DNA粗提取與鑒定實驗

1、DNADNA粗提取與鑒定實驗粗提取與鑒定實驗 內(nèi)容內(nèi)容課題分析課題分析1實驗操作原理實驗操作原理5材料器具材料器具3實驗理論基礎(chǔ)實驗理論基礎(chǔ)4教學(xué)建議教學(xué)建議2實驗步驟實驗步驟6一、課題分析一、課題分析n1 1. .教學(xué)教學(xué)目標(biāo)目標(biāo) （1 1）分析）分析DNADNA的性質(zhì)及提取的基本思路。的性質(zhì)及提取的基本思路。 （2 2）探究不同手段提?。┨骄坎煌侄翁崛NADNA的實驗過程。的實驗過程。 （3 3）掌握）掌握DNADNA提取的過程并靈活運用。提取的過程并靈活運用。n2 2. .背景描述背景描述生物體的性狀之所以能夠遺傳給后代，是由于其體內(nèi)具有生物體的性狀之所以能夠遺傳給后代，是由于其體內(nèi)

2、具有DNADNA或或RNARNA這些遺傳物質(zhì)，這些遺傳物質(zhì)，DNADNA是遺傳物質(zhì)已經(jīng)通過實驗證實是遺傳物質(zhì)已經(jīng)通過實驗證實。那么那么DNADNA究竟什么樣究竟什么樣？本本課題通過嘗試對植物或動物組織中的課題通過嘗試對植物或動物組織中的DNADNA進行粗提取，了解進行粗提取，了解DNADNA的的理化性質(zhì)，理解理化性質(zhì)，理解DNADNA提取以及鑒定的原理，在一定層面感性認(rèn)知提取以及鑒定的原理，在一定層面感性認(rèn)知DNADNA。一、課題分析一、課題分析脫氧核苷酸脫氧核苷酸腺嘌呤腺嘌呤一、課題分析一、課題分析dAMPdAMPdTMPdTMPdCMPdCMPdGMPdGMP胸腺嘧啶胸腺嘧啶腺嘌呤腺嘌呤鳥

3、鳥嘌呤嘌呤核苷酸結(jié)構(gòu)核苷酸結(jié)構(gòu)一、課題分析一、課題分析n 脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架，脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架，排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個糖分子都與四種堿基里的排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著其中一種相連，這些堿基沿著DNADNA長鏈所排列而成的序列，可組成長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。一、課題分析一、課題分析n 讀取讀取密碼的過程稱為密碼的過程稱為轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄。n 是是以以DNADNA雙鏈中的一條單鏈為模雙鏈中的一條單鏈

4、為模板轉(zhuǎn)錄出一段稱為板轉(zhuǎn)錄出一段稱為mRNAmRNA（信使信使RNARNA）的核酸分子）的核酸分子。n 多數(shù)多數(shù)RNARNA帶有合成蛋白質(zhì)的訊息，帶有合成蛋白質(zhì)的訊息，另有一些本身就擁有特殊功能，另有一些本身就擁有特殊功能，例如例如rRNArRNA、snRNAsnRNA與與siRNAsiRNA。一、課題分析一、課題分析n 在在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)，DNADNA能與蛋白質(zhì)結(jié)能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成合形成染色體染色體，整組染色體則，整組染色體則統(tǒng)稱為統(tǒng)稱為染色體組染色體組。n 人正常人正常的人體細(xì)胞中含有的人體細(xì)胞中含有4646條條染色體染色體。n 染色體在染色體在細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂之前會先在之前會先在分裂間期

5、分裂間期完成復(fù)制，細(xì)胞分裂完成復(fù)制，細(xì)胞分裂間期又可劃分為：間期又可劃分為：G1G1期期-DNA-DNA合合成前期、成前期、S S期期-DNA-DNA合成期、合成期、G2-G2-DNADNA合成后期。合成后期。一、課題分析一、課題分析n DNADNA是高分子聚合物，是高分子聚合物，DNADNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，可被可被甲基綠甲基綠染成綠色染成綠色。n DNADNA對紫外線（對紫外線（260nm260nm）有吸收作用，利用這一特性，可以對）有吸收作用，利用這一特性，可以對DNADNA進行含量測定進行含量測定。n 當(dāng)當(dāng)核酸變性時，吸光度升高，稱為核

