蘋(píng)果原料中酵母菌的分離鑒定

1、蘋(píng)果原料中酵母菌的分離鑒定王麗敏李軍胡小松(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京100083收稿日期:2004202214基金項(xiàng)目:國(guó)家“十五”重大科技專項(xiàng)(2001BA501A21作者簡(jiǎn)介:王麗敏,碩士研究生;胡小松,教授,主要從事植物資源開(kāi)發(fā)與利用的研究。摘要利用酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基對(duì)15個(gè)批次蘋(píng)果原料樣本中的酵母菌進(jìn)行分離,并用API 20C AUX 菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,得到的25株酵母菌分別屬于假絲酵母菌屬、釀酒酵母菌屬和克勒克酵母菌屬的6個(gè)種:克柔/平常假絲酵母菌(Candida krusei 13株,釀酒酵母菌(S accharomyces cerevisiae 5株,克勒

2、克酵母菌屬酵母菌(Kloeck 2era spp.2株,木藍(lán)假絲酵母菌(C.m agnoliae 2株,熱帶假絲酵母菌(C.t ropicalis 和乳酒假絲酵母菌(C.kef yr 各1株,鑒定準(zhǔn)確率均超過(guò)95%,其中模式菌釀酒酵母的鑒定準(zhǔn)確率為9817%,相似度1100;鑒定評(píng)價(jià)均為“好”。該系統(tǒng)能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定蘋(píng)果原料中的酵母菌。關(guān)鍵詞蘋(píng)果;酵母菌;API 菌種鑒定系統(tǒng)中圖分類號(hào)Q 93915文章編號(hào)100724333(20040420014204文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼AIsolation and identification of yea sts from appleWang Limin ,L

3、i J un ,Hu X iao song(College of Food Science and Nutritional Engineering ,China Agricultural University ,Beijing 100083,China K ey words apple ;yeasts ;API 20C AUX s ystem酵母菌是果汁生產(chǎn)中常見(jiàn)的污染菌。某些酵母菌,如釀酒酵母菌,會(huì)導(dǎo)致果汁出現(xiàn)混濁和沉淀,有的還能產(chǎn)生酒精,釋放大量二氧化碳?xì)怏w。熱帶假絲酵母菌為條件致病性真菌,會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)感染和人體免疫功能下降1。在美國(guó)和加拿大等國(guó)家,假絲酵母菌屬病菌致病率在常見(jiàn)致病菌中排列第

4、四,其中克柔/平常假絲酵母菌具有一定的抗藥性2。因此,酵母菌已成為果汁生產(chǎn)主要的控制指標(biāo)。自In 2gram 于1958年首次報(bào)道了食品中酵母菌的生化特征后3,Thomas 4,Tudor 5和Deak 6相繼以綜述的形式報(bào)道了引起濃縮果汁腐敗的酵母菌種類,T.Sancho 7報(bào)道了菠蘿濃縮汁、橙汁、桃汁和梨汁中導(dǎo)致腐敗的酵母菌種類,但對(duì)于蘋(píng)果原料中酵母菌的系統(tǒng)的分離與鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道。用于酵母菌鑒定的方法和系統(tǒng)不斷推出,如API 20C ,A TB 32C ,Auxacolor ,Vitek Y BC 和API Candid 系統(tǒng)8,克服了傳統(tǒng)菌種鑒定費(fèi)時(shí)、操作要求高的缺點(diǎn),其中,API 菌種

5、鑒定系統(tǒng)在世界范圍內(nèi)應(yīng)用較廣,其鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性已被微生物學(xué)界所公認(rèn)。在我國(guó),該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)微生中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2004,9(4:1417Journal of China Agricultural University物檢驗(yàn)。徐紅等利用API20C AUX系統(tǒng)鑒定了120株病原酵母菌,鑒定結(jié)果與常規(guī)方法相比較符合率達(dá)95%9。本實(shí)驗(yàn)旨在使用API20C AUX菌種鑒定系統(tǒng)對(duì)果汁廠生產(chǎn)所用原料果中酵母菌進(jìn)行鑒定,擬為工業(yè)化生產(chǎn)中確定蘋(píng)果汁殺菌處理工藝及有效控制微生物種類提供依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)材料蘋(píng)果原料取自煙臺(tái)安德利果汁有限公司蘋(píng)果汁生產(chǎn)線,采樣方法參照文獻(xiàn)10,稍有修改。每2d 取蘋(píng)果1

