防腐挑戰(zhàn)實驗

1、第一部分防腐挑戰(zhàn)實驗調(diào)研結果1實驗樣品樣本要求新鮮，沒有被微生物污染，一般每個樣本為300g2微生物挑戰(zhàn)性實驗2.1實驗菌株不同國家、組織、企業(yè)對挑戰(zhàn)實驗選擇的測試菌種有一定差異（如表1），國內(nèi)參照美國化妝品、香精和洗滌劑協(xié)會（CTFA ）推薦的菌種（因其較具代表性，如表2所示），所以更為恰當。（注意菌株來源問題：同屬一個種的細菌來源不同，菌株不同，MIC值不同）表1某些國家、組織、企業(yè)用于化妝品微生物挑戰(zhàn)試驗的測試菌株菌株美國（藥典）美國（ISP公司）英國（藥典）德國（Henkel 公司）德國（S&M公司）白假絲酵母VVVVV黑曲霉VVVVV紅色青霉V綠色木霉V繩狀青霉V大腸埃希氏菌

2、VVVV鎘綠假單胞菌VVVV金黃色葡萄球菌VVVVV糞腸球菌V產(chǎn)氣腸桿菌V表皮匍萄球菌V日勾維腸桿菌V洋蔥假單胞菌VV肺炎克雷伯氏菌惡臭假單胞菌熒光假單胞菌表2 CTFA化妝品微生物挑戰(zhàn)試驗的菌株選擇種類菌株數(shù)量革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌至少選一種發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌表皮匍萄球菌 肺炎克雷伯氏菌 陰溝腸桿菌大腸埃希氏菌至少選兩種非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌變形菌屬日勾維腸桿菌銅綠假單胞菌洋蔥假單胞菌熒光假單胞菌至少選一種酵母惡臭假單胞菌 黃桿菌屬 不動桿菌屬 白假絲酵母至少選一種霉菌近平滑假絲酵母黑曲霉至少選一種產(chǎn)芽孢菌黃綠青霉枯草芽孢桿菌供選用生產(chǎn)現(xiàn)場分離菌適當菌株種以上2.2 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)

3、基、瓊脂培養(yǎng)基2.3 試驗用菌液的配置（1）標準懸液的配制1%硫酸9.9ml與1%氯化鋇0.1ml，混合后配制成的懸液濃度為3x108cfu/ml, 此懸液再做 3 倍稀釋。（2）細菌菌懸液的配制實驗前將菌株接種到各個培養(yǎng)基斜面上， 36 攝氏度恒溫培養(yǎng) 48 小時。將已 培養(yǎng)好的活性菌種，用滅菌生理鹽水清洗到滅菌錐形瓶中，充分振蕩搖勻。 用移 液槍從錐形瓶中吸取菌液作稀釋，濁度和標準懸液的濁度（ 3X 108cfu/ml）相同 為止；此時的稀釋菌液再做3倍稀釋，即為所需的1X 108cfu/ml的菌懸液，做細菌 總數(shù)確定細菌數(shù)。（3）霉菌菌懸液的配制將已培養(yǎng)好的活性菌種， 用滅菌的生理鹽水清

4、洗到滅菌錐形瓶中， 充分振蕩 搖勻；用移液槍從錐形瓶中吸取菌液作依次的 10倍稀釋，每次的稀釋用血球計 數(shù)板計數(shù)，必須5個中格的霉菌總數(shù)在190210,落在此范圍內(nèi)的菌懸液為我 們所需的1 x 108cfu/ml的霉菌菌懸液，做霉菌總數(shù)確定霉菌數(shù)。2.4 接種（1）單菌接種：每種測試菌株單獨做一個挑戰(zhàn)試驗。這種方法的優(yōu)點是容 易了解每種微生物對防腐體系的敏感性， 在篩選產(chǎn)品的防腐體系時有較好的參考 價值，但工作量大、費時、費工，和產(chǎn)品的實際污染菌情況也有差距（因來自自 然界的微生物常常不是單一的種類） 。（2）混合菌接種：西歐、德國等的許多國家和企業(yè)多采用這種方式，除了因工作量相對較小外，這種

