丁潔振蕩純化

1、哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文）菜豆皂苷大孔樹脂振蕩純化工藝的研究學(xué) 生 姓 名 丁潔 指 導(dǎo) 教 師 李笑梅 專 業(yè) 食品質(zhì)量與安全 學(xué) 院食品工程學(xué)院 2009年06月12日Graduation Project (Thesis)HarbinUniversity of CommerceStudy on the Technology of oscillationPurification of Saponin of the Bean Student Ding JieSupervisor Li XiaomeiSpecialtyFood QuaLity and SafetySchoolHarbinUn

2、iversity of Commerce2009-06-12畢業(yè)設(shè)計（論文）任務(wù)書姓名 丁潔學(xué)院 食品工程學(xué)院班級 05一班專業(yè) 食品質(zhì)量與安全畢業(yè)設(shè)計（論文）題目：菜豆皂苷大孔樹脂振蕩純化工藝的研究立題目的和意義：菜豆是人們?nèi)粘Ｉ钪猩钍軞g迎的蔬菜，其皂苷含量又很高。皂苷是一類具有多種生理功能的活性物質(zhì)，如降血脂、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗病毒等作用。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上分，三萜類皂苷如人參皂苷、大豆皂苷、柴胡皂苷、甘草皂苷、桔梗皂苷、遠志皂苷、商陸皂苷、木通皂苷、酸棗仁皂苷等具有降低膽固醇、抗炎、抑制腫瘤、免疫、興奮或抑制中樞神經(jīng)、抑制胃液分泌以及殺死精子與軟體動物等作用。甾體皂苷如

3、沿階草皂苷、知母皂苷等則顯示有抗腫瘤、抗真菌和細(xì)菌以及降低膽固醇的作用。本文通過對菜豆皂苷超聲波提取法與振蕩純化工藝的研究，既節(jié)約時間和實驗試劑，也為進一步研究菜豆皂甙化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)分析、生物活性評價及中毒機理作用奠定基礎(chǔ)。以用來預(yù)防、緩解、控制豆角中毒上升，從食品原料上消除安全隱患，對預(yù)防菜豆中毒有重要的理論意義。技術(shù)要求與工作計劃：技術(shù)要求以菜豆為原料，采用超聲波-乙醇提取法從中提取粗皂苷化合物，通過單因素實驗選擇適宜的超聲波提取條件，利用大孔樹脂對粗皂苷化合物進行振蕩純化并通過單因素和正交試驗確定最佳的純化工藝，以泡沫試驗和溶血試驗定性，以香草醛-冰醋酸比色定量，以提取液和解吸液的顏色變

4、化程度評價大孔樹脂振蕩純化效果，在此基礎(chǔ)上計算皂苷的得率，為菜豆皂苷的進一步研究和廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。工作計劃:1.菜豆皂苷提取方法選擇利用乙醇對菜豆中總皂苷進行初步提取并用乙醚除雜，確定最佳的乙醚除脂肪的時間。2. 菜豆皂苷的定性定量運用泡沫實驗和溶血實驗對粗提液進行定性，再通過香草醛-冰醋酸比色法進行定量3.不同因素對菜豆皂苷純化效果的影響通過單因素試驗確定影響菜豆皂苷純化效果的主要因素。4.最佳純化工藝條件的確定通過正交試驗確定最佳的純化工藝。時間安排：1. 2009.03.01 至2009.03.23 查閱文獻及相關(guān)資料2. 2009.03.24 至2009.03.30 整理相關(guān)信息

5、并匯總，準(zhǔn)備實驗儀器，配制相關(guān)實驗試劑，實驗材料采集3. 2009.03.31 至2009.04.06 撰寫開題報告，進行前期實驗4. 2009.04.07 至2009.04.13 進行皂苷提取實驗并熟悉流程、記錄5. 2009.04.14 至2009.05.04 進行皂苷去毒單因素實驗，記錄6. 2009.05.05 至2009.05.11 進行皂苷去毒正交試驗，優(yōu)選出最佳工藝條件7. 2009.05.12 至2009.05.20 數(shù)據(jù)整理及結(jié)論討論8. 2009.05.21 至2009.05.31 撰寫論文92 后期修改潤色，準(zhǔn)備答辯指導(dǎo)教師要求：（簽字） 年 月 日教研室主任意見：（簽字

6、） 年 月 日院長意見；（簽字） 年 月 日畢業(yè)設(shè)計（論文）審閱評語一、指導(dǎo)教師評語：指導(dǎo)教師簽字：年 月 日畢業(yè)設(shè)計（論文）審閱評語二、評閱人評語：評閱人簽字：年 月 日畢業(yè)設(shè)計（論文）答辯評語三、答辯委員會評語：四、畢業(yè)設(shè)計（論文）成績：專業(yè)答辯組負(fù)責(zé)人簽字： 年 月 日五、答辯委員會主任單位： （簽章） 答辯委員會主任職稱：答辯委員會主任簽字：年 月 日摘要以菜豆為原料，采用超聲波-乙醇法提取菜豆皂苷，對大孔樹脂振蕩純化技術(shù)進行研究。選取大孔樹脂的吸附時間、大孔樹脂用量、乙醇洗脫濃度和乙醇洗脫用量四個影響因素進行單因素實驗，在此基礎(chǔ)上進行正交試驗，以皂苷純化得率和溶血程度為評價指標(biāo)，確定

7、最佳純化條件為：大孔樹脂用量6g，大孔樹脂吸附時間20min，乙醇洗脫濃度80%，乙醇用量60mL。在此最佳條件下皂苷純化得率為0.610mg·g-1（以新鮮菜豆計）。關(guān)鍵詞：菜豆皂苷；溶血；純化；大孔樹脂AbstractTaking the kidney bean as raw material,extract the bean saponin by ultrasonic and ethanol,the study is about technique of macroporous resin oscillationt purification of kidney bean-sap

