體外抗菌實(shí)驗(yàn)-18

1、 第二十章第二十章 藥物的體外抗菌試驗(yàn)藥物的體外抗菌試驗(yàn)藥物的體外抗菌試驗(yàn)藥物的體外抗菌試驗(yàn) 藥物的體外抗菌試驗(yàn)是在體外測定微藥物的體外抗菌試驗(yàn)是在體外測定微生物對(duì)藥物敏感程度的試驗(yàn)，生物對(duì)藥物敏感程度的試驗(yàn)， 已廣泛地應(yīng)用于科研、生產(chǎn)和臨床。如抗菌已廣泛地應(yīng)用于科研、生產(chǎn)和臨床。如抗菌藥物的篩選、提取過程中的追蹤、抗菌譜的定、藥物的篩選、提取過程中的追蹤、抗菌譜的定、藥物含量的測定、藥物血濃度測定、指導(dǎo)臨床用藥物含量的測定、藥物血濃度測定、指導(dǎo)臨床用藥的藥敏試驗(yàn)等。藥的藥敏試驗(yàn)等?？咕囼?yàn)包括抑蔭試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)?？咕囼?yàn)包括抑蔭試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)。抑菌：抑菌：即抑制微生物的生長繁殖，但不能殺死微

2、即抑制微生物的生長繁殖，但不能殺死微 生物，在藥物除去后微生物又能生長生物，在藥物除去后微生物又能生長.殺菌：殺菌：即能殺死微即能殺死微 生物，當(dāng)藥物除去后，微生生物，當(dāng)藥物除去后，微生 物也不能再生長繁殖。物也不能再生長繁殖。 第一節(jié)第一節(jié) 常用的體外抑菌試驗(yàn)常用的體外抑菌試驗(yàn)連續(xù)稀釋法：連續(xù)稀釋法： 可用于測定藥物的最低抑菌濃度可用于測定藥物的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺和最低殺菌濃度菌濃度(MBC)?？梢杂靡后w培養(yǎng)基，也可用固體培。可以用液體培養(yǎng)基，也可用固體培養(yǎng)基。養(yǎng)基。1液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 2固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 分平板法和斜面分平板法和斜

3、面 法。法。 瓊脂擴(kuò)散法：瓊脂擴(kuò)散法： 是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，在藥是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，在藥物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，以物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，以抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來評(píng)價(jià)藥物抗菌作抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來評(píng)價(jià)藥物抗菌作用強(qiáng)弱。用強(qiáng)弱。1、濾紙片法、濾紙片法 適用于新藥的初篩試驗(yàn)。適用于新藥的初篩試驗(yàn)。2打孔法打孔法 適于藥物血濃度的監(jiān)測。適于藥物血濃度的監(jiān)測。3挖溝法挖溝法 適用于在一個(gè)平板上試驗(yàn)一種藥物對(duì)幾種試驗(yàn)適用于在一個(gè)平板上試驗(yàn)一種藥物對(duì)幾種試驗(yàn)菌的抗菌作用。菌的抗菌作用。 第二節(jié)第二節(jié) 殺菌試驗(yàn)殺菌試驗(yàn)用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)微

4、生物的致死活性。用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物的致死活性。最低殺菌濃度：最低殺菌濃度： 指該藥物能殺死細(xì)菌的最低濃度。從對(duì)微生指該藥物能殺死細(xì)菌的最低濃度。從對(duì)微生物廣義而言，也可稱之為最低致死濃度物廣義而言，也可稱之為最低致死濃度(MLC)。 是將待檢藥物先以合適的液體培養(yǎng)基在試管內(nèi)進(jìn)行連續(xù)稀釋，每管內(nèi)再加入一定量的試驗(yàn)菌液，培養(yǎng)后可得該藥物的MIC，取MIC終點(diǎn)以上未長菌的各管培養(yǎng)液，分別移種于另一無菌平板上，培養(yǎng)后凡平板上無菌生長的藥物最低濃度即為該藥物的MBC(或MLC)。 活菌計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)法 是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的試驗(yàn)菌，是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的試驗(yàn)菌，作用一定時(shí)間后，