6、酸變性時，吸光度升高，稱為增色效應(yīng)增色效應(yīng)；當(dāng)變性核酸重新；當(dāng)變性核酸重新復(fù)性時，吸光度又會恢復(fù)到原來的水平復(fù)性時，吸光度又會恢復(fù)到原來的水平。n 較高較高溫度、有機溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起溫度、有機溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起DNADNA分子變性，即分子變性，即DNADNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開也也稱為稱為DNADNA的解螺旋。的解螺旋。洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞DNA被甲基綠染成綠色，被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅色被派洛寧染成紅色二、教學(xué)建議二、教學(xué)建議n 科學(xué)科學(xué)的探究一般過程為的探究一般過程為“發(fā)現(xiàn)問

7、題發(fā)現(xiàn)問題提出假設(shè)提出假設(shè)設(shè)計實驗設(shè)計實驗預(yù)預(yù)測結(jié)果測結(jié)果得出結(jié)論得出結(jié)論”。n 通過通過本實驗的設(shè)計的具體的實施，是學(xué)員能夠接受科學(xué)的訓(xùn)練，本實驗的設(shè)計的具體的實施，是學(xué)員能夠接受科學(xué)的訓(xùn)練，在訓(xùn)練過程中舉一反三，從理論到實踐認(rèn)知在訓(xùn)練過程中舉一反三，從理論到實踐認(rèn)知DNADNA的提取過程和操的提取過程和操作原理作原理。n 從從DNADNA的物質(zhì)組成，到的物質(zhì)組成，到DNADNA的復(fù)制時期，聯(lián)系生物學(xué)現(xiàn)象。在理的復(fù)制時期，聯(lián)系生物學(xué)現(xiàn)象。在理解解DNADNA的理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用其理化性質(zhì)對的理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用其理化性質(zhì)對DNADNA進行分離。進行分離。三、材料器具三、材料器具n 材料

8、材料：新鮮：新鮮菠菜菠菜4kg4kg。n 試劑試劑：氯化鈉：氯化鈉1000g1000g、SDS 500gSDS 500g、無水乙醇、無水乙醇4000ml4000ml、二二苯胺苯胺200ml200ml。n 器材器材：200ml200ml燒杯燒杯6060個、試管個、試管100100支、研缽支、研缽3030個、玻璃個、玻璃棒棒3030個、紗布個、紗布2 2包、不銹鋼藥勺包、不銹鋼藥勺3030個、濾紙個、濾紙5 5包。包。n 儀器儀器：天平：天平2 2臺、水浴鍋臺、水浴鍋2 2個、漏斗個、漏斗3030個。個。n DNADNA是大分子高分子聚合物，是大分子高分子聚合物，DNADNA溶液為溶液為高分子溶液

9、高分子溶液，具有很高的粘度。具有很高的粘度。DNADNA對紫外線有吸收作用，當(dāng)核酸對紫外線有吸收作用，當(dāng)核酸變性時，吸光值升高；變性時，吸光值升高；n 當(dāng)變性核酸可復(fù)性時，吸光值又會恢復(fù)到原來水平。當(dāng)變性核酸可復(fù)性時，吸光值又會恢復(fù)到原來水平。溫度、有機溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑都可以溫度、有機溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑都可以引起引起DNADNA分子分子變性變性，即使得，即使得DNADNA雙鍵間的氫鍵斷裂，雙雙鍵間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開。螺旋結(jié)構(gòu)解開。四、實驗理論基礎(chǔ)四、實驗理論基礎(chǔ)n 1 1、DNADNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受對酶、高溫和洗滌劑的耐受性性蛋白酶蛋白酶能水解蛋白質(zhì)

10、，但是對能水解蛋白質(zhì)，但是對DNADNA沒有影響沒有影響；大多數(shù)大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受蛋白質(zhì)不能忍受60608080的高溫，而的高溫，而DNADNA在在8080以上才會以上才會變性變性；洗滌劑洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì), ,但對但對DNADNA沒沒有影響。有影響。四、實驗理論基礎(chǔ)四、實驗理論基礎(chǔ)n 2 2、DNADNA的溶解度的溶解度DNADNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的濃度的NaClNaCl溶液溶液中溶解度不同，中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當(dāng)?shù)柠}利用這一特點，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使?jié)舛染湍苁笵NADNA充

