仔豬黃痢病原菌藥敏實(shí)驗(yàn)

1、引言仔豬黃痢是由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的臨床常見(jiàn)的傳染病，又稱初生仔豬大腸桿菌病或仔豬早發(fā)性大腸桿菌病, 大腸桿菌是Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，一直被當(dāng)作正常腸道菌群的組成成分，認(rèn)為是非致病菌。直到20世紀(jì)中葉，才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，尤其是對(duì)嬰兒和幼畜（禽），常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥1。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）是一類致人和幼畜（初生仔豬、犢牛、羔羊及斷奶仔豬）腹瀉最常見(jiàn)的病原性大腸桿菌，由粘附素和腸毒素共同作用而致病。初生幼畜被ETEC感染后常因劇烈水樣腹瀉所致脫水而死亡，發(fā)病率和死亡率均很高，如仔豬黃痢。在豬的規(guī)?；B(yǎng)殖中，仔豬

2、黃痢是危害嚴(yán)重的常見(jiàn)多發(fā)病之一，仔豬十分易感。該病具有很強(qiáng)的條件致病性，飼養(yǎng)管理不良，豬舍衛(wèi)生條件差，天氣驟變，供水不足和擁擠等諸多應(yīng)激因素均可使豬只抵抗力降低而誘發(fā)本病。仔豬黃痢、白痢在世界各地均有報(bào)道，美國(guó)新生仔豬下痢中48% 是由大腸桿菌引起的。朱瑞民( 1988) 統(tǒng)計(jì)表明, 臺(tái)灣有15 25%的仔豬因此病無(wú)法育成, 每年直接損失316 619 億元; 據(jù)統(tǒng)計(jì), 我國(guó)1997 年1 6 月豬大腸桿菌病發(fā)病數(shù)104511 頭, 直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)5 千萬(wàn)元以上。由于仔豬黃、白痢及與其他病混合感染, 使提仔豬死亡率達(dá)60% 以上。隨著養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，該病發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，危害十分嚴(yán)重，

3、造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失5。近些年來(lái)，抗菌藥物的耐藥性變?yōu)槿蜿P(guān)注的熱點(diǎn)，英國(guó)上議院和WHO報(bào)告表明抗菌藥在家畜中的濫用和不合理應(yīng)用是抗菌藥物耐藥性產(chǎn)生的重要源頭。由于抗菌藥物的長(zhǎng)期使用，造成豬源大腸桿菌耐藥株越來(lái)越多，耐藥譜越來(lái)越廣，多重耐藥性呈上升趨勢(shì)。方雨玲6等(1992)用18種抗菌藥物對(duì)231株ETEC菌株進(jìn)行了敏感性結(jié)果表明氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、氯霉素、磺胺、痢特靈等原來(lái)對(duì)革蘭氏陰性桿菌有很強(qiáng)抑菌或殺菌作用的藥耐藥性顯著增加，四環(huán)素、土霉素等已極少有敏感菌株，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌殺菌作用的紅霉素等對(duì)本菌基本沒(méi)有作用。因此有必要通過(guò)大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)為臨床用藥提供依據(jù)

4、。1 材料和方法 11 實(shí)驗(yàn)材料臨床菌株：從黃痢仔豬中經(jīng)分離鑒定得到的大腸桿菌藥敏質(zhì)控菌株：ATCC 25922大腸桿菌，購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所 藥敏紙片：潔霉素、強(qiáng)力霉素、紅霉素、四環(huán)素、卡那霉素、青霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明、羧芐青霉素、先鋒霉素IV、先鋒霉素V 、丁胺卡那霉素、磺胺甲基異惡唑、環(huán)丙沙星、奧復(fù)星、新霉素 、鏈霉素、慶大霉素、阿莫西林、恩諾沙星、氟苯尼考購(gòu)于佰易聚生物商城 抗菌藥物貯存液：卡那霉素溶液、鹽酸恩諾沙星水溶液購(gòu)于浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司，批號(hào)：110131291普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 凈化工作臺(tái)、天平、試管、三角瓶

5、、培養(yǎng)皿 、酒精燈、高壓滅菌鍋、干燥箱、培養(yǎng)箱、酒精燈、鑷子、接種環(huán)、玻璃移液管、移液槍、試管架、燒杯、玻璃棒、游標(biāo)卡尺。1.3 培養(yǎng)基的制備1.3.1 普通肉湯培養(yǎng)基的配制步驟：（1） 稱量 用天平按以下劑量稱取各種試劑（先稱取鹽類再稱蛋白胨及牛肉膏）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g準(zhǔn)確稱量，置于燒杯中再加入1000ml蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?。粉末狀原料用濾紙直接稱量，固體狀用燒杯稱量。 （2） 配制 將上述成分混合加熱溶解，攪拌使其混合均勻，以看到氣泡完全溶解為宜。加熱時(shí)要控制火力，不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，并注意補(bǔ)充蒸發(fā)的水分。 （3） 調(diào)節(jié)PH值 待配制好的培養(yǎng)基稍微冷卻后，用玻璃棒蘸取少