5、取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，從存活的微生作用一定時(shí)間后，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，從存活的微生物數(shù)計(jì)算出藥物對(duì)微生物的致死率。物數(shù)計(jì)算出藥物對(duì)微生物的致死率。石炭酸系數(shù)（又稱酚系數(shù)）石炭酸系數(shù)（又稱酚系數(shù)） 是以石炭酸為標(biāo)準(zhǔn)，在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，作用是以石炭酸為標(biāo)準(zhǔn)，在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，作用一定時(shí)間，將待測的化學(xué)消毒劑與石炭酸對(duì)傷寒沙門一定時(shí)間，將待測的化學(xué)消毒劑與石炭酸對(duì)傷寒沙門菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較，菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較， 所得殺菌所得殺菌效力的比值。效力的比值。 棋盤格法棋盤格法 是由于在試驗(yàn)時(shí)，含兩種不同濃度是由于在試驗(yàn)時(shí)，含兩種不同濃度藥物的試管排列呈棋盤狀而得名，藥物的試管

6、排列呈棋盤狀而得名， 用以用以評(píng)價(jià)兩種藥物同時(shí)用不同濃度進(jìn)行聯(lián)合評(píng)價(jià)兩種藥物同時(shí)用不同濃度進(jìn)行聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)的抗菌活性。試驗(yàn)時(shí)的抗菌活性。 第三節(jié)第三節(jié) 聯(lián)合抗菌試驗(yàn)聯(lián)合抗菌試驗(yàn) 在藥學(xué)上作中，常需檢查兩種抗菌藥物在藥學(xué)上作中，常需檢查兩種抗菌藥物在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的相互作用以及抗菌藥物與不在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的相互作用以及抗菌藥物與不同同pH值或不同離子溶液的相互影響。如加強(qiáng)值或不同離子溶液的相互影響。如加強(qiáng)藥物抗菌作用的為藥物抗菌作用的為協(xié)同協(xié)同(synergism)；減弱藥；減弱藥物作用的為物作用的為拮抗拮抗(antagonism)；相互無影響的；相互無影響的為為無關(guān)無關(guān)(indjfference)；作用

7、為二者之和的為；作用為二者之和的為累累加加(addition)。 紙條試驗(yàn)紙條試驗(yàn) 即在已接種試驗(yàn)菌的平板表面垂直放置兩條各浸有即在已接種試驗(yàn)菌的平板表面垂直放置兩條各浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強(qiáng)、減弱或一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強(qiáng)、減弱或無影響來判斷它們?cè)诼?lián)合應(yīng)用時(shí)的效應(yīng)。無影響來判斷它們?cè)诼?lián)合應(yīng)用時(shí)的效應(yīng)。梯度平板紙條試驗(yàn)梯度平板紙條試驗(yàn) 需先制備含藥的梯度平板。將試驗(yàn)菌懸液涂布于需先制備含藥的梯度平板。將試驗(yàn)菌懸液涂布于平板表面，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯度平板平板表面，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯度平板中藥物濃度遞減的方向置于平板表面。培養(yǎng)后，如該中藥

8、物濃度遞減的方向置于平板表面。培養(yǎng)后，如該待檢藥液對(duì)平板內(nèi)的藥物有加強(qiáng)作用，則可見沿紙條待檢藥液對(duì)平板內(nèi)的藥物有加強(qiáng)作用，則可見沿紙條兩邊的抑菌區(qū)被擴(kuò)大。兩邊的抑菌區(qū)被擴(kuò)大。 第四節(jié)第四節(jié) 體外抗菌試驗(yàn)的影響因素體外抗菌試驗(yàn)的影響因素1試驗(yàn)菌試驗(yàn)菌 在抗菌試驗(yàn)中所用試驗(yàn)菌一般應(yīng)該用標(biāo)在抗菌試驗(yàn)中所用試驗(yàn)菌一般應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)菌株。準(zhǔn)菌株。2培養(yǎng)基培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的質(zhì)量須加控制。培養(yǎng)基的質(zhì)量須加控制。3抗菌藥物抗菌藥物 藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗(yàn)的藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗(yàn)的結(jié)果，需要精確配制。結(jié)果，需要精確配制。 第二十一章第二十一章藥物制劑的微生物學(xué)檢查藥物制劑的微生物學(xué)檢查 藥物制劑的