8、onins.On the basis of having seleted ethanol consumption,concentration of ethanol,adsorption time of Macroporous resin and the amount of macroporous as four influence factors to conduct single-factor tests,the orthogonal experiments have been carried out,based on the evaluation indexes of saponins.P

9、urification rate and the hemolysis degree,which Lead to the determination of the optimum detoxicated conditions,namely ethanol consumption 60mL,concentration of 80% ethanol,adsorption time of Macroporous resin 20min,the amount of macroporous 6g.Purification rate of saponins is 0.610mg·g-1.Key W

10、ords：bean saponins;oscillation;purification;hemolytic;macroporous resin目 錄摘要IAbstractII1緒論11.1皂苷的綜述11.1.1皂苷的定義和分類11.1.2皂苷的理化性質(zhì)21.1.3皂苷的生理功能21.2皂苷的研究現(xiàn)狀4 皂苷的定性分析41.2.2 皂苷的定量分析41.2.3 皂苷提取技術(shù)的研究51.2.4 皂苷純化的研究51.2.5皂苷的應(yīng)用及前景展望61.3立題依據(jù)、研究目的和研究意義62實驗部分72.1 實驗儀器72.2 實驗材料72.2.1試劑72.2.2 樣品82.3實驗方法與內(nèi)容82.3.1 菜豆粗皂

11、苷提取工藝流程研究82.3.2 菜豆皂苷的定性定量方法92.3.3 純化操作流程122.3.4振蕩純化單因素實驗122.3.5 最佳純化條件的研究133結(jié)果與討論143.1菜豆粗皂苷提取工藝流程研究結(jié)果143.2 菜豆粗皂苷振蕩純化工藝流程研究結(jié)果14大孔樹脂振蕩純化前后比較結(jié)果14大孔樹脂振蕩純化效果的比較153.2.3 大孔樹脂振蕩純化與層析純化比較結(jié)果153.3 單因素實驗結(jié)果163.3.1大孔樹脂吸附時間對純化效果的影響163.3.2大孔樹脂用量對純化效果的影響163.3.3乙醇濃度對純化效果的影響173.3.4乙醇用量對純化效果的影響183.4 正交試驗測定的結(jié)果183.4.1振蕩純

12、化最優(yōu)條件的研究結(jié)果183.4.2實驗結(jié)果顯著性分析20結(jié) 論21參考文獻22致謝231 緒 論1.1 皂苷的綜述1.1.1 皂苷的定義和分類皂甙是一類復(fù)雜的化合物，它的水溶液振蕩時能產(chǎn)生大量的持久的蜂窩狀泡沫，與肥皂相似，故名皂甙1。皂苷(saponins)是由皂苷元(sapogenins) 和糖、糖醛酸或其他有機酸組成的，存在于植物界的一類較復(fù)雜的甙類化合物。據(jù)中藥大辭典載:莢果含三帖皂甙、鞣質(zhì)，此外，還含蠟醇、廿九烷、亞甾醇、谷甾醇等，含皂苷的植物頗多，至少有50 個不同科的400 種植物含有之1,2。皂苷大多數(shù)是螺甾烷及其生源相似的甾族化合物的低聚糖苷或三萜類化合物的低聚糖苷，按其結(jié)構(gòu)

13、可分為兩種1,2：1.1.1.1 甾式皂苷（Steroid saponins）皂苷元為甾體衍生物，具27個碳原子。不具羧基，故又稱中性皂苷。在堿性溶液中形成較穩(wěn)定的泡沫，能被堿式醋酸鉛試劑沉淀。本類皂苷主要存在于薯蕷科、百合科植物中，如各種薯蕷、七葉一枝花、土茯苓、知母、麥冬等，它們都是制藥工業(yè)中的重要原料。甾式皂苷因可作為合成甾體激素的原料而有重要意義。其甙元基本骨架為螺旋甾烷（Spirostane）。1.1.1.2 三萜式皂苷（Triterpenoid saponins）皂苷元為三萜類衍生物，具30個碳原子。大多數(shù)在甙元上帶有羧基，故又稱酸性皂苷。在酸性溶液中形成較穩(wěn)定的泡沫，能被醋酸鉛試

14、劑沉淀。本類皂苷在植物界分布較廣，尤以石竹科、桔?？?、五加科、豆科等為多。桔梗、南沙參、黨參、人參、三七、瞿麥、甘草、遠志、紫菀、地榆等許多中草藥都含有本類皂苷。其甙元有五環(huán)三萜與四環(huán)三萜二種，五環(huán)三萜又可分為下面四種類型：(1) 齊墩果烷型(-香樹脂烷型，-amyrane)；(2) 烏蘇烷型(-香樹脂烷型，-amyrane)；(3) 羽扇豆烷型(Lupane)；(4) 木栓烷型；四環(huán)三萜類皂苷可分為這幾個主要類型：(1) 達瑪烷型；(2) 羊毛脂甾烷型；(3) 甘遂烷型；(4) 環(huán)阿燉烷型；(5) 葫蘆烷型；(6) 楝烷型；1.1.2 皂苷的理化性質(zhì)1.1.2.1 物理性狀 皂苷的分子量較大

15、，不易結(jié)晶，大多為白色或乳白色的無定形粉末，成的皂苷元為結(jié)晶狀物質(zhì)，可溶于丙酮、乙醚、氯仿等有機溶劑。1.1.2.2 溶解性 大多數(shù)皂苷極性較大可溶于水，易溶于熱水、熱甲醇、熱乙醇，不溶于乙醚、苯等極性小的有機溶劑。皂苷易溶于水飽和的丁醇或戊醇中，因此常從水溶液中用丁醇或戊醇提取，借以與糖、蛋白質(zhì)等親水性成分分開。皂苷經(jīng)酶或酸水解生成的皂苷元為結(jié)晶狀物質(zhì)，可溶于丙酮、乙醚、氯仿等有機溶劑。1.1.2.3 起泡性皂苷有去污作用，因其具有表面活性劑的作用，能降低水溶液表面張力，皂苷水溶液經(jīng)強烈震蕩能產(chǎn)生持久性的泡沫，且不因加熱而消失。1.1.2.4 溶血性 皂苷與血液接觸后能破壞紅血球，產(chǎn)生溶血現(xiàn)

