受體研究技術(shù)

1、Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 受體研究技術(shù)受體研究技術(shù)Techniques in receptor research Techniques in receptor research 主要參考書主要參考書:受體研究技術(shù)受體研究技術(shù) 主編主編:賀師鵬賀師鵬, 胡雅兒胡雅兒, 夏宗勤夏宗勤 2004年年4月第一版月第一版課件地址課件地址:生物物理學(xué)系生物

2、大分子復(fù)合物實(shí)驗(yàn)室生物物理學(xué)系生物大分子復(fù)合物實(shí)驗(yàn)室: http:/ Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第六章第六章 受體放射配基結(jié)合分析的基本方法受體放射配基結(jié)合分析的基本方法韋日生韋日生北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理學(xué)系北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理學(xué)系2006年年6月月Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic M

3、edical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射性核素的幾個(gè)基本概念放射性核素的幾個(gè)基本概念放射性配基的制備放射性配基的制備 受體標(biāo)本的制備受體標(biāo)本的制備放射配基結(jié)合反應(yīng)放射配基結(jié)合反應(yīng) 受體分析的數(shù)據(jù)處理受體分析的數(shù)據(jù)處理 RBA主要內(nèi)容主要內(nèi)容Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University Schoo

4、l of Basic Medical science 放射性核素的幾個(gè)基本概念放射性核素的幾個(gè)基本概念*核衰變核衰變: 放射線核素自發(fā)地發(fā)生核內(nèi)成分或者能態(tài)的改變放射線核素自發(fā)地發(fā)生核內(nèi)成分或者能態(tài)的改變而轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N核素而轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N核素,同時(shí)釋放出一種或者幾種以上的射線同時(shí)釋放出一種或者幾種以上的射線,這個(gè)變化過(guò)程稱為放射性核衰變這個(gè)變化過(guò)程稱為放射性核衰變,簡(jiǎn)稱為核衰變簡(jiǎn)稱為核衰變.衰變衰變- -衰變衰變 + +衰變衰變電子俘獲電子俘獲(EC)衰變衰變躍遷躍遷五種衰變方式五種衰變方式衰變規(guī)律衰變規(guī)律:N= No e - t N0為為t0時(shí)放射性核素的原子核總數(shù)時(shí)放射性核素的原子核總數(shù) 為

5、衰變常數(shù)：即每一放射性原子核在單位時(shí)間內(nèi)發(fā)生衰變的幾率為衰變常數(shù)：即每一放射性原子核在單位時(shí)間內(nèi)發(fā)生衰變的幾率射線射程短射線射程短,穿透力弱穿透力弱,無(wú)無(wú)需設(shè)置屏障需設(shè)置屏障;低能低能-射線射射線射程短程短,無(wú)需設(shè)置屏障無(wú)需設(shè)置屏障,如如3H; 高能高能-射線一般用中等密射線一般用中等密度材料如玻璃做屏障度材料如玻璃做屏障; 射射線能量高線能量高,穿透力強(qiáng)穿透力強(qiáng),需要密需要密度大材料如鉛度大材料如鉛,鐵鐵,水泥等做水泥等做屏蔽屏蔽. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Bi

6、ophysics, Peking University School of Basic Medical science 半衰期半衰期 T1/2：指放射性核素的原子核數(shù)目減少一半所需的時(shí)間指放射性核素的原子核數(shù)目減少一半所需的時(shí)間根據(jù)衰變公式：當(dāng)根據(jù)衰變公式：當(dāng)t= T1/2時(shí)時(shí), N=N0/2 = No e - T1/2 T1/2=ln2/ =0.693/ 放射性核素放射性核素3H14C32P35S99mTc125I131I半衰期半衰期12.33年年5730年年14.28天天87.4天天6.02小時(shí)小時(shí)60天天8天天常見幾種醫(yī)用放射性核素的半衰期常見幾種醫(yī)用放射性核素的半衰期T1/2 = 0.

