高效液相色譜法測定帕米膦酸二鈉中的β丙氨酸

1、高效液相色譜法測定帕米膦酸二鈉中的丙氨酸    【摘要】  目的 建立帕米膦酸二鈉中丙氨酸的檢測方法。 方法 采用高效液相色譜法，以Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 m)為色譜柱，以甲醇0.01 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0)(體積比3070)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為360 nm。結(jié)果 丙氨酸的質(zhì)量濃度在318 g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈較好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.0445x+0.2010,r=0.998 6；平均回收率為99.1%，RSD=1.9%。結(jié)論

2、 該法簡便、靈敏度高，可用于帕米膦酸二鈉中丙氨酸的質(zhì)量控制。     【關(guān)鍵詞】  帕米膦酸二鈉 丙氨酸 高效液相色譜法    帕米膦酸二鈉是一種雙膦酸類骨吸收抑制劑，臨床上廣泛應用于治療骨質(zhì)疏松癥、腫瘤并發(fā)的高鈣血癥和變形性骨炎1-3。帕米膦酸二鈉的合成主要以丙氨酸為原料，同時也是降解的主要產(chǎn)物，因此需要控制帕米膦酸二鈉中丙氨酸的量(擬定為不得超過0.3)。第30版美國藥典、2007年版英國藥典和國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準WS1(X294)2004Z中，帕米膦酸二鈉中丙氨酸的限度檢查均采用薄層色

3、譜法。由于薄層色譜法專屬性和靈敏度均不如高效液相色譜法，故本文利用2，4二硝基氟苯與丙氨酸的胺基進行耦合反應(見圖1)，結(jié)果衍生物具有紫外吸收，采用紫外檢測高效液相色譜法對帕米膦酸二鈉中丙氨酸的限度進行檢查。帕米膦酸二鈉已被列為中國藥典2010年版二部擬新增品種，作為承擔單位，本實驗方法擬收載在中國藥典2010年版二部。    圖1    2，4二硝基氟苯與丙氨酸的反應（略）    Figure 1    Reaction of 2,4dinitroflu

4、orobenzene and alanine    1    儀器與試藥       Agilent 1100 高效液相色譜儀，VWD檢測器及其配套色譜工作站；2，4二硝基氟苯(International Laboratory USA，批號：194632，質(zhì)量分數(shù)：99.9)；丙氨酸對照品(廣東信立泰藥業(yè)有限公司提供，批號：20061120,質(zhì)量分數(shù)：99.4%)；帕米膦酸二鈉(深圳信立泰藥業(yè)有限公司，批號：20080201；寧波人健藥業(yè)有限公司，批號：070107

5、、070104、070110；浙江迪耳藥業(yè)有限公司，批號：060403)；水為超純水；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。    2    方法與結(jié)果    2.1    色譜條件       色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 m）；流動相：甲醇0.01 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0)(體積比3070)；流速：1.0 mL/min

6、；柱溫：40 ；檢測波長：360 nm。    2.2    溶液的制備      供試品溶液：精密稱取本品適量，加水溶解并稀釋制成每1 mL含帕米膦酸二鈉3 mg的溶液，作為供試品溶液。      對照品溶液：精密稱取丙氨酸0.045 25 g置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取2 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。      空

7、白溶液：水。      精密量取供試品溶液、對照品溶液和空白溶液各2 mL，分別置10 mL量瓶中，加水3 mL、質(zhì)量分數(shù)5%的碳酸鈉水溶液1.0 mL和質(zhì)量分數(shù)4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，搖勻后立刻在40 下反應2 h，取出，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，作為反應后的供試品溶液、對照品溶液和空白溶液。    2.3    專屬性試驗      精密量取反應后的對照品溶液、供試品溶液(浙江迪耳藥業(yè)有限公司，批號：

8、060403)和空白溶液各10 L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖2)。由圖可知，空白輔料無干擾，反應后的衍生物主峰與相鄰峰的分離度符合要求。    1.丙氨酸    圖2    丙氨酸對照品溶液(A)、供試品溶液(B)和空白溶液(C)的色譜圖（略）    Figure 2    Chromatograms of the reference solution (A)，the test solution (B)