16、象。1.1.2.5 與酸作用 皂苷在無水條件下，與強酸(硫酸等)、中等強酸(三氯乙酸)或LewiS酸(氯化鋅)作用，會產(chǎn)生顏色變化或熒光。1.1.2.6 與其它試劑的作用8皂苷的水溶液遇醋酸鉛或堿式醋酸鉛試劑可產(chǎn)生沉淀。1.1.3 皂苷的生理功能皂苷是一類具有多種生理功能的活性物質(zhì)，如降血脂、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗病毒等作用6。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上分，三萜類皂苷如人參皂苷、大豆皂苷、柴胡皂試、甘草皂苷、桔梗皂苷、遠志皂苷、商陸皂苷、木通皂苷、酸棗仁皂苷等具有降低膽固醇、抗炎、抑制腫瘤、免疫、興奮或抑制中樞神經(jīng)、抑制胃液分泌以及殺死精子與軟體動物等作用。甾體皂苷如沿階草皂苷、知母皂苷等

17、則顯示有抗腫瘤、抗真菌和細(xì)菌以及降低膽固醇的作用。1.1.3.1 抑制腫癌細(xì)胞生長的抗腫瘤作用如葛根總皂苷對白血病的抑制作用，絞股蘭總皂苷(GP)對肉瘤有明顯抑制作用，存在金銀花(AnneLnoeraddenaa)中的三萜皂苷有顯著的消腫作用并能抑制腹水性肝癌的生長。人參皂苷、絞股藍皂苷、遼東穗木中皂苷類化合物、玄參科全草中的總皂苷、白頭翁皂苷、毛莫科植物中的皂苷都是經(jīng)過多次試驗證明了的抗癌藥物。1.1.3.2 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，防止心血管疾病和降膽固醇的作用 人參皂苷Rg1在治療動脈粥樣硬化和血栓形成方面具有顯著的療效，絞股藍皂苷對氧自由基所致腦血管痙攣有保護作用，桔?？傇碥諏Ω哐薪档妥饔?。

18、大豆皂苷1,2,6,7,8可以抑制血清中脂類的氧化，抑制過氧化酯質(zhì)的生成，并能降低血中膽固醇和甘油三脂的含量。1.1.3.3 滋補強壯，提高免疫力作用甘草皂苷能破壞血管內(nèi)的愛滋病細(xì)胞，對人的免疫缺陷病毒(HW)具有抑制增殖的效果。酸棗仁皂苷具安神補腦的作用。大豆皂苷具有減肥作用，還能抑制愛滋病毒的感染。1.1.3.4 抗菌消炎、抗病毒作用 據(jù)中國應(yīng)用藥理學(xué)記載：皂苷具有廣譜抗菌作用；它對溶血性金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、百日咳桿菌及其常見的致病性皮膚真菌均具較強的抑制作用。如：從山茶葉中分離的三萜皂苷和已用作

19、殺菌藥，從云南白藥中提取的皂苷對小鼠的實驗性炎癥有抑制作用。青葉膽皂苷具抗肝炎作用，柴胡皂苷具清熱解毒作用，皂莢皂苷具鎮(zhèn)咳消炎作用。 1.1.3.5 殺蟲作用-番茄堿、垂茄堿等生物堿類皂苷及其衍生物，對白蟻的食餌有忌避作用14。皂苷對用鰓呼吸的動物和軟體動物、魚類顯示有很強的毒性抗菌消炎、抗病毒作用。1.1.3.6 抗生育作用 柳葉牛膝中的總皂苷及十蕊商陸中分出的皂苷均有殺滅精子作用。1.1.3.7 其它方面活性 除上述活性外，皂苷還表現(xiàn)多方面活性如土貝母皂苷具有治療疣癥作用，重樓排草皂苷的子宮興奮作用，合允總皂苷的抗子宮外孕作用，桔梗皂苷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，并具鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛和解熱作用，對

20、消化性潰瘍有預(yù)防和促進治療作用等等。大豆皂苷可抑制血小板和血纖維素蛋白原的減少，也可抑制凝血酶引起的血栓纖維蛋白形成，表明其具有抗血栓作用。1.2 皂苷的研究現(xiàn)狀皂苷的各種理化性質(zhì)可作為其定性定量的依據(jù)。1.2.1 皂苷的定性分析1.2.1.1. 泡沫反應(yīng)利用皂苷的表面活性作用，是檢查皂苷存在的經(jīng)典方法。1.2.1.2. 顯色反應(yīng)(1) 濃硫酸實驗在皂苷提取液中加少量濃硫酸，若產(chǎn)生紅色紫紅色紫藍色藍綠色顏色變化，則說明皂苷提取液含有皂苷。(2) Liebermann-Burchard(醋酐-濃硫酸)反應(yīng)將少量皂苷樣品溶解于醋酸中，加入濃硫酸一醋酐(1:20)試劑，呈黃紅藍紫綠顏色變化。甾體皂苷