7、693/ Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science *放射性活度放射性活度()：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)核的衰變數(shù)：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)核的衰變數(shù)A=dN / dt A=A0 e - t A= N= 0.693/T1/2 N放射性活度單位及其換算：放射性活度單位及其換算：dps, Bq , Ci1Ci =1 103 mCi = 1 106 Ci = 3.7 1010 Bq =37GB

8、q =3.71010dps = 2.221012 dpm1Bq為放射性核素在為放射性核素在1秒內(nèi)發(fā)生秒內(nèi)發(fā)生1次核衰變次核衰變, 1Bq=1dps單位用單位用dps表示表示: 即每秒衰變次數(shù)即每秒衰變次數(shù)(Disintegrations Per Second ) Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射性比活度放射性比活度 : 指單位質(zhì)量放射性物質(zhì)的放射

9、性活度可用指單位質(zhì)量放射性物質(zhì)的放射性活度可用mCi/mg ，Bq/mg 表示表示也可用每毫摩爾分子所含的放射性活度表示也可用每毫摩爾分子所含的放射性活度表示mCi/mmol ，Bq/mmol每每mol放射性活度為放射性活度為: A= 0.693/T1/2 1 6.022 1023 TBq (1Bq=1dps)T1/2: 單位單位 秒秒; dps: 每秒衰變次數(shù)每秒衰變次數(shù)1 dps60 = 1dpm1Ci = 3.71010Bq = 2.221012 dpm=3.71010dpsDept.of Biophysics, Peking University School of Basic Med

10、ical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射性比活度計(jì)算舉例：放射性比活度計(jì)算舉例：核反應(yīng)生產(chǎn)的核反應(yīng)生產(chǎn)的 32(T1/2=14.28天，原子量天，原子量=32)那么：那么： 每每mol放射性活度為放射性活度為:A=1 6.022 102336002428.14693. 0= 3.38 1017 dps = 3.38 1017 Bq每克放射性活度為每克放射性活度為: A= 3.38 1017 /32=1.05 1016Bq Dept.of Biophysics, Pe

11、king University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第六章第六章 受體放射配基結(jié)合分析的基本方法受體放射配基結(jié)合分析的基本方法第一節(jié)放射性配基的制備第一節(jié)放射性配基的制備 一放射性配基的基本性質(zhì)和選擇一放射性配基的基本性質(zhì)和選擇 放射性配基的基本要求放射性配基的基本要求比活度高比活度高親和力高親和力高特異性高特異性高 穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好 Dept.of Biophysics, Peking University S

12、chool of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 比活度比活度高高*低比活度標(biāo)記配基難于達(dá)到分析靈敏度的要求。低比活度標(biāo)記配基難于達(dá)到分析靈敏度的要求。 組織細(xì)胞內(nèi)的受體濃度一般都很低，約在組織細(xì)胞內(nèi)的受體濃度一般都很低，約在104-105個(gè)個(gè)/細(xì)胞，細(xì)胞，受體的平衡解離常數(shù)多在受體的平衡解離常數(shù)多在0.110nmol/L間。故一般要求間。故一般要求放射配基比活度至少為放射配基比活度至少為3.71011Bq (10Ci)/mmol。*另外，放射

13、性配基比活度高，加入反應(yīng)管的放射性配基另外，放射性配基比活度高，加入反應(yīng)管的放射性配基的化學(xué)量就可減少，有利于降低非特異性結(jié)合。的化學(xué)量就可減少，有利于降低非特異性結(jié)合。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 親和力高親和力高 *如果配基和受體的親和力較低，必須用較多的配基如果配基和受體的親和力較低，必須用較多的配基才能達(dá)到基本飽和，不僅會(huì)提高非特異結(jié)合，

