曲骨發(fā)育不全綜合征示FGFR2在核糖體DNA轉(zhuǎn)錄中有細胞核活性

1、.曲骨發(fā)育不全綜合征揭示FGFR2在核糖體DNA轉(zhuǎn)錄過程中有胞核活性成纖維細胞生長因子2（FGFR2）在骨發(fā)育期間促進骨祖細胞增殖和分化，而受體如何引出這些不同的細胞反應(yīng)仍然不清楚。對FGFR2-骨骼障礙曲骨發(fā)育不全綜合征（BBDS）的分析揭示出FGFR2除了其在細胞膜表面的經(jīng)典信號活性外，還在細胞核內(nèi)調(diào)控骨的形成。之前我們顯示了一種獨特的引起B(yǎng)BDS的FGFR2突變，這種突變減少了胞膜上的受體水平，并減少了其對胞外FGF2的反應(yīng)性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)這些突變不僅減少經(jīng)典信號傳遞，還在核糖體DNA（rDNA）啟動子上增強了FGFR2的細胞核占據(jù)。核FGFR2通過降低RUNX2的表達與FGF2

2、和UBF1發(fā)生相互作用，從而激活rDNA的轉(zhuǎn)錄。BBDS中FGFR2核活性的增高使得發(fā)育階段骨中核糖體RNA水平升高，從而促進了骨祖細胞的增殖并降低了其分化。將FGFR2識別為骨中一種rDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這令人意外地顯示了FGF信號傳遞中的一種細胞核路線，這一路線使得FGF能獨立地調(diào)控骨祖細胞的增殖與分化。INTRODUCTION骨骼發(fā)育中的先天缺陷影響著很大一部分人，每3000個成活初生兒中就有1個受累（1）。這些骨骼疾病很多是源自確定骨的大小和形狀的那些基因在胚胎發(fā)育期間發(fā)生了突變。成纖維細胞生長因子受體2（FGFR2）（MIM：176943）就是這類基因中的一個。那些增強了受體活性的

3、FGFR2突變，在Apert，Crouzon，Jackson-Weiss以及Pfeiffer綜合征中引起顱骨和肢體骨內(nèi)骨骼融合（2）。與之相比，那些降低了受體活性的FGFR2突變在Larimo-auriculo-dento-digital（LADD）綜合征中引起顱骨和肢體骨內(nèi)骨發(fā)育不良（3）。小鼠中的基因研究顯示Fgfr2突變通過改變受體對骨祖細胞的調(diào)控，干擾了骨骼發(fā)育：Fgfr2功能增強，細胞的增殖與分化就增強（4，5），而Fgfr2功能減弱，增殖與分化就減弱（6，7）。當Fgfr2基因突變既促進骨骼發(fā)育階段時期骨祖細胞增殖，也促進分化時，受體引出這種相矛盾的細胞反應(yīng)的機制尚不清楚。有證據(jù)提

4、示在FGFR2上游或下游起作用的那些FGF信號傳遞組分的搭配，并不是以要么促進細胞增殖，要么促進細胞分化這樣一種單一的形式相連的。舉例來說，不同的FGF配體比如FGF2和FGF18，同時促進骨祖細胞的增殖與分化（8，9）。相似的是，在骨祖細胞中，F(xiàn)GFR2介導(dǎo)不同下游信號傳遞級聯(lián)反應(yīng)比如MAPK或PLC的活化，這同時促進了增殖和分化（1012）。FGFR2在骨祖細胞中的雙重作用可以通過其在受體活化初始階段時轉(zhuǎn)錄分布情況上的不同來解釋。盡管如此，F(xiàn)GF信號引出原始轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的機制仍不清楚，這是因為該途徑靶向的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白廣泛表達，被多種信號傳遞途徑利用（13）。但是有趣的是，F(xiàn)GF信號傳遞途徑在細

5、胞核中直接出現(xiàn)。FGF2通過不同的轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生五種同工型蛋白，它們?nèi)己屑毎司窒藁盘枺∟LS）（14）。小分子量FGF2一開始被分泌，然后在胞吞作用下轉(zhuǎn)入核中，而高分子量同工型仍然留在細胞內(nèi)，在合成調(diào)控增殖后移入細胞核內(nèi)（15）。FGF2的NLS據(jù)顯示也通過輸入蛋白（importin-）促進FGFR1進入細胞核（16）。核FGFR1-FGF2共同局限化以激活核小點，這與轉(zhuǎn)錄活化有關(guān)（17）；但是，核FGFR1-FGF2利用的直接基因靶點尚不清楚。本研究中，我們對曲骨發(fā)育不全綜合征（BBDS MIM614592）中獨特的FGFR2突變進行了分析，顯示出了核FGF信號途徑的一個直接基因靶點，