21、最后顯綠色，而三萜皂苷轉(zhuǎn)變成紅色或紫色，不顯綠色。此法可用來區(qū)別甾體皂苷和三萜皂苷。(3) 三氯乙酸反應(yīng)將皂苷的氯仿溶液滴在濾紙上，加三氯乙酸試劑1滴，加熱至60，顯紅色，漸變?yōu)樽仙邽殓摅w皂苷，而加熱到100，發(fā)生上述顏色變化者為三萜皂苷8。1.2.1.3. 溶血實驗利用皂苷的溶血毒性做的定性實驗。一般為試管檢驗法、涂片顯微鏡檢驗法、濾紙噴灑檢驗法三種。1.2.2 定量分析皂苷的定量是皂苷研究利用中的最大難題。皂苷本身沒有紫外吸收，無專一性顯色劑,直接測定的難度很大。以不同的測定方法得到的皂苷的含量相差很大。經(jīng)有關(guān)專家的多年研究，皂苷總量現(xiàn)可用重量法、比色法或溶血指數(shù)法測定。其中溶血指數(shù)法較

22、方便，但其結(jié)果受條件（如試管大小、溶液pH、溫度、血液種類等）影響較大，故不夠精確。比色法一般為香草醛-高氯酸顯色法。濃硫酸、高氯酸、高氯酸-香草醛、濃硫酸-香草醛等的顯色原理主要是使羧基脫水，增加雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵位移，雙分子縮合等反應(yīng)生成共軛雙鍵系統(tǒng)，又在酸作用下形成陽碳離子鹽而顯色。三萜皂苷類成分多在5%香草醛冰醋酸-高氯酸反應(yīng)中顯色，因此5%香草醛冰醋酸-高氯酸反應(yīng)被廣泛地應(yīng)用于三萜皂苷類成分的含量測定，如人參皂苷、三七皂苷、遠志皂苷、大豆皂苷等10,11。1.2.3 皂苷提取技術(shù)的研究常見的皂甙提取方法，通常有三類，即水浸法、吸附法和有機溶劑提取法8。水浸法主要是將原料破碎用水浸出，

23、然后澄清、過濾、濃縮，得皂甙粗品。其生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)設(shè)備簡單，處理樣品量大，但產(chǎn)品純度低，能耗大，渣處理困難。吸附法是用水或溶劑浸提原料，用無機物或有機樹脂吸附雜質(zhì)，濃縮得成品。有機溶劑提取法主要是醇提法。它分為甲醇和乙醇浸提兩種。出于食品安全角度考慮，常應(yīng)用乙醇作為提取劑16,20,21。1.2.4 皂甙純化的研究1.2.4.1 高效液相層析國外己普遍應(yīng)用高效液相層析分離結(jié)構(gòu)相似的皂甙。1.2.4.2 反相柱層析近年來在皂甙的分離上，除繼續(xù)使用正相硅膠柱外，使用反相硅烷化硅膠多孔性樹脂的例子日漸增多。1.2.4.3 液滴逆流層析法液滴逆流層析是基于化合物在兩種互不混溶的液相中分配差異進行分離，

24、對溶劑系統(tǒng)有一定限制，要求在短時間內(nèi)分離成兩相，并能有效地形成液滴。1.2.4.4 閃柱層析閃柱層析的特點是層析柱短，采用球型硅膠且加壓而使洗脫速度快，因此分離周期短，溶劑所需量少，且有較好的分離效果。1.2.4.5 離心板層析離心板層析是一種全程分離方法，對結(jié)構(gòu)相似皂甙的分離特別有效。1.2.4.6 大孔樹脂吸附樹脂法大孔樹脂吸附樹脂是一類不含離子交換基團的交聯(lián)聚合物，具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和很高的比表面積。與離子交換樹脂分離原理不同，它本身有的吸附性是由范德華引力或產(chǎn)生氫鍵的結(jié)果，篩性原理則是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定的，是一種吸附性與篩選性原理相結(jié)合的分離材料。常用型號有: D-101 ,D-201

25、 , MD-05271 , CAD-40 ，AT3-8等，特點是吸附容量大、再生簡單、效果可靠，尤其適用于甙類、黃酮類、皂甙類、生物堿類等成分的提取分離及大規(guī)模生產(chǎn)。大孔樹脂17對皂甙的純化不但可以去除粗提液的顏色，產(chǎn)品呈現(xiàn)粉末狀，而且操作簡便，成本較低，回收率大，適于工業(yè)化生產(chǎn)。非極性樹脂如 D-101 型，適用范圍比較廣泛。對于不帶極性的有機化合物，普遍吸附能力強，特別對皂甙類分離,純化效果尤佳，對黃酮類也很適宜，如人參皂甙、三七皂甙、薯蕷皂甙、銀杏黃酮等。D-101 型大孔樹脂吸附樹脂經(jīng)二十多年的提取物生產(chǎn)應(yīng)用實踐證實，該產(chǎn)品對植物水溶性物質(zhì)分離，純化行之有效。工藝簡單，易于操作,技術(shù)成

26、熟，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，安全可靠是分離、純化中藥提取液的理想品牌18。1.2.5 皂苷的應(yīng)用及前景展望皂甙由于其特有的物理化學(xué)性質(zhì)和生理功能，在農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和化妝品行業(yè)有著很大的應(yīng)用價值。在國外已經(jīng)有很多皂甙的制品銷售，取得了很好的經(jīng)濟效益和社會效益。然而，由于皂苷提取工藝的復(fù)雜，使得實現(xiàn)皂苷制品大批量的工業(yè)化生產(chǎn)，一直是人們研究的方向。相信在未來的研究中，隨著質(zhì)量的加強和應(yīng)用規(guī)律的進一步掌握，皂苷的研究必將進入一個更深入的領(lǐng)域，同時也將產(chǎn)生良好的社會效益和經(jīng)濟效益大。1.3 立題依據(jù)、研究目的和研究意義菜豆是人們?nèi)粘Ｉ钪猩钍軞g迎的蔬菜，其皂苷含量又很高。皂苷是一類具有多種生理功能的活