5、接種方法更能代表污染的狀況（ 1）一次接種：只是在試驗開始時接種一次，整個試驗周期28 天。（一次加菌的 28 天微生物挑戰(zhàn)實驗）（ 2）多次接種：在試驗開始接種一次后 （重復加菌的微生物挑戰(zhàn)實驗）a法：第21天再接種一次，試驗周期為28天。（有實驗表明，第21天接菌 和不接菌時，第 28天時的微生物含量并無顯著的差別，評定結果也相同）b 法：每隔兩周接種一下，連續(xù)三次（即第 1、3、5周接菌，每兩周接菌前 分離一次），試驗周期為 49 天；c法：每周接種一次，連續(xù)5次，試驗周期為35天。（S&M公司的資料介 紹，采用此種方法評價認可的防腐體系，可保證產(chǎn)品30 個月內(nèi)的防腐安全）稱取待

6、測樣品30g，對應加入0.3ml濃度為1X 1071 x 108cfu/ml的細菌懸 液及霉菌懸液，用干凈的無菌勺子攪拌均勻后蓋上保鮮膜，細菌在 32.5土 2.5C 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，霉菌在22.5± 2.5C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。a. 水溶性樣品10g 加入 90ml 無菌生理鹽水，稀釋后取 1ml 樣品液，加入 9ml 滅菌生理鹽 水中，做依次稀釋，分別為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 等稀釋度； 取三個合適稀釋度的樣液， 分別吸取 1ml 樣液加入已滅菌的平皿中， 做菌落計數(shù)， 并做兩個平行。b. 油溶性樣品取 10g 樣品，加入 10ml 無

7、菌吐溫 -80 和 10ml 無菌白礦油，再加 70ml 無菌 生理鹽水，用無菌玻棒充分混勻；吸取 1ml 已稀釋的樣品液， 加入 9ml 滅菌生理鹽水中， 做依次稀釋， 分別為1 0-1、 1 0-2、1 0-3、1 0-4、1 0-5、 1 0-6、1 0-7等稀釋度；取三個合適稀釋度的樣液，分 別吸取 1ml 加入已滅菌的平皿中，做菌落計數(shù)，并做兩個平行。2.5 培養(yǎng)細菌放在32.5土 25C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；霉菌在22.5± 2.5C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；混合菌在28 C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.6 菌落計數(shù)分別在 0、7、14、21、28 天分離計算樣品中活的細菌、霉菌；每次計算完 細菌

8、總數(shù)、霉菌總數(shù)后將平皿放回培養(yǎng)箱， 以待下次觀察用， 觀察中切勿打開平 皿，以免燃菌而使下次無法觀察。菌落計數(shù)的標準方法： 先選取平均菌落數(shù)在30300之間的平皿作為細菌菌落總數(shù)測定范圍， 選 取平均菌落數(shù)在550之間的平皿作為霉菌菌落總數(shù)測定范圍； 有兩個稀釋度在30300之間，求比值。若比值W 2,報告平均數(shù)；若比 值2，以其中較小的稀釋度計算細菌總數(shù)； 所有稀釋度都大于 300，以稀釋度最高的平均菌落數(shù)計算； 所有稀釋度都小于 30，以稀釋度最低的平均菌落數(shù)計算； 所有稀釋度均在 30300 之外，其中一個大于 300，而相鄰的加一稀釋度 小于 30，則以最接近 30 或 300 的平均

9、菌落數(shù)計算； 若平皿中有連成片狀或花點樣菌落蔓延生長時，不宜計算； 若片狀菌落不到平皿中的一半， 而另一半中菌落均勻， 則可將此平皿菌落 計數(shù)后X 2,以報告全皿菌落數(shù)。2.7 評價標準2.7.1 CTFA 推薦的一次加菌防腐挑戰(zhàn)性試驗及評價標準CTFA 的方法初始的霉菌和細菌的接種量分別為10000cfu/g（ml ）和1000000cfu/g（ml）（CFU 為菌落單位），要求在第 7 天時霉菌降低 90%，細菌降 低 99.9%，并且在 28天內(nèi)菌數(shù)持續(xù)下降。美國評價標準在CTFA評價方法的基礎上提出的標準，如表 3所示。表3美國所用一次加菌的微生物防腐挑戰(zhàn)實驗評價標準評價標準一次加菌的