6、許，用標(biāo)準(zhǔn)pH試紙測(cè)其酸堿度，初配好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液是偏酸性的，故要用NaOH調(diào)整。為避免過(guò)堿，應(yīng)緩慢加入NaOH，邊加邊攪拌，并不時(shí)地用PH試紙測(cè)試，調(diào)整pH至7.2-7.4。也可以取培養(yǎng)基5ml于干凈試管中，逐滴加入NaOH調(diào)pH至7.4-7.6，并記錄NaOH的用量，再換算出培養(yǎng)總體積中須加入NaOH數(shù)量，即可調(diào)至所需的pH范圍。（4） 過(guò)濾 將pH測(cè)定后的肉湯培養(yǎng)基用濾紙過(guò)濾（5） 分裝根據(jù)需要，將完全溶解并調(diào)好pH的肉湯培養(yǎng)基溶液，乘熱倒入三角瓶（裝量不超過(guò)容積1/2）和試管（裝量為管長(zhǎng)的1/4-1/5），然后給三角瓶和試管都塞上棉花塞。試管要擺成斜面，可在桌子上放一跟玻璃棒，然

7、后再把試管口一邊放在玻璃棒上是培養(yǎng)基溶液形成斜面。（6） 滅菌將分裝好且塞上棉塞的三角瓶用報(bào)紙包住并用繩子綁緊；將分裝好的試管塞上棉塞，再用報(bào)紙包住試管口的那一段，一次可以包810支，然后用繩子綁住，放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的套筒中，將滅菌鍋蓋的排氣管插如套筒側(cè)壁的凹槽內(nèi)，關(guān)閉滅菌鍋蓋旋緊螺栓，高壓滅菌，121滅菌15-30min.1.3.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制固體培養(yǎng)基的配置中，在稱量、調(diào)配、PH值調(diào)節(jié)上都與液體培養(yǎng)基一致。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g,氯化鈉5g,瓊脂14g，蒸餾水1000ml，最終PH 7.2±0.2。(1)分裝將校正PH值后的培養(yǎng)基趁熱分別裝入

8、試管（裝量為管長(zhǎng)的1/4-1/5），試管培養(yǎng)基要做成斜面（可在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放一支玻璃棒）。(2)滅菌把分裝好的試管培養(yǎng)基用棉塞塞住試管口，用報(bào)紙包好，再用繩子綁緊，放入高壓滅菌鍋內(nèi)開(kāi)始滅菌。(3)倒平皿在超凈工作臺(tái)上點(diǎn)上酒精燈，把三角瓶?jī)?nèi)已滅菌好的培養(yǎng)基倒入已滅菌好的培養(yǎng)皿。注：倒平皿時(shí)要在酒精燈下操作，平皿口和三角瓶口先在酒精燈上烘烤一會(huì)兒再開(kāi)始倒平皿，倒好后搖晃平皿使其均勻覆蓋在平皿底部，放置一邊使其冷卻。選用90mm的培養(yǎng)皿，裝量約為20mm，待冷卻固定后倒置。1.4 培養(yǎng)基的培養(yǎng)把上述配制滅菌好的培養(yǎng)基放在37恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)左右，平皿要倒置培養(yǎng)。待培養(yǎng)后觀察其細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)

9、方可使用。2.試驗(yàn)方法2.1平板菌落計(jì)數(shù)法(1) 編號(hào) 取無(wú)菌培養(yǎng)皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-4、10-5、10-6各3套，另取8支盛有4.5ml無(wú)菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。(2)稀釋 用1ml無(wú)菌吸管精確地吸取0.5ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出事，管內(nèi)液外外溢。然后仍用此吸管將管內(nèi)懸吸時(shí)伸入管底，吹時(shí)離開(kāi)水面，使其混合均勻。另取一支吸管自10-1試管吸0.5ml放入10-2試管中，吸吹三次，其余依次類推。液來(lái)回吸吹三次。(3)取樣 用3支1ml無(wú)菌吸管分別精