27、性物質(zhì)，如降血脂、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗病毒等作用。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上分，三萜類皂苷如人參皂苷、大豆皂苷、柴胡皂試、甘草皂苷、桔梗皂苷、遠志皂苷、商陸皂苷、木通皂苷、酸棗仁皂苷等具有降低膽固醇、抗炎、抑制腫瘤、免疫、興奮或抑制中樞神經(jīng)、抑制胃液分泌以及殺死精子與軟體動物等作用。甾體皂苷如沿階草皂苷、知母皂苷等則顯示有抗腫瘤、抗真菌和細(xì)菌以及降低膽固醇的作用。 本文通過對菜豆皂苷超聲波提取法與簡便純化工藝的研究，既節(jié)約時間和實驗試劑，也為進一步研究菜豆皂甙化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)分析、生物活性評價及中毒機理作用奠定基礎(chǔ)。以用來預(yù)防、緩解、控制豆角中毒上升，從食品原料上消除安全隱患，對預(yù)防菜豆中

28、毒有重要的理論意義。2 實驗部分2.1 實驗儀器分析天平TG238型北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司多功能食物攪拌器SJ260C順德市蘭譜電器制造有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9123A上海一恒科學(xué)儀器有限公司雙頻數(shù)控超聲波清洗器KQ-500VDE昆山市超聲儀器有限公司數(shù)控恒溫水浴鍋XXXTD上海申勝生物技術(shù)有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-205上海申勝生物技術(shù)有限公司循環(huán)水式真空泵SHZ-D（）鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司數(shù)顯恒溫水浴鍋MTD余姚市東方電工儀器廠分光光度計722型上海精密科學(xué)儀器有限公司2.2 實驗材料2.2.1 試劑乙醇 分析純 天津市化學(xué)試劑三廠乙醚 分析純 天津市鑫鉑特華工有限公司

29、鹽酸 分析純 天津市泰興化學(xué)試劑廠高氯酸 化學(xué)純 沈陽市東興試劑廠冰醋酸 化學(xué)純 天津市泰興化學(xué)試劑廠香草醛 化學(xué)純 遵義市第二化工廠人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)試劑 吉林省宏久生物科技股份有限公司氯化鈉分析純天津石英鐘廠霸州市化工分廠氫氧化鈉分析純天津市富祿化工試劑廠檸檬酸分析純天津市化學(xué)試劑一廠檸檬酸納分析純天津市化學(xué)試劑一廠磷酸二氫納分析純天津市化學(xué)試劑三廠磷酸氫二納分析純天津市化學(xué)試劑三廠大孔樹脂 D101 天津匯達化工有限公司樣品菜豆 將軍豆 哈爾濱民安小市場采購人血 O型血 血站提供2.3 實驗內(nèi)容與方法2.3.1 菜豆粗皂苷提取工藝流程研究經(jīng)典正丁醇提取法操作流程如下： 攪碎新 鮮 菜

30、豆乙醇浸提過 濾菜 豆 勻 漿濾液減壓濃縮加水溶解石油醚萃?。ㄈ危壢ッ褜蛹?水 定 容干浸膏干浸膏減 壓 濃 縮正丁醇萃?。ㄈ危┍Ａ羲畬訔壢ニ畬颖Ａ粽〈紝佣?量超聲波-乙醇提取法操作流程如下：待純化液干浸膏加水溶解減 壓 濃 縮超聲波-乙醇浸提棄去醚層新鮮菜豆菜豆勻漿絞碎乙醚除脂肪烘 箱 烘 干(1) 菜豆需要經(jīng)過預(yù)處理：清除菜豆表面泥土、草屑等雜質(zhì)，稱取30kg菜豆樣品，放入多功能食物攪拌器勻漿化。(2) 將菜豆勻漿放入恒溫烘干箱,在50下烘干后，用多功能攪拌機將其磨成2583g菜豆粉。(3) 菜豆粉每次取樣量60g。(4) 乙醚萃取后的醚層棄去。(5) 醇提時的乙醇溶液濃度為75%

31、，加入量為100 mL，超聲波提取時間為40min,功率為400w，頻率為80Hz，水浴溫度不得超過50。(6) 真空濃縮時的溶液溫度保持在60以下，因高溫濃縮會使成品顏色變深,真空濃縮并控制溫度可以減少在濃縮過程中溶液中的物質(zhì)發(fā)生不必要的變化。(7) 真空濃縮的干浸膏加水溶解，備用。2.3.2 菜豆皂苷的定性定量方法2.3.2.1 紅細(xì)胞懸液的配制(1) 阿氏液的配制（ALsevers液）葡萄糖2.05g檸檬酸鈉 (Na9C6H5O7·2H2O)0.89g檸檬酸 (C6H 6O7·H2O)0.05g氯化鈉  0.42g蒸餾水100mL調(diào)pH 至7.2，過濾滅菌或

32、高壓滅菌10min，置4冰箱保存。阿氏液中含有抗凝集的成分，可以保證血細(xì)胞在保存狀態(tài)下為溶液狀態(tài)，用阿氏液進行保存的紅細(xì)胞一般可以保質(zhì)一到兩周。(2) 0.85%氯化鈉溶液的配制使用電子天平準(zhǔn)確稱取8.5g的氯化鈉固體粉末，用蒸餾水溶解，定容至1000毫升，保存?zhèn)溆谩?3) 5%人紅細(xì)胞懸液的制備紅細(xì)胞制備：取人血5mL（防止污染），放入盛有20mL ALsevers 液瓶中，即人血和阿氏液的比例為1:4，混勻后置冰箱保存?zhèn)溆茫? 周內(nèi)使用）。紅細(xì)胞懸液制備：取用ALsevers 液保存的新鮮人血5mL，加入8mL 的0.85 的氯化鈉溶液，小心混勻，1000 r/min 離心5min，如此重