6、個(gè)批次,共15個(gè)批次,每個(gè)批次取18個(gè)蘋(píng)果置于滅菌袋中。按4分法取對(duì)角2份放入經(jīng)滅菌處理的攪拌器中,在無(wú)菌條件下榨汁,吸取25mL 果汁,于225mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0185%的滅菌生理鹽水中混合均勻,待用。2實(shí)驗(yàn)方法1菌落總數(shù)的測(cè)定11。采用傾倒平板法。2酵母菌的分離。參照文獻(xiàn)12稍有修改。分別取稀釋度為10-2,10-3,10-4的菌液1mL傾注于酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,28培養(yǎng)23d,觀察菌落形態(tài),選定可疑菌落反復(fù)進(jìn)行平板劃線和鏡檢,挑取純菌落接種于真菌選擇性培養(yǎng)基(含有2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的去氧膽酸鈉溶液和0133mL10kumL-1鏈霉素溶液的孟加拉紅中,制作水浸片,用高倍鏡觀察酵母菌細(xì)胞

7、形態(tài)、大小及出芽生殖方式。3酵母菌的鑒定及其生化特征。a.菌絲觀察。用玉米粉瓊脂平板法觀察假菌絲的有無(wú)及形態(tài)。b.碳水化合物的利用。使用API20C AUX酵母菌鑒定系統(tǒng)(Analysis Profile Index,BioMérieux, France,選用葡萄糖苷、甘油、2酮基葡萄糖酸鹽等19種不同碳水化合物為底物進(jìn)行測(cè)定。c.酵母菌的鑒定使用API Lab Plus V310Ver2 sion(bioMérieux,France菌種鑒定系統(tǒng),釀酒酵母菌(S accharom yces cerevisiaeCGMCC21604作為模式菌株。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析311蘋(píng)果原料

8、菌落總數(shù)在30d內(nèi)測(cè)定的15個(gè)批次的樣品中,蘋(píng)果原料的菌落總數(shù)為105107cfug-1。菌落總數(shù)較高且波動(dòng)幅度較大的原因主要是,從果汁廠生產(chǎn)線上采集的原料果質(zhì)量不均衡,殘次率>30%。法國(guó)、美國(guó)等果汁消費(fèi)量較大的國(guó)家,果汁加工廠擁有自己的原料基地,且規(guī)定原料果殘次率< 30%,表面菌落總數(shù)<105cfug-1。由此說(shuō)明穩(wěn)定的原料來(lái)源和嚴(yán)格的管理能夠在很大程度上減小果汁加工中微生物污染的可能性。312酵母菌的鑒定1菌體形態(tài)。從蘋(píng)果原料中分離出25株酵母菌,28培養(yǎng)48h后,酵母粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形突起,乳白色,邊緣整齊,有光澤,不透明,濕潤(rùn),直徑12mm;孟加拉

9、紅瓊脂平板上菌落呈圓形,淡粉色,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),顏色逐漸加深。AUX21顯微鏡下觀察,菌株均為橢圓或卵圓形,芽殖,成株?duì)钸B在一起或單獨(dú)存在,AUX24有兩端出芽的現(xiàn)象。2糖同化反應(yīng)結(jié)果。分離得到的6個(gè)種酵母菌的糖同化反應(yīng)結(jié)果和菌絲觀察結(jié)果見(jiàn)表1。模式菌釀酒酵母菌不能利用海藻糖,而分離到的5株AUX22中有2株糖同化反應(yīng)結(jié)果與模式菌相同,其余3株則能夠利用海藻糖。分離到2株AUX24,其中1株能夠利用22酮基2葡萄糖酸鹽(22KG;13株AUX23和2株AUX25糖同化反應(yīng)結(jié)果相同。3酵母菌鑒定結(jié)果。分離到25株菌酵母菌,鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。從蘋(píng)果中分離得到的酵母菌為3個(gè)屬:釀酒酵母菌屬、克勒克