6、并且同時解決了FGFR2在骨中的雙重功能（18）。BBDS與其它FGFR2病變不同，在顱面骨和四肢骨中表現(xiàn)出骨化缺失，但其有骨祖細胞的充分支持（18）。這一表型提示本病中專有的FGFR2錯義突變分開了FGFR2對骨祖細胞增殖和分化的雙重作用。BBDS中顯性FGFR2突變，p.Met391Arg或p.Tyr381Asp，位于其跨膜區(qū)，選擇性地減少了FGFR2在膜上的水平，從而降低了受體對胞外FGFs的反應(yīng)（18）。BBDS表型的某些方面似乎是由經(jīng)典FGF2信號傳遞降低所致，但仍然有很強的證據(jù)本病不是由FGFR2某樣功能的精確喪失所致：BBDS中的骨骼缺失與LADD綜合征中的這種缺失，或是在成骨性

7、中胚層中條件性敲除Fgfr2的小鼠中的這種缺失不重疊（3，6）。這里，我們給出了有力的證據(jù)，即核FGFR2活性增強可以解釋BBDS中骨骼缺失的病理生成過程。我們揭示了在骨祖細胞中核FGFR2在rDNA啟動子處與FGF2和UBD相互作用，并限制了RUNX2造成的轉(zhuǎn)錄抑制，從而直接激活rDNA轉(zhuǎn)錄。此外，我們顯示了BBDS中的FGFR2突變增強了核FGFR2活性，從而升高了rRNA水平，促進了骨祖細胞的增殖并降低了成骨細胞分化。通過將FGFR2識別為骨中rDNA的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，我們的工作意外地顯示了FGF信號傳遞的一條細胞核路線，該路線使得FGF信號可以獨立地調(diào)控骨祖細胞的增殖與分化。RESU

8、LTSBBDS中FGFR2和FGF2在細胞核中局限化的情況有變化BBDS中的FGFR2突變增強了FGFR2與rDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控者在細胞核中的局限化FGFR2在細胞核中局限化的增強強化了ERK-MAPK通路的活化BBDS中的FGFR2突變通過增加rDNA轉(zhuǎn)錄促進了FGFR2的有絲分裂活性BBDS中的FGFR2突變使rDNA重復(fù)序列中UBF-1結(jié)合位點處的FGFR2增多BBDS中的FGFR2突變減少了成骨細胞分化FGFR2的核活性增加限制了RUNX2介導(dǎo)的rDNA轉(zhuǎn)錄抑制DISCUSSION通過研究BBDS的病理生理過程，我們揭示了FGFR2在骨祖細胞中的細胞核作用。我們顯示了引起B(yǎng)BDS的FGFR

9、2突變增強了FGFR2在細胞核中的普通功能，在細胞核中FGFR2在rDNA啟動子處與FGF2和UBF-1相互作用，通過限制RUNX2引起的轉(zhuǎn)錄抑制，促進了轉(zhuǎn)錄。其產(chǎn)物rRNA的增加在骨祖細胞中促進了增殖，減少了成骨細胞分化。之前關(guān)于功能獲得和功能喪失的研究已經(jīng)顯示了Fgfr2既能促進骨祖細胞的增殖也能促進其分化，而我們的工作揭示了這些活動是有區(qū)別的，并且在FGFR2的亞細胞局限化水平上受到控制。兩條FGFR2信號途徑，一條在細胞膜上，一條在細胞核中，可以分隔開RUNX2的作用，以維持骨祖細胞在增殖與分化之間的適當平衡（Fig.7E）。經(jīng)典FGFR2信號傳遞始于細胞膜，通過增高RUNX2在一個骨