9、微生物學(xué)檢查藥物制劑的微生物學(xué)檢查 藥物制劑的微生物學(xué)檢查主要包藥物制劑的微生物學(xué)檢查主要包括無菌檢驗(yàn)，細(xì)菌總數(shù)測定，霉菌總括無菌檢驗(yàn)，細(xì)菌總數(shù)測定，霉菌總數(shù)測定，以及病原菌的檢驗(yàn)與螨的檢數(shù)測定，以及病原菌的檢驗(yàn)與螨的檢測等。測等。 第一節(jié)第一節(jié) 無菌制劑的無菌檢查無菌制劑的無菌檢查（一）一般藥品的無菌檢查（一）一般藥品的無菌檢查 一般藥品的無菌檢查法屬于直接接種法，即一般藥品的無菌檢查法屬于直接接種法，即將檢品按規(guī)定量直接分別接種于適宜需氧菌、厭將檢品按規(guī)定量直接分別接種于適宜需氧菌、厭氧菌和真菌生長繁殖的一定量的培養(yǎng)基中，同時(shí)氧菌和真菌生長繁殖的一定量的培養(yǎng)基中，同時(shí)以同樣的培養(yǎng)基作陽性對(duì)

10、照試驗(yàn)。以同樣的培養(yǎng)基作陽性對(duì)照試驗(yàn)。 我國藥典規(guī)定以金黃色葡萄球菌我國藥典規(guī)定以金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003、生袍梭狀芽胞桿菌、生袍梭狀芽胞桿菌CMCC(B)64941、白、白假絲酵母菌假絲酵母菌CMCC(F)98001作為需氧菌、厭氧作為需氧菌、厭氧菌和真菌的陽性對(duì)照菌株。菌和真菌的陽性對(duì)照菌株。 （二）特殊藥品的無菌檢查法（二）特殊藥品的無菌檢查法 如果陽性對(duì)照管不長菌，則必須進(jìn)行特殊處如果陽性對(duì)照管不長菌，則必須進(jìn)行特殊處理后方可按照一般藥品的無菌檢查法進(jìn)行。理后方可按照一般藥品的無菌檢查法進(jìn)行。1油類藥物的無菌檢查油類藥物的無菌檢查 一般油劑因與常規(guī)培養(yǎng)基不混溶，藥品中的

11、一般油劑因與常規(guī)培養(yǎng)基不混溶，藥品中的微生物不易生長，所以一般可采用吐溫培養(yǎng)基，微生物不易生長，所以一般可采用吐溫培養(yǎng)基，其余同一般藥品無菌檢查法。其余同一般藥品無菌檢查法。 2抗菌藥物或含防腐劑藥物的無菌檢查抗菌藥物或含防腐劑藥物的無菌檢查 如果被檢藥品具有抗菌作用，陽性對(duì)照管及試驗(yàn)如果被檢藥品具有抗菌作用，陽性對(duì)照管及試驗(yàn)管均可能不長菌。因此在進(jìn)行無菌檢查前必須采用一管均可能不長菌。因此在進(jìn)行無菌檢查前必須采用一些方法除去藥物本身的抗菌作用，然后再依上述方法些方法除去藥物本身的抗菌作用，然后再依上述方法進(jìn)行無菌檢查。進(jìn)行無菌檢查。(1)加入滅活劑加入滅活劑(2)微孔濾膜法微孔濾膜法(3)稀

12、釋法稀釋法(4)離心沉淀法離心沉淀法 第二節(jié)第二節(jié) 口服藥及外用藥物的微生物學(xué)檢查口服藥及外用藥物的微生物學(xué)檢查 目前對(duì)口服藥及外用藥物的微生物目前對(duì)口服藥及外用藥物的微生物學(xué)檢驗(yàn)主要是微生物限量檢驗(yàn)，即限制學(xué)檢驗(yàn)主要是微生物限量檢驗(yàn)，即限制口服藥及外用藥的微生物總數(shù)和限制病口服藥及外用藥的微生物總數(shù)和限制病原微生物種類的系列測定項(xiàng)目。原微生物種類的系列測定項(xiàng)目。 我國規(guī)定的項(xiàng)目有：我國規(guī)定的項(xiàng)目有： 細(xì)菌總數(shù)測定，霉菌總數(shù)測定。病原菌細(xì)菌總數(shù)測定，霉菌總數(shù)測定。病原菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌和破傷風(fēng)梭菌菌、沙門菌和破傷風(fēng)梭菌)的

