心肌細胞生長、死亡與再生

1、心肌細胞生長、死亡與再生心肌細胞生長、死亡與再生一般概念一般概念n終末分化：rat 34d human 5mn肥大： 退出細胞周期后，以肥大代替增殖； 心臟負荷增加，以肥大代償； 心肌細胞死亡，以瘢痕修復，以肥大代償。n病理刺激 心肌受損 心肌肥大 心力衰竭 n治療：去除病因，減少負荷，逆轉肥大心肌細胞是否有再生能力心肌細胞是否有再生能力19世紀末20世紀初：具有增殖能力19211925年：不具備增殖能力1.終末分化2. 缺乏干細胞3.心肌壞死，以瘢痕修復4.少量增殖：是偶然，非主流問題問題n心肌細胞的壽命人的壽命？n正常心肌細胞不存在死亡？n肥大心?。杭毎蚀蠹毎麎乃?？對心肌細胞死亡的觀察對

2、心肌細胞死亡的觀察n現(xiàn)代標記手段 ： 正常心肌細胞存在死亡，如果沒有再生，幾十年內(nèi)心臟將丟失大部分 心衰者心肌細胞死亡 ，如果沒有再生，心臟在幾個月或幾年內(nèi)會消失n死亡 再生n死亡方式：凋亡，壞死，兩者均有 正常、缺血：以凋亡為主； 梗死區(qū)：以壞死為主，周邊以凋亡為主對心肌細胞增殖的觀察對心肌細胞增殖的觀察n1960S,德國 LINZBACH 嚴重心功能障礙伴隨肥大和增生n幾年后，RUMYANTSEV 細胞進入細胞周期n1990S。PCNA,Ki67,Brdu等與增殖相關的抗原、標記物的檢出，證明心肌細胞存在有絲分裂。n1994 Quaini: 心衰末期，有絲分裂指數(shù)11/106；PCNA 4

3、9%nKAJSTWRA:CONFOCUS分裂指數(shù) 對照組：14 / 106 缺血性心臟病:152/ 106 先天性心臟病:131 / 106 對心肌細胞增殖的觀察對心肌細胞增殖的觀察n2001 BELTRAMI:13例心肌梗塞 細胞分裂相關核抗原Ki-67檢測 近梗塞區(qū)4心肌細胞檢出，為對照84倍 遠離梗塞區(qū)1心肌細胞檢出，為對照24倍 有絲分裂指數(shù) 近梗塞區(qū)0.08心肌細胞檢出，為對照70倍 遠離梗塞區(qū)0.03心肌細胞檢出，為對照24倍 對心肌細胞增殖的觀察對心肌細胞增殖的觀察n1999，F(xiàn)ELIX：成年心肌細胞出于S期新生鼠（2D）核與細胞質提取物70進入細胞周期n2002 QUAINI

4、正常心肌細胞中存在原始細胞，可分裂增殖對心肌細胞增殖的觀察對心肌細胞增殖的觀察壓力負荷壓力負荷n血流動力學改變是細胞生長的重要因素n當心功能處于代償期、無心衰以肥大為主n當心功能下降、心衰出現(xiàn)增殖正常細胞壽命正常細胞壽命n心肌細胞體積：大細胞老 小細胞年輕 4M 大鼠 400011000um3 9000um3，P161nk4a （抑制細胞進入細胞周期）表達增多，凋亡增多。 小細胞P161nk4a 表達少，DNA復制活躍。n在正常、病理情況下，死亡 再生增殖細胞來源：增殖細胞來源：nKAJSTWRA實驗室：把女性心臟移植到男性體內(nèi)，心肌細胞內(nèi)出現(xiàn)Y染色體。n骨髓來源的干細胞骨髓來源的干細胞n 肝

5、臟來源的干細胞肝臟來源的干細胞n血管來源的干細胞血管來源的干細胞n骨骼肌來源的干細胞骨骼肌來源的干細胞n心肌干細胞心肌干細胞n多潛能、未分化，在一定條件下可重建組織器官（組織工程）；損傷是分化的動力，如缺血壞死等n輸入BMC：分化為心肌、血管內(nèi)皮、血管平滑肌n干細胞動員劑：改變心梗功能，細胞增殖，新生細胞15/ 106，動脈毛細血管生成。nBMC體外定向誘導：有搏動的心肌骨髓來源的干細胞骨髓來源的干細胞( (BMC) ) 骨髓來源的干細胞骨髓來源的干細胞( (BMC) )n骨髓間質干細胞骨髓間質干細胞n骨髓單個核細胞骨髓單個核細胞n骨髓造血干細胞骨髓造血干細胞n骨髓成血管細胞骨髓成血管細胞骨髓

