原理抗原抗體反應(yīng)酶聯(lián)抗體_第1頁
原理抗原抗體反應(yīng)酶聯(lián)抗體_第2頁
原理抗原抗體反應(yīng)酶聯(lián)抗體_第3頁
原理抗原抗體反應(yīng)酶聯(lián)抗體_第4頁
原理抗原抗體反應(yīng)酶聯(lián)抗體_第5頁
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文檔簡介

1、Western Blotl原理：抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)抗體，底物顯色。lWestern Blot: 檢測蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性l1轉(zhuǎn)移緩沖液： 39mmol/L 甘氨酸，48mmol/L Tris堿， 0.037% SDS（電泳級(jí)），20% 甲醇。l2二抗封閉液：5%（W/V）脫脂奶粉，150mmol/L NaCl，50mmol/L TrisCl(pH7.5)。l3封閉液：5%(W/V)脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，溶于磷酸緩沖鹽溶液。l4一抗：兔抗Hp血清；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，配套顯色液DAB。l5無磷酸鹽洗滌液：150mmol/L NaCl，50mmol/L TrisCl(pH7

2、.5)。l1 戴上手套，取下電泳好的凝膠轉(zhuǎn)移到一盤去離子水中略為漂洗一下，立即放在3張轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕的Whatman 3MM濾紙上，蓋上1張去離子水浸泡硝酸纖維素濾膜，排除氣泡后，蓋上另3張同樣處理的濾紙，排除氣泡。用刀片切除多余的濾紙和濾膜，使其大小都與凝膠大小完全吻合，用塑料夾夾緊后放入轉(zhuǎn)移電泳裝置；l2 加滿新鮮配制的轉(zhuǎn)膜緩沖液，轉(zhuǎn)好電極位置，使凝膠位于負(fù)極，硝酸纖維素濾膜位于正極。400mA定流電泳75min；l3 封閉：電泳結(jié)束后，取下硝酸纖維素濾膜用PBS淋洗后，放入封閉液中，置4搖床輕搖1hr；l4 一抗反應(yīng)：取出濾膜放入含1: 200濃度的第一抗體的封閉液， 置4搖床輕搖2hr； l5 洗滌：廢棄封閉液和抗體，用250ml PBS漂洗濾膜3次，每次10min；再用無磷酸鹽洗滌液洗滌1次10min；l6 二抗反應(yīng)：硝酸纖維素濾膜放入含1:700濃度的第二抗體封閉液中，置4搖床輕搖1hr；l7 洗滌：無磷酸鹽洗滌液洗滌3次，每次10min；l8. 顯色：顯色液臨用時(shí)配制，取250L DAB加入10ml無磷酸鹽洗滌液、10L30% H

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