13、檢驗(yàn)和活螨的檢的檢驗(yàn)和活螨的檢驗(yàn)等。驗(yàn)等。判斷合格與否的標(biāo)準(zhǔn)是：判斷合格與否的標(biāo)準(zhǔn)是： 口服藥及外用藥中微生物總量須低于規(guī)定口服藥及外用藥中微生物總量須低于規(guī)定限量外，并須在口服藥物每克或每毫升中不得限量外，并須在口服藥物每克或每毫升中不得含有大腸埃希菌、沙門菌；外用藥物每克或每含有大腸埃希菌、沙門菌；外用藥物每克或每毫升中不得含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球毫升中不得含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和破傷風(fēng)梭菌，此外均不得檢出活螨。菌和破傷風(fēng)梭菌，此外均不得檢出活螨。 細(xì)菌總數(shù)的測定細(xì)菌總數(shù)的測定: 是了解被檢藥品在單位重量或體積是了解被檢藥品在單位重量或體積(每克每克或每毫升或每毫升)內(nèi)所含

14、有的活菌數(shù)內(nèi)所含有的活菌數(shù)(實(shí)際是需氧菌實(shí)際是需氧菌的活菌數(shù)的活菌數(shù))，以判斷供試藥物被細(xì)菌污染的程，以判斷供試藥物被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)該藥品整個(gè)生產(chǎn)過程的衛(wèi)生學(xué)總評(píng)度，是對(duì)該藥品整個(gè)生產(chǎn)過程的衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的一個(gè)重要依據(jù)。價(jià)的一個(gè)重要依據(jù)。 霉菌和酵母菌總數(shù)的測定：霉菌和酵母菌總數(shù)的測定： 是考察供試藥物中每克或每毫升所含是考察供試藥物中每克或每毫升所含的活霉菌和酵母菌的總數(shù)，以判明檢品被的活霉菌和酵母菌的總數(shù)，以判明檢品被真菌污染的程度。真菌污染的程度。 病原菌檢驗(yàn)的原則病原菌檢驗(yàn)的原則： 病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征的觀察是鑒別的基病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征的觀察是鑒別的基本要求，對(duì)生化反應(yīng)、血清

15、學(xué)反應(yīng)、動(dòng)物毒力試本要求，對(duì)生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、動(dòng)物毒力試驗(yàn)等項(xiàng)目的要求因菌而異，各有其側(cè)重點(diǎn)驗(yàn)等項(xiàng)目的要求因菌而異，各有其側(cè)重點(diǎn)。 一般的檢測程序?yàn)椋阂话愕臋z測程序?yàn)椋核幬锏臏?zhǔn)備或預(yù)處理藥物的準(zhǔn)備或預(yù)處理增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)純純培養(yǎng)培養(yǎng)染色鏡檢、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、動(dòng)物染色鏡檢、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)等試驗(yàn)等結(jié)果判斷。結(jié)果判斷。 凡由檢品中檢出大腸埃希菌時(shí)，表明該藥品可能凡由檢品中檢出大腸埃希菌時(shí)，表明該藥品可能被糞便污染，患者服用后，有被糞便中可能存在的其被糞便污染，患者服用后，有被糞便中可能存在的其他腸道致病菌和寄生蟲卵等病原體感染的危險(xiǎn)。因此，他腸道致病菌和寄生

16、蟲卵等病原體感染的危險(xiǎn)。因此，口服藥品中不得檢出大腸埃希菌?？诜幤分胁坏脵z出大腸埃希菌。檢驗(yàn)要點(diǎn)：檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陰性短小無芽胞桿菌。形態(tài)：革蘭陰性短小無芽胞桿菌。(2)分離培養(yǎng)：在伊紅美蘭（分離培養(yǎng)：在伊紅美蘭（EMB)培養(yǎng)基上分解乳培養(yǎng)基上分解乳 糖，產(chǎn)生紫黑色、有金屬光澤的菌落。糖，產(chǎn)生紫黑色、有金屬光澤的菌落。 (3)生化反應(yīng)：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)生化反應(yīng)：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；氣；IMViC試驗(yàn)：試驗(yàn)：+-，注意與產(chǎn)氣桿菌相區(qū)別。，注意與產(chǎn)氣桿菌相區(qū)別。1、大腸埃希菌、大腸埃希菌 檢驗(yàn)要點(diǎn)：檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陰性短小桿菌。形態(tài)：革蘭陰性短