10、確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液0.2ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。 (4)倒平板 于上述盛有不同稀釋度菌液的培養(yǎng)皿中，倒入溶化后冷卻至45左右的普通瓊脂培養(yǎng)基約10-15ml，置水平位置，迅速旋轉(zhuǎn)混勻，待凝固后，倒置于37溫度中培養(yǎng)24h。(5)計(jì)數(shù) 培養(yǎng)24h小時(shí)后，取出培養(yǎng)皿，算出同一稀釋度三個(gè)培養(yǎng)皿上的菌落平均數(shù)，并計(jì)算每毫升中活菌總數(shù)。計(jì)數(shù)平均結(jié)果為每毫升中活菌總數(shù)為4.4×108CFU/ml,可判斷菌落數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)行藥敏紙片擴(kuò)散試驗(yàn)。2.2藥敏紙片擴(kuò)散法2.2.1標(biāo)準(zhǔn)濁度管的配制 0.5麥?zhǔn)媳葷峁芘渲品椒ǎ号渲?.048M BaCL2 (1.17

11、% W/V BaCL2 . 2H2O)0.5ml和0.36N H2SO4 (1%, V/V)99.5ml。將二液混合搖勻，置試管中，每管裝4-6ml，其濁度相當(dāng)于麥?zhǔn)媳葷峁艿谝还艿?/2，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6月，使用前充分搖勻，在自然光下透光比濁。2.2.2菌株的培養(yǎng)及菌液制備分離得出的菌種，用接種環(huán)挑取一環(huán)，在斜面試管培養(yǎng)基上劃線，然后放置在37恒溫箱中培養(yǎng)，以待備用。將上述固體斜面培養(yǎng)基中的菌落用滅菌的接種環(huán)挑取45個(gè)接種在45ml的普通肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于37培養(yǎng)78小時(shí)，再與0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度管比較，如果濃度過(guò)大，可用滅菌生理鹽水或者肉湯培養(yǎng)液稀釋，使其濃度與濁度管相當(dāng)。2

12、.2.3平皿的涂布、貼片 (1)用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個(gè)瓊脂培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，最后沿周邊繞兩圈，保證涂均勻，因輕輕涂布防止刮破平皿。(2) 待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。用無(wú)菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。每個(gè)平板貼4張紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。在菌接種后15分鐘內(nèi)貼完紙片。(3) 將平皿反轉(zhuǎn)，孵育1824小時(shí)后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，從平板背面測(cè)量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄（見(jiàn)結(jié)果表1）。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生

13、長(zhǎng)，進(jìn)入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長(zhǎng)，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標(biāo)準(zhǔn)。(4) 每次藥敏試驗(yàn)必須用ATCC 25922大腸桿菌做質(zhì)控。只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測(cè)試菌株的結(jié)果才可以報(bào)告。ATCC 25922的結(jié)果必須同時(shí)記錄于結(jié)果表2中。2.2.4 抑菌圈的判定標(biāo)準(zhǔn)敏感（susceptible，S）：表示測(cè)試菌可被測(cè)定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制。耐藥（resistant，R）：表示測(cè)試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制，臨床治療無(wú)效。中介（intermediate，I）：表示測(cè)試菌對(duì)常規(guī)用藥體液或組織中的藥物濃度

14、的反應(yīng)率低于敏感株，使用高于正常給藥量有療效。抑菌環(huán)直徑在 15mm以上為敏感S青霉素高敏為 20mm以上 )，1015mm為中度敏感I，10mm以下為耐藥R。2.3 稀釋法2.3.1抗菌素液的制備抗菌藥物貯存液濃度不應(yīng)低于1000g/ml(如1280g/ml)或10倍于最高測(cè)定濃度，溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。恩諾沙星按其效價(jià)配成1280g·mL-1，卡那霉素按其效價(jià)配成5120g·mL-1于-20儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.3.2菌液的制備用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢大腸桿菌菌落3-5個(gè)，接種于4-5ml普通肉湯培養(yǎng)基，37培1618h,增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液用生理鹽水或肉湯校正

15、濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)前用滅菌肉湯培養(yǎng)基稀釋使其濃度大致達(dá)到105CFU/ml備用。2.3.3試驗(yàn)步驟 (1)取100支試管，分五組，每組20支試管，編1-20號(hào)，在第1管中加入4.5ml普通肉湯培養(yǎng)液，其余試管中個(gè)加入2.5ml普通肉湯培養(yǎng)液。 (2)于第1管中加入0.5ml1280g/ml的恩諾沙星。用移液槍混勻后吸取2.5ml至第2管，混勻，再取2.5ml至第3管，依次類推至第19管，棄去2.5ml,第20管為不加入恩諾沙星的肉湯液，作為生長(zhǎng)對(duì)照。此時(shí)各管藥物濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/