11、分溶解，而使充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反。雜質(zhì)沉淀，或者相反。四、實驗理論基礎(chǔ)四、實驗理論基礎(chǔ)n 3 3、DNADNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性DNADNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將利用這一原理，可以將DNADNA與蛋白質(zhì)進一步分離。與蛋白質(zhì)進一步分離。n 1 1、實驗材料的選取、實驗材料的選取凡是凡是含有含有DNADNA的生物材料都可以考慮，但選用的生物材料都可以考慮，但選用DNADNA含量相對較高含量相對較高的生物組織，更具有操作性，根據(jù)實驗?zāi)康倪x取適當(dāng)?shù)牟牧虾偷纳锝M織，更

12、具有操作性，根據(jù)實驗?zāi)康倪x取適當(dāng)?shù)牟牧虾头椒ǚ椒āｔ~卵魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細(xì)胞、獼猴桃、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。五、實驗操作原理五、實驗操作原理n 2 2、細(xì)胞破碎、細(xì)胞破碎動物細(xì)胞動物細(xì)胞：沒有：沒有細(xì)胞壁破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸細(xì)胞壁破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水餾水 ，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。原理：蒸餾水對于細(xì)胞來說是一種原理：蒸餾水對于細(xì)胞來說是一種低滲低

13、滲液體，水分可以大量進入血細(xì)胞內(nèi)，液體，水分可以大量進入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了細(xì)胞的破裂使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了細(xì)胞的破裂( (細(xì)胞膜和細(xì)胞膜和核膜的破裂核膜的破裂) )，從而釋放出，從而釋放出DNADNA。植物細(xì)胞植物細(xì)胞：需要先用一定的洗滌劑和氯化鈉溶解細(xì)胞膜，洗滌劑是一些離：需要先用一定的洗滌劑和氯化鈉溶解細(xì)胞膜，洗滌劑是一些離子去污劑，能子去污劑，能溶解細(xì)胞膜溶解細(xì)胞膜，有利于，有利于DNADNA的釋放，氯化鈉有利于的釋放，氯化鈉有利于DNADNA的溶解。的溶解。研磨：使研磨：使DNADNA充分釋放，洗滌劑等更容易充分接觸細(xì)胞膜。用充

14、分釋放，洗滌劑等更容易充分接觸細(xì)胞膜。用液氮研磨液氮研磨可可有效的防止有效的防止DNADNA降解。降解。五、實驗操作原理五、實驗操作原理n 2 2、細(xì)胞破碎、細(xì)胞破碎n DNADNA降解的原因：降解的原因： 溫度溫度：高溫：高溫, ,易加速磷酸二酯鍵的水解易加速磷酸二酯鍵的水解。濕度濕度：參與磷酸二酯鍵的水解：參與磷酸二酯鍵的水解 、影響、影響DNADNA螺旋的形成結(jié)構(gòu)螺旋的形成結(jié)構(gòu)。pHpH值：氫離子參與與催化磷酸二酯鍵的水解值：氫離子參與與催化磷酸二酯鍵的水解 、過高或過低的、過高或過低的pHpH值都易破壞氫鍵值都易破壞氫鍵 。氧氧化反應(yīng)：氧化堿基中的含氮雜環(huán)化反應(yīng)：氧化堿基中的含氮雜環(huán),

15、 ,使其變性使其變性, ,從而進一步改變從而進一步改變一級與二級的一級與二級的DNADNA構(gòu)象構(gòu)象。DNADNA降解降解酶：水解酶：水解DNADNA。五、實驗操作原理五、實驗操作原理n 3 3、DNADNA的純化的純化細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎后主要含有蛋白、多糖和后主要含有蛋白、多糖和RNARNA等雜質(zhì)?？筛鶕?jù)等雜質(zhì)?？筛鶕?jù)DNADNA的的性性質(zhì)進行質(zhì)進行純化。首先可通過純化。首先可通過過濾過濾、離心離心等方法去除不溶解的等方法去除不溶解的雜質(zhì)，雜質(zhì)，然后然后再進一步純化再進一步純化。氯化鈉氯化鈉中的溶解度，氯化鈉濃度為中的溶解度，氯化鈉濃度為2mol/l2mol/l時時DNADNA溶解度最大溶解度最