17、小桿菌。(2)分離培養(yǎng)：分離培養(yǎng)：SS瓊脂上，沙門菌不分解乳糖，產(chǎn)瓊脂上，沙門菌不分解乳糖，產(chǎn)生生H2S，菌落無色、透明或半透明，圓形，邊緣整，菌落無色、透明或半透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，菌落中心呈黑褐色。齊，表面光滑濕潤，菌落中心呈黑褐色。EMB平平板上菌落呈無色或粉紅色。二糖鐵培養(yǎng)基板上菌落呈無色或粉紅色。二糖鐵培養(yǎng)基TSl上分上分解葡萄糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解乳糖、蔗糖，有動(dòng)力、解葡萄糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解乳糖、蔗糖，有動(dòng)力、產(chǎn)生黑色沉淀。產(chǎn)生黑色沉淀。(3)生化反應(yīng)：見表生化反應(yīng)：見表21l。(4)血清學(xué)反應(yīng)：用可疑菌作為抗原，沙門菌血清學(xué)反應(yīng)：用可疑菌作為抗原，沙門菌AF組的多價(jià)

18、血清作為抗體進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)，并以生組的多價(jià)血清作為抗體進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)，并以生理鹽水做對(duì)照試驗(yàn)。理鹽水做對(duì)照試驗(yàn)。 2、沙門菌、沙門菌 3、銅綠假單胞菌、銅綠假單胞菌檢驗(yàn)要點(diǎn)：檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陰性短桿菌。形態(tài)：革蘭陰性短桿菌。(2)分離培養(yǎng)：在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上菌分離培養(yǎng)：在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上菌落扁平，無定形，濕潤，周邊擴(kuò)散或略有蔓延，灰落扁平，無定形，濕潤，周邊擴(kuò)散或略有蔓延，灰白色，培養(yǎng)基上擴(kuò)散有水溶性綠色色素。白色，培養(yǎng)基上擴(kuò)散有水溶性綠色色素。(3)生化反應(yīng)：氧化酶試驗(yàn)陽性，綠膿菌素試驗(yàn)陽性，生化反應(yīng)：氧化酶試驗(yàn)陽性，綠膿菌素試驗(yàn)陽性，可報(bào)告檢出銅綠假單

19、胞菌。如綠膿菌素陰性，必須可報(bào)告檢出銅綠假單胞菌。如綠膿菌素陰性，必須明膠液化試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，明膠液化試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，42生生長試驗(yàn)陽性，才可報(bào)告被檢品檢出銅綠假單胞菌。長試驗(yàn)陽性，才可報(bào)告被檢品檢出銅綠假單胞菌。 4、金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)要點(diǎn)：檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陽性球菌，葡萄狀排列。形態(tài)：革蘭陽性球菌，葡萄狀排列。(2)分離培養(yǎng)及生化試驗(yàn)：見表分離培養(yǎng)及生化試驗(yàn)：見表21-3如分離培養(yǎng)的可疑菌甘露醇和血漿凝固酶如分離培養(yǎng)的可疑菌甘露醇和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽性，則可判斷為檢出金黃色葡試驗(yàn)均為陽性，則可判斷為檢出金黃色葡萄球菌。萄球菌。 5、破傷風(fēng)梭菌、破傷風(fēng)梭菌 檢驗(yàn)要點(diǎn)：檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陽性芽胞梭菌，菌體細(xì)長，帶芽胞的菌形態(tài)：革蘭陽性芽胞梭菌，菌體細(xì)長，帶芽胞的菌體呈鼓楷狀。有周鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，不形成英膜。體呈鼓楷狀。有周鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，不形成英膜。(2)分離培養(yǎng)：葡萄糖疤肉培養(yǎng)基中生長