10、酵母菌屬和假絲酵母菌屬,其中絕大部分為假絲酵母菌屬。假絲酵母菌屬包括近200個(gè)種,采用常規(guī)分類方法很難做出精確的鑒定。本實(shí)驗(yàn)中采用API20C AUX菌種鑒定系統(tǒng)鑒定的假絲酵母菌,鑒定準(zhǔn)確率均超過(guò)95%,相似度>0190,且不需要附加實(shí)驗(yàn),48h即可得出結(jié)果。由此可見(jiàn),該系統(tǒng)能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定蘋(píng)果原料中的酵母菌。51第4期王麗敏等:蘋(píng)果原料中酵母菌的分離鑒定表1從蘋(píng)果原料中分離到的酵母菌的生化特性Table1Biochemical characteristics of yeast strains isolated from apple測(cè)定指標(biāo)菌名(代號(hào)釀酒酵母菌(AUX22熱帶假絲酵母

11、菌(AUX21克柔/平常假絲酵母菌(AUX23克勒克酵母菌屬(AUX24乳酒假絲酵母菌(AUX25木藍(lán)假絲酵母菌(AUX26空白-葡萄糖苷+甘油-+-+ 22KG-+-/+-L2阿拉伯糖-D2木糖-+-阿東醇-+-木糖醇-G AL+-+-肌醇-山梨醇-+-2甲基2D2葡萄糖-+-N2乙酰2葡萄糖苷-+-纖維二糖-+-乳糖-+-麥芽糖+-己糖+-+-海藻糖-3+-松叁糖-+-綿子糖+-+-HYPHE-+-+-注:“+”為反應(yīng)陽(yáng)性,“-”為反應(yīng)陰性,“3”為模式菌反應(yīng)結(jié)果;“22KG”為2酮基葡萄糖酸鹽,HYPHE為菌絲觀察反應(yīng)。表2API20C AUX菌株鑒定系統(tǒng)對(duì)蘋(píng)果原料中酵母菌株的鑒定結(jié)果T

12、able2The identification results obtained with API20C AUX system代號(hào)鑒定結(jié)果菌株數(shù)鑒定準(zhǔn)確率/%T相似度鑒定結(jié)果評(píng)價(jià)代號(hào)鑒定結(jié)果菌株數(shù)鑒定準(zhǔn)確率/%T相似度鑒定結(jié)果評(píng)價(jià)AUX21熱帶假絲酵母菌195181100好AUX24克勒克酵母菌屬199131100很好模式菌釀酒酵母菌98171100極好AUX24克勒克酵母菌屬199101100極好AUX22釀酒酵母菌599150188好AUX25乳酒假絲酵母菌199180192極好AUX23克柔/平常假絲酵母菌1398190191好AUX26木藍(lán)假絲酵母菌297120195好61中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

13、學(xué)報(bào)2004年4結(jié)論1從蘋(píng)果原料中分離到3個(gè)屬的酵母菌25株,分別為假絲酵母菌屬、釀酒酵母菌屬和克勒克酵母菌屬,其中絕大部分為17株為假絲酵母菌屬。2API20C AUX菌種鑒定系統(tǒng)能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定蘋(píng)果原料中的酵母菌,鑒定準(zhǔn)確率>95%,且不需要附加實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)1侯風(fēng)伶,申志新,張淑紅.熱帶假絲酵母菌引起保健飲品變質(zhì)的檢測(cè)J.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2002,12(6:7092Borst A,Hall M,Verhoef J,et al.Detection of Candidaspp.in blood cultures using nucleic acid sequence2baseda

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