6、間質干細胞骨髓間質干細胞 具有多分化潛能,可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞與肌肉細胞等。n人和動物的骨髓間質干細胞在體外經(jīng)定向誘導后可分化為心肌細胞、骨細胞、軟骨細胞等。n將純化的骨髓間質干細胞注入到結扎左冠狀動脈的小鼠升主動脈內(nèi),發(fā)現(xiàn)骨髓間質干細胞可經(jīng)冠脈循環(huán)到達心臟的缺血損傷病灶內(nèi),形成新生的心肌細胞或成纖維細胞。骨髓單個核細胞骨髓單個核細胞 骨髓單個核細胞是指骨髓中細胞核形態(tài)為單個核細胞的總稱,包括造血干細胞、成纖維細胞、成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞前體細胞等。n注入豬的心肌梗死灶中,可顯著提高射血分數(shù), 增加局部血流, 增加梗死灶側枝循環(huán)n將骨髓造血干細胞植入急性心肌梗死患者病灶內(nèi),可縮小

7、梗死面積, 增加射血分數(shù)、心臟指數(shù),以及降低運動時舒張末容積等。骨髓造血干細胞骨髓造血干細胞細胞(side population cell) 是骨髓造血干細胞中存在一種亞單位,表達34-,具有多分化潛能。n移植的細胞可經(jīng)體循環(huán)系統(tǒng)遷移到心肌受損傷的病灶內(nèi),形成新生血管及心肌細胞。n從表達綠熒光增強蛋白(9)基因的裸鼠體內(nèi)提取一種特異表達Lin-c kit pos基因的骨髓造血干細胞,將其直接注入到裸鼠心臟的心肌梗死病灶周圍,可明顯改善心功能指標，并在梗死病灶周圍形成相當于病灶68%大小的新生組織,其中包含新生血管樣結構及心肌細胞。骨髓成血管細胞骨髓成血管細胞 存在于骨髓中的一種成血管細胞,表達

8、34+,是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞.n將其從靜脈注射到裸鼠心梗動物模型體內(nèi),2天后,可遷移至梗死灶內(nèi),誘導病灶內(nèi)的微血管發(fā)生增殖與再生,抑制病灶周圍的心肌細胞凋亡,抑制心肌重構,減少瘢痕的形成,并顯著改善心功能。肝臟來源的干細胞肝臟來源的干細胞n來源于肝臟的干細胞亦可在體內(nèi)被誘導成心肌細胞。將來源于鼠肝的干細胞直接注射到裸鼠的左心室壁內(nèi),可在左心室壁內(nèi)形成新生的心肌細胞,而且,與內(nèi)源的心肌細胞結合完整,形成縫隙連接和閏盤。血管來源的干細胞血管來源的干細胞n從胚胎鼠的主動脈內(nèi)提取血管內(nèi)皮細胞,將其與鼠心肌細胞在體外共同培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞分化為心肌細胞;將其注射到鼠的心臟內(nèi),也被誘導分化為心肌細

9、胞;將人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞,在上述類似的環(huán)境中培養(yǎng),也可分化為心肌細胞。骨骼肌來源的干細胞骨骼肌來源的干細胞n骨骼肌中的成肌細胞,又稱衛(wèi)星細胞, 也具有干細胞的功能,可分化形成新的骨骼肌細胞。將成肌細胞移植到受損的心臟內(nèi),可分化為肌樣細胞,但形態(tài)上與心肌細胞有差異。有研究報道,將骨骼肌成肌細胞移植到人的心臟內(nèi),可改善心臟功能。心肌干細胞心肌干細胞nOhH612周齡的 C57BL/6小鼠心臟，Sca-1+, lin, CD45, CD31+ CD38+細胞：缺乏血細胞系、骨髓造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞、成熟內(nèi)皮細胞表型可表達一系列心肌轉錄基因（GATA-4， MEF-2C，TEF-1），但不表達心