10、特異性基因處的表達，穩(wěn)定與轉(zhuǎn)錄活性，啟動成骨細胞的分化（12，36，37）。在另一方面，我們顯示了細胞核FGFR2信號傳遞通過對抗RUNX2對rDNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用，促進了骨祖細胞的增殖。因此，我們提出BBDS是FGFR2經(jīng)典信號傳遞和細胞核信號傳遞失衡所致。BBDS中致病性FGFR2突變是第一種揭示了核FGF信號傳遞在椎骨發(fā)育過程中作用的FGFR基因改變。核FGF信號傳遞的證據(jù)出現(xiàn)已有近20年了。但是，沒有遺傳學(xué)方法徹底描述過FGFRs在細胞核中的作用。人們已經(jīng)觀察到Fgfr2在椎骨發(fā)育過程中的分化階段出現(xiàn)（39），但這一現(xiàn)象仍未大規(guī)模研究過，這是因為用于研究Fgfr2功能的小鼠模型，包括各

11、類敲除和敲入模型，含有各種遺傳改變，使人們無法將受體的細胞核功能和細胞膜功能區(qū)分開來。我們發(fā)現(xiàn)BBDS中促進rDNA轉(zhuǎn)錄的核FGFR2參與了其它先天性疾病。FGFR2突變與至少10種不同的出生缺陷有關(guān)，檢測在這些疾病中FGFR2的細胞核活性上的變化是否參與形成了骨骼上的異常，這十分重要。我們預(yù)期由FGFR2功能獲得性突變引起的骨祖細胞增殖與分化的增加，可以由細胞膜和細胞核中FGFR2信號傳遞增多來解釋。反過來，我們預(yù)測由FGFR2功能喪失造成的骨祖細胞增殖與分化減少，可以由細胞膜上和細胞核中FGFR2信號傳遞都減少來解釋。我們的發(fā)現(xiàn)也將為一類伴有核糖體功能異常的出生缺陷，即所謂的核糖體病點亮希

12、望。核糖體是細胞的一個蛋白質(zhì)生產(chǎn)中心，在mRNA翻譯中起著獨特而不可或缺的作用。但是令人意外的是，伴有核糖體功能異常的人類疾病，包括Treacher Collins綜合征和Diamond Blackfan貧血，表現(xiàn)出與BBDS類似的特定骨骼缺陷（40）。我們關(guān)于FGFR2在成骨細胞前體中調(diào)控rDNA轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)，識別出了骨骼發(fā)育過程中，核糖體生物合成的上游調(diào)控過程中的一種新特征，可以解釋這種表型上的重疊。對FGFR2在rDNA轉(zhuǎn)錄中起到的一種作用的定義，也為癌癥的病理過程與治療方案帶來了新的理解。在骨骼出生缺陷中發(fā)現(xiàn)的許多FGFR2種系突變，與癌癥中體細胞的FGFR2突變完全一樣。子宮內(nèi)膜癌，乳

13、腺癌，肺癌，胃腸道腫瘤，以及腎癌都帶有FGFR2活化突變，這些突變在顱縫早閉障礙中可見，包括BBDS中的p.Met391Arg（41）。種系和體細胞遺傳上的這種融合強烈提示它們有共同的病因。FGFR2調(diào)控rDNA轉(zhuǎn)錄的能力可能是其分子連結(jié)，因為增高的rDNA轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)了腫瘤的變化（42）。目前，非特異性靶向FGFRs抑制劑被用于臨床以治療癌癥，而由于FGFR2既起原癌作用，也起抑制劑作用，也許可以證明目前這種方法是有問題的（43）。我們關(guān)于FGFR2有兩種不同信號傳遞途徑的發(fā)現(xiàn)可能幫助開發(fā)更為安全的癌癥治療方法，這種方法特異性針對FGFR2在細胞核中的增殖前作用，同時避免與非選擇性FGFR抑制劑相關(guān)的那些潛在危險副作用。通過顯示核FGFR2信號傳遞在人類發(fā)育過程中的生物學(xué)意義，我們在BBDS中的發(fā)現(xiàn)幫助擴展了對FGF信號傳遞的思維模式。大部分信號傳遞途徑通過通路特異性轉(zhuǎn)錄因子來引導(dǎo)基因表達，從而調(diào)控發(fā)育：TGF信號途徑依賴Smads，Wnt信號傳遞利用TCF/LEF，而Hedgehog途徑利用Gli。目前還沒有發(fā)現(xiàn)哪個轉(zhuǎn)錄因子參與FGF途徑，我們的研究顯示這條途徑可以通過利用核F