10、28天微生物挑戰(zhàn)實驗防腐效果優(yōu)良若單菌接種的二個平行試驗中任何一種微生物數(shù)量的平均值， 在第七天時下降到 100 cfu/g （ml）以下，第28天全部為0。防腐效果勉強通過若單菌接種的二個平行試驗中任何一種微生物數(shù)量的平均值， 在第七天時下降到 1000 cfu/g （ml）以下。防腐效果無效若單菌接種的任何一種微生物，任何一個平行樣達不到上述標 準，也達不到CTFA的要求。國內(nèi)參照CTFA加菌防腐挑戰(zhàn)性評價標準。表4國內(nèi)所用微生物防腐挑戰(zhàn)實驗評價標準評價標準一次加菌的28天微生物挑戰(zhàn) 實驗重復加菌的微生物挑戰(zhàn)實驗防腐效果優(yōu)良（W）第28天化妝品中存貨的細菌 數(shù)量<10CFU/ml，說

11、明該樣品 防腐體系對細菌有較強的抑 殺效果。在二次加菌后，在每次加菌的 第14天樣品中存貨的細菌數(shù)<100CFU/ml防腐效果尚可（M ）第28天化妝品中存貨的細菌 數(shù)量<100CFU/ml，說明該樣 品防腐體系對細菌有一定的 抑殺效果。在二次加菌后，在每次加菌的 第14天樣品中存貨的細菌數(shù)<1000CFU/ml防腐效果差（P）第28天化妝品中存貨的細菌 數(shù)量>100CFU/ml，說明該樣 品防腐體系對細菌有較差的 抑殺效果。在二次加菌后，在每次加菌的 第14天樣品中存貨的細菌數(shù) >1000CFU/ml第二部分實驗室可采取的方案1實驗樣品2微生物挑戰(zhàn)性實驗2.1實

12、驗菌株金黃葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母、枯草芽孢桿菌2.2培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2.3試驗用菌液的配置實驗前，將各菌株接種于合適的培養(yǎng)基中，于37C（細菌）和28 C （霉菌）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)2天，霉菌培養(yǎng)5天后，挑選典型的菌落于滅菌的生理鹽水中，制成一定濃度的混合細菌（10A8CFU/ml ）和霉菌懸液（10A6CFU/ml ）,置于4C冰箱儲藏備用。2.4次加菌的28天微生物挑戰(zhàn)實驗量取樣品30ml分別加0.3ml混合菌懸液，使得細菌濃度為10A610A7CFU/ml，霉菌濃度為10A410A5CFU/ml，充分混勻。將樣品在 28攝氏度下保存，

13、在接菌0、7、14、21、28d取樣品分析含菌量（培養(yǎng)計數(shù)法）。2.6評價標準評價標準一次加菌的28天微生物挑戰(zhàn)實驗防腐效果優(yōu)良（W）第28天化妝品中存貨的細菌數(shù)量 <10CFU/ml，說明該 樣品防腐體系對細菌有較強的抑殺效果。防腐效果尚可（M ）第28天化妝品中存貨的細菌數(shù)量<100CFU/ml ,說明該樣品防腐體系對細菌有一定的抑殺效果。防腐效果差（P）第28天化妝品中存貨的細菌數(shù)量>100CFU/ml ,說明該樣品防腐體系對細菌有較差的抑殺效果。附：實驗中所需的儀器和藥品設備名稱需求數(shù)量要求用途1冰箱1易清潔消毒存放困種、標準懸液2電子秤1易清潔消毒樣品重量測試3濁度儀1易清潔消毒檢測細菌菌懸液之濃度4無菌操作臺1易清潔消毒微生物實驗用，要求等級10000級5生化培養(yǎng)箱3易清潔消毒細菌、霉菌培養(yǎng)各1臺；保存瓊脂為液 體狀態(tài)及緊急烘干器皿，需用1臺6顯微鏡1易清潔消毒霉菌總數(shù)觀測用7移液槍21001000 uL移取菌液用；備用8恒溫水浴鍋1易清潔消毒用于油性樣品之充分溶解，規(guī)格待定9自動火菌鍋1自動物品火菌用10牛角勺100稱取樣品用；備用11酒精燈2無菌操作臺配套用；備用12200ml燒杯10盛裝樣品用；備用13500ml燒杯10盛裝樣品用；備用14150ml三角燒瓶10