10、肌結構基因（- MHC ，-MHC，MLC-2a，MLC -2v，c&sk -actin等）在體外分化成心肌細胞，將其注入心肌梗死區(qū)后也能在體內(nèi)分化成心肌細胞，改善心臟功能。 新生心肌細胞檢測方法新生心肌細胞檢測方法n心肌細胞鑒別nDNA合成檢測n有絲分裂圖n3HTDRnBRDUnPCNAnKi-67心肌細胞鑒別心肌細胞鑒別n搏動n相關蛋白檢測：MHC,肌動蛋白。DNADNA合成檢測合成檢測n有絲分裂圖：光鏡組化（假陰性）n3HTDR：高特異性（放射性污染）nBRDU：DNA合成底物（假陽性）nPCNA：靈敏（假陽性，DNA修復期，凋亡細胞，腫瘤細胞）nKi-67：僅與核分裂有關，靈敏

11、，特異性高調(diào)控心肌細胞分裂的細胞因子調(diào)控心肌細胞分裂的細胞因子n胰島素樣生長因子n心臟營養(yǎng)因子n白介素1n成纖維生長因子n1，25（OH）2-D3n其他：細胞周期素，細胞周期蛋白依賴激酶（CDK），CDK抑制因子，P21，P27，TGF-成體干細胞在心臟疾病中的應用成體干細胞在心臟疾病中的應用 干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞。由于胚胎干細胞移植存在著免疫排斥，從而限制了其在臨床上的應用。近年來發(fā)現(xiàn)多種組織來源的成體干細胞存在著多向分化潛能，在特定條件下可定向誘導分化為多種組織的功能細胞。成體干細胞作為成年新生心肌細胞的重要來源之一，在心臟疾病中的治療中受到極大關注，其最大優(yōu)點是避免排斥反應

12、，因而有望優(yōu)先進入臨床使用。成體干細胞與缺血的心肌組織成體干細胞與缺血的心肌組織n造血干細胞：移植到裸鼠的體內(nèi),10周后制成心肌缺血再灌注損傷的模型,發(fā)現(xiàn)造血干細胞遷移到心肌受損傷的病灶內(nèi),并形成新生血管及心肌細胞。 n單個核細胞（成人外周血）體外培養(yǎng)7天獲得的造血干細胞靜脈注射給心肌梗死大鼠 7天后：在缺血的心肌組織中聚集著標記的造血干細胞已轉化為血管母細胞，并整合到局部新生的血管中/28天后超聲檢查：心功能得到改善，梗死區(qū)周圍以及缺血區(qū)域的血管密度增加，右心室瘢痕較對照組減小。成體干細胞與缺血的心肌組織成體干細胞與缺血的心肌組織n骨髓間充質干細胞：3周后缺血心肌組織的血供明顯改善。血管造影

13、表明，側支循環(huán)的數(shù)目增加5-7倍，新生的毛細血管與宿主的血管網(wǎng)相通，且有舒縮反應/注入到結扎左冠狀動脈2周后的小鼠升主動脈內(nèi)病灶內(nèi), 形成新生的心肌細胞或成纖維細胞成體干細胞與缺血的心肌組織成體干細胞與缺血的心肌組織成體干細胞與心肌梗死成體干細胞與心肌梗死n骨髓造血干細胞：直接注入到裸鼠心臟的心肌梗死病灶周圍, 心功能指標有明顯改善;九天后病檢發(fā)現(xiàn),在心肌梗死病灶周圍由新生血管樣結構及心肌細胞組成的新生組織,而對照組未見此結果。骨骼肌成肌細胞：n將經(jīng)處理的骨骼肌成肌細胞注入到一位等待接受心臟移植的志愿病人心臟內(nèi),結果發(fā)現(xiàn)心臟能在較長時間內(nèi)工作良好而無須接受心臟移植。n將大約7X106個骨骼肌成