33、復(fù)操作洗滌3-5次，至上清液顏色近乎透明后,按照離心出的紅細(xì)胞體積配成5%的人血紅細(xì)胞懸液，4保存?zhèn)溆?。操作均?yīng)在無菌操作臺進行，操作過程中注意用酒精燈滅菌，操作范圍不要偏離酒精燈范圍，以保證紅細(xì)胞不被污染；還應(yīng)注意的是，操作中振搖動作不宜過大，以免造成紅細(xì)胞破損，影響實驗結(jié)果。(4) 人參皂苷標(biāo)液配置菜豆皂苷目前國內(nèi)還沒有標(biāo)準(zhǔn)品，人參皂苷Rg1具有溶血作用，所以標(biāo)準(zhǔn)樣品選擇人參皂苷Rg1。用生理鹽水將人參皂苷Rg1配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于溶血試驗。另用甲醇將人參皂苷Rg1配制成濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。2.3.2.2 定性分析(1) 泡沫實驗分別

34、吸取濃度為1 mg/mL人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL和5 mL菜豆提取液，放入試管中劇烈振搖，看其是否產(chǎn)生蜂窩狀泡沫以及記錄泡沫持續(xù)不滅的時間，并將試驗管與標(biāo)準(zhǔn)管比較，用以判定有無皂苷。(2) 溶血實驗采用試管實驗法：分別吸取濃度為1 mg/mL人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL（加入4 mL生理鹽水），菜豆粗提取液，生理鹽水，自來水各5mL，放入試管中，分別加5% 紅細(xì)胞懸浮液1 mL及生理鹽水2 mL搖勻。觀察紅細(xì)胞的溶血現(xiàn)象，同時以紅細(xì)胞懸液作為陰性對照，加自來水的試管樣作為陽性對照。采用肉眼觀察若液體澄清透明, 為高度溶血()；液體有些渾濁，有較少的紅細(xì)胞，為中度溶血()；液體混濁,仔細(xì)

35、觀察可看到液體中較多的紅細(xì)胞，為輕度溶血()；液體與對照組相似，血細(xì)胞分布較均勻，為不溶血()。注：檢液應(yīng)為中性溶液，如不是中性溶液，應(yīng)調(diào)節(jié)相應(yīng)的酸堿度，并作溶血對照樣。2.3.2.3 定量分析一般豆類皂苷的含水乙醇提取物中能干擾皂苷比色測定的主要物質(zhì)是可溶性糖、油脂和酚式化合物，如果直接取樣測定吸光度，計算皂苷的含量將很高。據(jù)資料顯示，選用高氯酸顯色體系做豆類皂苷的比色法測定的干擾要小，含油的樣品必需脫脂后才能測定。高氯酸顯色法對于皂苷是非特異性的，最好在測定前對樣品作簡單的除雜11,12。(1) 人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度0.532 mg/mL）0.05、0.1

36、0、0.15、0.20、0.25、0.30 mL分別置于具塞試管中，水浴揮去溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，在60水浴中加熱15 min，流水冷卻10 min，加冰乙酸5 mL，搖勻靜置，在15 min內(nèi)于波長540 nm處分別測吸光度A。另吸取蒸餾水0.10 mL于具塞試管中，以下各步同于上述操作，此管溶液為參比溶液。經(jīng)計算得標(biāo)準(zhǔn)曲線的一元線性方程為：y = 2.4415x 0.0495，r2=0.9864，表明相關(guān)關(guān)系存在。以人參皂苷Rg1的質(zhì)量(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2-1。圖2-1 人參皂苷標(biāo)

37、準(zhǔn)曲線(2) 皂苷含量的測定吸取定容的皂苷粗提液0.1 mL于具塞試管中，在60水浴中揮去溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL。在60水浴中加熱15 min，流水冷卻10 min，加冰乙酸5 mL，搖勻靜置，在15 min內(nèi)于波長540 nm處測吸光度 。同時吸取0.1mL的蒸餾水于具塞試管中，其他操作同上。根據(jù)方程計算測定用液皂苷量為：皂苷量/ mg =2.4415x 0.0495以香草醛-冰乙酸比色法測得的A值，計算出新鮮菜豆皂苷得率，計算公式為：mm樣×皂苷得率/ mg ·g-1f×V1V2式中： m 由回歸方程計算得到的

38、皂苷質(zhì)量，mg； m樣 菜豆干粉取樣量，g；V1 菜豆粗皂苷試液定容體積，50 mL；V2 測定用液體積，0.1 mL；f 菜豆的干粉率，即菜豆干粉與新鮮菜豆的質(zhì)量比，8.61%；2.3.2.4 大孔樹脂的預(yù)處理(1) 預(yù)處理的目的為了保證制劑最后用藥安全。樹脂中含有殘留的未聚合單體，致孔劑，分散劑和防腐劑對人體有害。(2) 預(yù)處理的方法無水乙醇浸泡24h用水洗至無醇味5%HCl通過樹脂柱，浸泡2-4h水洗至中性2%NaOH通過樹脂柱，浸泡2-4h水洗至中性，備用。2.3.2.5 評價指標(biāo)以泡沫實驗定性、溶血反應(yīng)鑒定溶血活性、皂苷得率定量、脫色程度評價純化效果。2.3.3 純化操作流程大孔樹脂

39、吸附過濾待純化液乙醇洗脫濾 液減壓濃縮干 浸 膏過濾定 量定 容加 水 溶 解(1) 加入大孔樹脂吸附后用水沖洗三次，過濾，棄去廢液。(2) 乙醇洗脫后真空濃縮，干浸膏加水溶解定容到50 mL的容量瓶中。(3) 60水浴鍋蒸干，香草醛-冰氯酸比色定量。2.3.4 振蕩純化技術(shù)單因素實驗影響純化效果的因素一般有大孔樹脂用量、大孔樹脂吸附時間、乙醇濃度、乙醇用量、洗脫次數(shù)等，根據(jù)實驗條件和相關(guān)資料選擇了大孔樹脂用量、大孔樹脂吸附時間、乙醇濃度、乙醇用量四個因素及不同水平對菜豆粗皂苷試液進行單因素研究。以此皂苷得率和溶血程度為指標(biāo)，從中篩選出較優(yōu)的水平進行下一步正交試驗。2.3.4.1 大孔樹脂吸附

