml）過夜培養(yǎng)基物到8ml（2ml）YPD培溶液中。（以25%的含量加）4） 30c培養(yǎng)35h（230-250rp

17、m）直至細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期（1ml溶液的OD600應(yīng)在0.5-0.8之間）在收獲細(xì)胞的同時記錄OD600值。注意：在檢測OD值的時候，渦旋培養(yǎng)基0.5-1ml以分散細(xì)胞團(tuán)塊5） 各吸取1.5ml（0.5ml）培養(yǎng)物到各3個1.5ml離心管（每個管子就是1.5ml）,離心14000rpm/30sec。6） 小心移去上清，加上1.5ml（0.5ml）Zbuffer到每個管中，渦旋直到細(xì)胞重懸。7） 再次離心并移去上清，加上300ul（100ul）Zbuffer到每個管中，渦旋直到細(xì)胞重懸。這樣，終濃度就是1.5/0.3=5倍。注意：在這個清洗步驟之后，細(xì)胞收獲物的差異可以通過再次讀取OD600值來

18、糾正。8） 轉(zhuǎn)移0.1ml細(xì)胞懸液至新的離心管中。9） 將細(xì)胞置于液氮中（約0.51min）直至細(xì)胞冰凍。10）將離心管放于37c水浴中0.51min使其融化。11）反復(fù)凍融3次（重復(fù)9和10步）確保細(xì)胞裂解。12）用100ulZbuffer.來設(shè)置一個空白對照。13）力口0.7ml的Zbuffer與3-疏基乙醇到反應(yīng)管和空白管中注意：在冰凍之前不要加Zbuffer14）立即加160ulONPG（溶于Zbuffer中）至各反應(yīng)管和空白管中，開始計時。15）將各管放入30c水浴中。16）待出現(xiàn)黃色后，力口0.4ml的1MNa2CO3至各反應(yīng)管和空白管中，以分鐘計算消退時間。注意：需要的時間可能會變化，（對于單個的3-gal陽性對照質(zhì)粒約需315min,對于雙雜交陽性對照約30min,弱的反應(yīng)可能需24h.）黃色不穩(wěn)定，并且隨時間延長可能加劇。每一批需要做一個新的空白管。17）14,000rpm離心10min,以除去細(xì)胞碎片。18）仔細(xì)小心轉(zhuǎn)移上清到清潔比色杯中。注意：如果上清中若混有細(xì)胞碎片，將嚴(yán)重干擾本