16、256、1/512、1/1024、1/2048 g/ml。 (3)各個(gè)試管中均加入0.1ml稀釋后菌液，使每管菌液濃度約為105CFU/ml，塞入棉塞，其它四組均按以上操作進(jìn)行。將五組試管均置于37恒溫箱中培養(yǎng)1624h后觀察結(jié)果，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC。 （4)卡那霉素MIC測(cè)定步驟同以上，各管藥物濃度依次為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512g/ml。2.3.4抗菌素的最低抑菌濃度（MIC）值判斷標(biāo)準(zhǔn) 抗菌素 濃度 相對(duì)應(yīng)MIC值（g/ml） R S 卡那霉素 5120g/m

17、l 25 16 恩諾沙星1280g/ml4 13.試驗(yàn)結(jié)果3.1 藥敏紙片擴(kuò)散法結(jié)果表1臨床分離大腸桿菌紙片擴(kuò)散法結(jié)果抗菌藥物 抑菌圈直徑（mm） 敏感度潔霉素 0.00mm 強(qiáng)力霉素 7.10mm R 紅霉素 0.00mm 四環(huán)素 6.90mm R卡那霉素 22.70mm S青霉素 0.00mm 氨芐西林 8.10mm R復(fù)方新諾明 8.70mm R羧芐青霉素 7.52mm R先鋒霉素IV 17.30mm S先鋒霉素V 20.30mm S丁胺卡那霉素 20.90mm S磺胺甲基異惡唑 7.66mm R環(huán)丙沙星 12.80mm I奧復(fù)星 11.60mm I新霉素 16.20mm S鏈霉素 9.

18、52mm R慶大霉素 20.60mm S阿莫西林 8.44mm R恩諾沙星 8.42mm R氟苯尼考 20.90mm S注：R為耐藥 I為中度敏感 S為敏感 為不敏感3.2 質(zhì)控大腸桿菌擴(kuò)散法結(jié)果表2 ATCC 25922大腸桿菌紙片擴(kuò)散法結(jié)果 抗菌藥物 抑菌圈直徑 敏感度潔霉素 0.00mm 強(qiáng)力霉素 18.48mm S紅霉素 0.00mm 四環(huán)素 24.36mm S卡那霉素 18.90mm S青霉素 0.00mm 氨芐西林 17.78mm S復(fù)方新諾明 20.58mm S羧芐青霉素 18.80mm S先鋒霉素IV 19.18mm S先鋒霉素V 21.48mm S丁胺卡那霉素 17.90mm

19、 S磺胺甲基異惡唑 18.62mm S環(huán)丙沙星 33.22mm S奧復(fù)星 28.64mm S新霉素 19.32mm S鏈霉素 22.10mm S慶大霉素 20.78mm S阿莫西林 18.04mm S恩諾沙星 16.46mm S氟苯尼考 21.20mm S注：R為耐藥 I為中度敏感 S為敏感 為不敏感3.3 MIC測(cè)定結(jié)果 (1)測(cè)定恩諾沙星最小抑菌濃度結(jié)果為五組實(shí)驗(yàn)都是第5管開(kāi)始渾濁，前面4管液體清澈，無(wú)渾濁現(xiàn)象。說(shuō)明第4管濃度是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素的最高稀釋濃度作為抗生素的最低抑菌濃度(MIC)，所以恩諾沙星的最低抑菌濃度（MIC）值為16g/ml，表現(xiàn)為不敏感耐藥。(2) 測(cè)定卡那霉素最

20、小抑菌濃度結(jié)果為有四組實(shí)驗(yàn)為第8根試管渾濁，有一組實(shí)驗(yàn)為第9根試管渾濁。說(shuō)明第7管藥物濃度是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素的最高稀釋濃度作為抗生素的最低抑菌濃度(MIC),所以卡那霉素的MIC值為8g/ml，根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷為敏感。4.討論 在細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)中，較為常用的試驗(yàn)方法也就是藥敏紙片擴(kuò)散法和稀釋法。紙片擴(kuò)散法以測(cè)量抑菌圈來(lái)判定敏感、中介度或耐藥。結(jié)果會(huì)受多種因素的影響，如接種菌量、孵育時(shí)間、抗菌藥物的含量及擴(kuò)散力、所用平皿瓊脂的厚度、藥敏紙片本身的因素等。還有傾注平皿前應(yīng)用pH計(jì)測(cè)pH值是否正確(pH應(yīng)為7.2-7.4)。pH過(guò)低會(huì)導(dǎo)致氨基糖苷類，大環(huán)內(nèi)酯類失效，而青霉素活力增強(qiáng)。另外，藥敏紙片必須放在干燥密封的條件下保存。然而紙片擴(kuò)散法也有很多優(yōu)越性，如方