9、and the blank solution (C)        2.4    回收率試驗           取同一批未檢出丙氨酸的帕米膦酸二鈉（深圳信立泰藥業(yè)有限公司）適量，加水制成每1 mL含6.0 mg的溶液，作為供試品溶液；另根據(jù)擬控制的丙氨酸限度（0.3%），取丙氨酸適量逐步稀釋為每1 mL含18 g的溶液，作為對照溶液。將供試品溶液與雜質(zhì)對照溶液按比例混勻配制為含丙氨酸為

10、限度80%、100、120的溶液，測得回收率分別為96.9%、98.8%、97.5%、99.5%、99.2%、101.1%、100.8、101.7、96.2，平均回收率為99.1%，RSD為1.9%。    2.5    線性方程         取對照溶液適量，按比例稀釋為含丙氨酸3、6、9、12、15、18 g/mL的溶液，分別相當于“2.2”項下供試品溶液的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.  5%、0.6%的限度對照溶

11、液，依法測定，以峰面積為橫坐標，以質(zhì)量濃度為縱坐標，得線性回歸方程為y=0.0445x+0.2010,r=0.998 6，表明丙氨酸質(zhì)量濃度在318 g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈較好的線性關(guān)系，符合限度實驗的要求。2.6    穩(wěn)定性試驗      取一份供試品溶液(浙江迪耳藥業(yè)有限公司，批號：060403)于配制后0、1、3、5、7、8 h進樣，其峰面積的RSD為1.2，表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。    2.7    檢測限  &

12、#160;   取對照品溶液逐級稀釋各2 mL，分別置10 mL量瓶中，加水3 mL、質(zhì)量分數(shù)5%的碳酸鈉水溶液1.0 mL和質(zhì)量分數(shù)4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，搖勻后立刻在40 下反應2 h，取出，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取反應后的溶液各10 L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。當丙氨酸對照品溶液質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時，信噪比約為3，因此檢測限為0.1 g/mL(以反應前溶液的濃度計)。    2.8    樣品測定    

13、0;  分別按“2.2”項下方法配制供試品溶液，按“2.  1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果深圳信立泰藥業(yè)有限公司和寧波人健藥業(yè)有限公司的帕米膦酸二鈉均未檢出丙氨酸，浙江迪耳藥業(yè)有限公司的帕米膦酸二鈉含丙氨酸為0.1。    3    討論    3.1    2,4二硝基氟苯乙腈溶液濃度的影響       取對照品溶液2 mL 5份，分別置10 mL量瓶中，加水3 mL、質(zhì)量分

14、數(shù)5%的碳酸鈉水溶液1.0 mL，再向上述5個量瓶分別加3、4、5、7.5、15的 2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，搖勻后立刻在40 下反應120 min，取出，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取反應后的上述溶液各10 L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明：當2,4二硝基氟苯乙腈溶液質(zhì)量濃度為15%時，丙氨酸主峰附近的干擾峰影響嚴重；質(zhì)量濃度為4%5%時，丙氨酸主峰面積基本一致，丙氨酸主峰與其他峰的分離度良好。所以選用質(zhì)量濃度為4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液。    3.2    反應時間的影響 &

15、#160;    取對照品溶液2 mL 8份，分別置10 mL量瓶中，加水3 mL、質(zhì)量分數(shù)5%的碳酸鈉水溶液1.0 mL和質(zhì)量分數(shù)4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，搖勻后立刻在40 下分別反應20、35、45、60、90、120、150、180 min，取出，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取反應后的上述溶液各10 L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明：反應時間小于60 min時，反應后雜質(zhì)比較多；反應時間在120180 min時，丙氨酸主峰面積基本相同?？紤]到反應的完全性、簡便性和雜質(zhì)的干擾性，選擇120 min作為反應時間。    3.3    色譜柱的影響      將色譜柱更換為迪馬C18（250 mm×4.6 mm，5 m），結(jié)果表明空白輔料無干擾，同樣滿足系統(tǒng)適用性要求。    【參考文獻】  1 鐘永祥，張祥斌.帕米膦酸二鈉的臨床應用進展J.中華全科醫(yī)師雜