40、時間與純化效果的關(guān)系在大孔樹脂用量6g，乙醇濃度75%，乙醇用量50mL條件下，進行大孔樹脂吸附時間實驗，大孔樹脂吸附時間10min、15min、20min、25min、30min。吸附過程要攪拌。2.3.4.2 大孔樹脂用量與純化效果的關(guān)系在大孔樹脂吸附時間20min，乙醇濃度75%，乙醇用量50mL條件下，進行大孔樹脂用量實驗，大孔樹脂用量分別為3g、4.5g、6g、7.5g、9g。2.3.4.3 乙醇濃度與純化效果的關(guān)系在大孔樹脂吸附時間20min，大孔樹脂用量6g，乙醇用量50mL條件下，進行乙醇濃度實驗，乙醇濃度分別為70%、75%、80%、8.5%、90%。2.3.4.4 乙醇用量

41、與純化效果的關(guān)系在大孔樹脂吸附時間20min，大孔樹脂用量6g，乙醇濃度75%條件下，進行乙醇用量實驗，乙醇用量分別為40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL。2.3.5 振蕩純化最優(yōu)條件的研究根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取對菜豆皂苷純化效果影響的主要因素水平，以溶血程度及得率為評價指標(biāo)，選用正交設(shè)計表L9(34)安排實驗，見表2-1。表2-1L9(34)正交設(shè)計表水平因素A乙醇濃度/%B大孔樹脂用量/gC大孔樹脂吸附時間/minD乙醇用量/mL1703.015602754.520703806.025803 結(jié)果與討論3.1 菜豆粗皂苷提取工藝流程研究結(jié)果經(jīng)典正丁醇提取方法和超聲

42、波-乙醇提取方法結(jié)果比較見表3-1。表3-1 兩種提取方法結(jié)果比較表組別泡沫試驗溶血程度得率/mg·g-1經(jīng)典正丁醇提取法大量泡沫，20min不褪0.417超聲波乙醇提取法大量泡沫，20min不褪0.610由表3-1可見，超聲波-乙醇提取法的溶血程度和得率都優(yōu)于經(jīng)典正丁醇提取法。此外經(jīng)典正丁醇法操作流程繁瑣，操作條件不易控制，而且正丁醇用量大，回收成本高，易造成環(huán)境污染，而超聲波-乙醇提取法在上述方面都優(yōu)于正丁醇法，故采用超聲波-乙醇提取法。3.2 菜豆粗皂苷振蕩純化工藝流程研究結(jié)果大孔樹脂振蕩純化前后比較結(jié)果振蕩純化工藝流程研究，以泡沫實驗和溶血程度為純化指標(biāo)，振蕩純化前后效果比較

43、見表3-2。表3-2 振蕩純化前后效果比較表組別泡沫實驗溶血程度提取后純化后提取后純化后粗提液大量泡沫，20min不褪大量泡沫，20min不褪人參皂苷對照大量泡沫，20min不褪大量泡沫，20min不褪自來水對照少量泡沫，5s內(nèi)褪去少量泡沫，5s內(nèi)褪去空白對照無泡沫無泡沫注：高度溶血（）；中度溶血（）；輕度溶血（）；不溶血（）從表3-2可知：通過對溶血程度的觀察得出，人參皂苷對照和自來水對照組呈陽性且溶血程度高，空白對照組（即生理鹽水）呈陰性，粗提取液溶血，結(jié)果理想。另泡沫實驗表明，泡沫持續(xù)時間超過20min。大孔樹脂振蕩純化結(jié)果大孔樹脂振蕩純化結(jié)果以提取液和解吸液的顏色變化程度為評價指標(biāo)，大

44、孔樹脂振蕩純化脫色結(jié)果見表3-4。表3-3大孔樹脂振蕩純化結(jié)果組別純化效果提取后純化后粗提液棕黃色淺黃色人參皂苷對照無色無色自來水對照無色無色空白對照淺黃色淺黃色大孔樹脂振蕩純化與層析純化比較結(jié)果振蕩純化效果和柱層析純化效果的比較以解吸液的顏色為評價指標(biāo)，純化效果的比較見表3-4。表3-4純化效果的比較組別純化效果提取后純化后振蕩純化棕黃色淺黃色*柱層析純化棕黃色無色*柱層析純化為其他同學(xué)畢業(yè)論文研究結(jié)果。結(jié)論由表3-4可知振蕩純化方法純化后的解吸液顏色深于柱層析純化方法，即振蕩純化方法的純化效果不如柱層析純化方法。雖然振蕩純化方法純化后的產(chǎn)品顏色和純度都不如柱層析純化方法，但振蕩純化方法的操

45、作步驟簡單、實驗條件容易控制，純化時間短。而柱層析純化方法操作步驟繁瑣，耗時長，對實驗儀器和實驗條件要求高。實際應(yīng)用中可以根據(jù)后續(xù)研究的目的選擇純化方法，若要進行皂苷的結(jié)構(gòu)分析和表征實驗等對純度要求較高的工作時，就要采用大孔樹脂柱層析純化方法。當(dāng)進行毒性（急性、亞急性、慢性）實驗時，便可以采用大孔樹脂振蕩純化方法。3.3 振蕩純化單因素實驗結(jié)果3.3.1 大孔樹脂吸附時間對純化效果的影響結(jié)果大孔樹脂吸附時間對純化效果的影響見圖3-1。圖3-1大孔樹脂吸附時間對純化效果的影響由圖3-1可知，隨著吸附時間的延長得率先增大后減小，得率在吸附時間為20min時達到最大。吸附時間超過20min，繼續(xù)延長