14、肌細胞自體植入兔的心肌組織的瘢痕邊緣中，發(fā)現(xiàn)成肌細胞可以修復心肌的瘢痕組織 成體干細胞與心肌梗死成體干細胞與心肌梗死成體干細胞與心肌梗死成體干細胞與心肌梗死n骨骼肌的成肌細胞：植入心肌梗死組織中，2周后該細胞表達慢收縮細胞的標志物肌凝蛋白重鏈，而不是心肌細胞特異的標志物肌凝蛋白。它在心肌瘢痕組織內(nèi)轉變?yōu)榭蛊诘穆磻w維，以適應心肌的負荷及做功，說明移植的骨骼肌成肌細胞不是分化為心肌細胞，而是分化成為能夠負擔心肌工作的慢收縮細胞。n植入心肌組織的成肌細胞在超微結構上與正常心肌細胞不同，它們?nèi)狈及M帶，提示骨骼肌成肌細胞可能僅僅是增加了瘢痕組織的順應性，而不是收縮功能。因此，無收縮功能的成肌細

15、胞的心肌植人能否與正常的心肌細胞有相似的生理功能還值得進一步探討。成體干細胞與心肌梗死成體干細胞與心肌梗死n有人將同源骨骼肌成肌細胞植入大鼠心力衰竭模型的心肌組織中，研究結果表明，能夠有效地防止心室的擴張，左心室壓力上升和下降最大速率增加，改善心臟的功能。自體骨髓間充質干細胞的移植有助于心力衰竭患者心功能的改善，為心力衰竭的治療開辟了一個新的途徑。成體干細胞與心功能不全成體干細胞與心功能不全n綜上所述，針對成年心肌細胞生長、死亡與再生的最新研究打破了長期以來將心肌細胞作為終末分化細胞的觀念，從而為相關的基礎及臨床研究開辟了新的方向，并隨著成體干細胞應用的研究進一步深入，為臨床心血管疾病的治療提

16、供了新的前景。 前景前景已成為細胞移植的首選供體！多向分化潛能多向分化潛能取材方便取材方便不存在倫理問題不存在倫理問題高度自我高度自我更新能力更新能力自體移植無自體移植無免疫排斥反應免疫排斥反應可促進血管新生可促進血管新生優(yōu)點優(yōu)點骨髓間充質干細胞（BMSCs）骨髓間充質干細胞（BMSCs）n大量研究表明： BMSCs在一定條件下可誘導分化為心肌細胞（CM）及血管內(nèi)皮細胞，目前關于其分化的機制尚未明確，有學者提出，環(huán)境誘導分化是其中的重要因素。環(huán)境誘導分化n環(huán)境誘導分化是干細胞進入微環(huán)境后受周圍細胞的影響，對相應的各種物理或化學信號做出反應。n其機制可能與細胞接觸、基因水平調(diào)控、細胞因子調(diào)控等有

17、關。GFP-BMSCsCM光鏡下光鏡下(10X20)(10X20)熒光顯微鏡下熒光顯微鏡下(10X20)(10X20) GFP (綠綠)Torpo-3 (藍藍)重疊重疊 Troponin I (紅紅)共聚焦顯微鏡下觀察染色結果 (10X40)-actininMEF-2CGFPTORPO-3重疊重疊共聚焦顯微鏡下觀察染色結果 (10X40)熒光顯微鏡下搏動的GFP-BMSCs5 mV25 s-26 mV-38 mV20 mV5 s250 ms20 mV0 mV-51 mV正常正常CM膜電位改變膜電位改變 BMSCs獲得的心肌分化表型的膜電位改變獲得的心肌分化表型的膜電位改變AB實驗材料與儀器設備n實驗動物: 成年GFP轉基因C57BL/6小鼠（812周齡），雄性；成年C57BL/6小鼠（812周齡），雌性，購自加拿大Charles River公司。n試劑: 同第一部分實驗方法n實驗分組n對照組（n=3）：單純骨髓重建術，術后4w處死，觀察心肌組織中Troponin I的表達。n心 肌 梗 死 組 （ n = 4 ） ： 雌 性C57BL/6小鼠經(jīng)骨髓重建后4w，行冠狀動脈左前降支（LAD）結扎術建立心肌梗死模型，術后7d處死，觀察心肌組織中Troponin I的表達。B GFP骨髓移植骨髓移植A 輻射破壞骨髓輻射破壞骨髓C 心梗模型建立心梗模型建立D BMSCs歸巢及分化歸巢