16、大，可，可在此濃度下先溶解在此濃度下先溶解DNADNA，然后過濾去除不溶解的雜質(zhì)，然后在，然后過濾去除不溶解的雜質(zhì)，然后在DNADNA溶解度最低的氯化鈉溶液中（溶解度最低的氯化鈉溶液中（0.14mol/l0.14mol/l）使）使DNADNA析出，再過析出，再過濾去除溶解在氯化鈉溶液中的雜質(zhì)。濾去除溶解在氯化鈉溶液中的雜質(zhì)。五、實驗操作原理五、實驗操作原理n 3 3、DNADNA的純化的純化利用利用蛋白酶蛋白酶降解蛋白質(zhì)，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶降解蛋白質(zhì)，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶K K等，降解蛋白質(zhì)等，降解蛋白質(zhì)。適當(dāng)適當(dāng)溫度溫度降解蛋白質(zhì)，降解蛋白質(zhì)，65-7065-70，

17、DNADNA不會被變性，蛋白會變性。不會被變性，蛋白會變性。不溶于水的不溶于水的有機溶劑有機溶劑，酚、氯仿等，酚、氯仿等，DNADNA不溶于這類試劑，蛋白不溶于這類試劑，蛋白質(zhì)可溶解在其中，通過靜止或離心使有機試劑和水分離，去除質(zhì)可溶解在其中，通過靜止或離心使有機試劑和水分離，去除雜質(zhì)。雜質(zhì)。DNADNA結(jié)合柱結(jié)合柱，硝酸纖維素膜等，在酸性條件下可結(jié)合，硝酸纖維素膜等，在酸性條件下可結(jié)合DNADNA，中性，中性和堿性條件下結(jié)合能力差。通過和堿性條件下結(jié)合能力差。通過DNADNA的等電點調(diào)節(jié)其所帶電荷為的等電點調(diào)節(jié)其所帶電荷為正電或負(fù)電，通過孔徑去除大分子和小分子。正電或負(fù)電，通過孔徑去除大分子

18、和小分子。五、實驗操作原理五、實驗操作原理n 4 4、DNADNA的析出的析出溶溶于水的有機溶劑可使于水的有機溶劑可使DNADNA析出，水更容易和有機試劑結(jié)合，使析出，水更容易和有機試劑結(jié)合，使DNADNA析出，如一定濃度析出，如一定濃度乙醇、異丙醇乙醇、異丙醇（乙醇濃度一般在（乙醇濃度一般在48-67.5%48-67.5%，異丙醇濃度在異丙醇濃度在36%36%以上，濃度越高效果越好），低溫效果更好以上，濃度越高效果越好），低溫效果更好（雜質(zhì)較多），同時，可在一定程度上出去溶于該有機試劑的（雜質(zhì)較多），同時，可在一定程度上出去溶于該有機試劑的雜質(zhì)雜質(zhì)。n 5 5、DNADNA的的溶解溶解一般采

19、用一般采用TETE（Tris-EDTATris-EDTA，pH8.0pH8.0）緩沖液或）緩沖液或去離子水。去離子水。五、實驗操作原理五、實驗操作原理n 6 6、 DNADNA的的鑒定鑒定DNADNA與與二苯胺（二苯胺（沸水浴）會染成沸水?。境伤{(lán)色；藍(lán)色；可可被被甲基綠甲基綠染成綠色染成綠色；DNADNA對紫外線（對紫外線（260nm260nm）有吸收作用）有吸收作用；DNADNA可與溴化乙錠（可與溴化乙錠（EBEB）花青素類染料結(jié)合，可在紫外光下激發(fā)）花青素類染料結(jié)合，可在紫外光下激發(fā)熒光熒光。五、實驗操作原理五、實驗操作原理1.1.植物材料的植物材料的研磨研磨：稱稱取新鮮植物材料（菠菜）取新鮮植物材料（菠菜）100g100g，表面清洗后，表面清洗后，在研缽中充分研磨，可加入石英砂，將植物組織充分研磨（可加入在研缽中充分研磨，可加入石英砂，將植物組織充分研磨（可加入適量的提取緩沖液）。適量的提取緩沖液）。2.2.將研磨好的樣品取出置于將研磨好的樣品取出置于200ml200ml燒杯中，加入燒杯中，加入100ml 10%100ml 10%的的SDSSDS輕輕輕混勻，輕混勻，6565水浴水浴10-15min10-15mi