46、吸附時間，得率反而下降。當(dāng)大孔樹脂吸附的皂苷量未達到最大時，即得率最大時，延長吸附時間，可以增加皂苷的吸附量，得率上升；但當(dāng)吸附量達到最大時，由于皂苷也溶于水，繼續(xù)延長吸附時間，一些被大孔樹脂吸附的皂苷又被水解吸下來，使得率下降。3.3.2 大孔樹脂用量對純化效果的影響結(jié)果大孔樹脂用量對純化效果的影響結(jié)果見圖3-2。由圖3-2可以看出，大孔樹脂用量越多，皂苷得率增大，當(dāng)大孔樹脂用量達到6g時，皂苷得率最大，此時皂苷得率為0.606 mg ·g1，但繼續(xù)增加大孔樹脂用量，皂苷得率反而下降。隨著大孔樹脂用量的增加，皂苷的吸附量也隨之增加，即得率增高。當(dāng)用乙醇解吸時，大孔樹脂用量越多，皂苷

47、的損失量也越多，即得率下降。當(dāng)前者的作用大于后者時，得率上升；若前者的作用小于后者時，得率下降。圖3-2大孔樹脂用量對純化效果的影響3.3.3 乙醇洗脫濃度對純化效果的影響結(jié)果乙醇洗脫濃度對純化效果的影響結(jié)果見圖3-3。圖3-3 乙醇洗脫濃度對純化效果的影響由圖3-3可看出，隨著乙醇濃度的增大，皂苷得率的趨勢為：先上升，達到最高點后下降。在乙醇濃度為80%時，得率最高。高濃度的乙醇比低濃度的乙醇對皂苷得率的影響大。低濃度的乙醇洗脫皂苷的能力低，但濃度過高則會破壞皂苷。3.3.4 乙醇用量對純化效果的影響結(jié)果乙醇用量對純化效果的影響結(jié)果見圖3-4。圖3-4乙醇用量對純化效果的影響由圖3-4可看出

48、，隨著乙醇用量的增大，皂苷得率的趨勢為：先上升，達到最高點后趨于平穩(wěn)。其中在乙醇用量為50mL和60mL時，皂苷溶血效果最好，但得率不是最高的；在乙醇用量為60mL、70mL、80mL時，得率最高。在40ml與50mL之間得率增加明顯，50mL之后，保持平衡，乙醇用量對皂苷得率的影響不大。3.4 正交試驗測定的結(jié)果3.4.1 振蕩純化最優(yōu)條件的研究結(jié)果振蕩純化最優(yōu)條件的研究結(jié)果見表3-5。從表3-5中各個因素的R值可看出，各因素影響的主次地位為ACDB，即乙醇濃度對振蕩純化效果影響最大，其次是大孔樹脂吸附時間，再次是乙醇用量，大孔樹脂用量對振蕩純化結(jié)果影響最小。理論計算結(jié)果A3B3C2D3，即

49、80%、6g、20min、80mL。根據(jù)9組正交試驗的結(jié)果可直觀看出，第四組實驗A2B1C2D3的皂苷得率最高，為0.555 mg ·g-1。因此，需對理論計算優(yōu)水平A3 B3 C2 D3做驗證實驗。采用T檢驗法對理論計算優(yōu)水平和正交試驗實際得出優(yōu)水平進行顯著性分析，結(jié)果見。表3-5L9 (34)正交試驗結(jié)果表實驗號因素A乙醇濃度/%B大孔樹脂用量/gC大孔樹脂吸附時間/minD乙醇用量/mL皂苷含量/mg·g-1/%11（70）1（3.0）1（15）1（60）0.386212（4.5）2（20）2（70）0.459313（6.0）3（25）3（80）0.39042（75）

50、1230.555522310.435623120.50973（80）1320.452832130.518933210.530K11.2341.3931.4131.351K21.4991.4121.5441.420K31.5001.4291.3961.462k1=K1/30.4110.4640.4710.450k2=K2/30.5000.4710.5150.473k3=K3/30.5000.4760.4650.487R值0.0890.0120.050.037優(yōu)水平A3B3C2D3根據(jù)正交表中皂苷含量的平均值（k）繪制直觀圖，見圖3-50.300.350.400.450.500.55A1A2A3B

51、1B2B3C1C2C3D1D2D3水平因素k 值圖3-5 因素水平的直觀分析圖3-5可知：三個因素的最佳提取條件都在比較理想的水平。因此，所選擇的各因素的水平合理。3.4.2 實驗結(jié)果的顯著性分析用理論計算的優(yōu)水平為：乙醇濃度80%、大孔樹脂用量6.0g、大孔樹脂吸附時間20min、乙醇用量80ml。正交試驗最優(yōu)得率組的因素水平為：乙醇濃度75%、大孔樹脂用量4.5g、大孔樹脂吸附時間20min、乙醇用量80ml。顯著性分析計算公式為：T計 = 式中： X1 正交試驗最優(yōu)得率；X2 用理論計算優(yōu)水平下的驗證實驗得率；X 正交試驗最優(yōu)得率與用理論計算優(yōu)水平下的驗證實驗得率的平均值；n X2的平行實驗組數(shù)；S 標(biāo)準(zhǔn)偏差；正交試驗最優(yōu)得率；經(jīng)計算T計為0.705，查表得T表為4.303（p=0.05），T計T表，p0.05，所以理論計算組優(yōu)水平與實驗得出優(yōu)水平差異顯著。驗證實驗結(jié)果皂苷得率為0.610 mg·g-1。綜合各實驗結(jié)果，最后確定菜豆中皂苷的最佳