14、而且費(fèi)才能達(dá)到基本飽和，不僅會(huì)提高非特異結(jié)合，而且費(fèi)用會(huì)大大增加。用會(huì)大大增加。 *此外，親和力高則配基與受體的復(fù)合物解離就慢，此外，親和力高則配基與受體的復(fù)合物解離就慢，可進(jìn)行有效的結(jié)合和游離標(biāo)記配基的分離，有利于減可進(jìn)行有效的結(jié)合和游離標(biāo)記配基的分離，有利于減少實(shí)驗(yàn)誤差。少實(shí)驗(yàn)誤差。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 特異性高特異性高 一般都應(yīng)選擇

15、專一性高的標(biāo)記配基。如果配基與受一般都應(yīng)選擇專一性高的標(biāo)記配基。如果配基與受體結(jié)合的特異性不高，可能與其它受體有交叉結(jié)合，體結(jié)合的特異性不高，可能與其它受體有交叉結(jié)合，影響結(jié)果的可靠性，有時(shí)甚至必須用一定方法抑制交影響結(jié)果的可靠性，有時(shí)甚至必須用一定方法抑制交叉結(jié)合才能得到可信的結(jié)果。叉結(jié)合才能得到可信的結(jié)果。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 穩(wěn)定性

16、好穩(wěn)定性好所謂穩(wěn)定性好有兩重含義所謂穩(wěn)定性好有兩重含義: 首先是標(biāo)記原子引入配基分子應(yīng)當(dāng)不影響配基的性質(zhì)，首先是標(biāo)記原子引入配基分子應(yīng)當(dāng)不影響配基的性質(zhì)，也就是標(biāo)記配基能代表非標(biāo)記配基也就是標(biāo)記配基能代表非標(biāo)記配基. 其次，標(biāo)記的配基應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定性好，還應(yīng)定期考察標(biāo)記其次，標(biāo)記的配基應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定性好，還應(yīng)定期考察標(biāo)記配基貯藏過(guò)程中的輻射自分解，需要時(shí)進(jìn)行純化。比活配基貯藏過(guò)程中的輻射自分解，需要時(shí)進(jìn)行純化。比活度太高的度太高的3H標(biāo)記配基容易發(fā)生輻射自分解，應(yīng)當(dāng)根據(jù)工標(biāo)記配基容易發(fā)生輻射自分解，應(yīng)當(dāng)根據(jù)工作需要作需要,在要求的靈敏度和減少輻射自分解之間進(jìn)行合理在要求的靈敏度和減少輻射自分解之間進(jìn)行合理

17、的選擇的選擇 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 2 具體工作中標(biāo)記配基的選擇具體工作中標(biāo)記配基的選擇 根據(jù)研究對(duì)象和研究目的綜合考慮根據(jù)研究對(duì)象和研究目的綜合考慮 例如例如: (1)對(duì)同一種受體的不同亞型，有的配基有選擇性，有的對(duì)同一種受體的不同亞型，有的配基有選擇性，有的沒(méi)有選擇性，如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菧y(cè)定總的受體，應(yīng)當(dāng)選沒(méi)有沒(méi)有選擇性，如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菧y(cè)定

18、總的受體，應(yīng)當(dāng)選沒(méi)有選擇性的標(biāo)記配基。如果要分別測(cè)定不同亞型，則應(yīng)考慮選擇性的標(biāo)記配基。如果要分別測(cè)定不同亞型，則應(yīng)考慮用選擇性標(biāo)記配基。用選擇性標(biāo)記配基。 (2)標(biāo)記配基有水溶性和脂溶性之分，如果測(cè)定完整細(xì)胞標(biāo)記配基有水溶性和脂溶性之分，如果測(cè)定完整細(xì)胞表面的受體，應(yīng)當(dāng)選用水溶性標(biāo)記配基，以減少因配基進(jìn)表面的受體，應(yīng)當(dāng)選用水溶性標(biāo)記配基，以減少因配基進(jìn)入胞漿引起的誤差。入胞漿引起的誤差。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking Univer

19、sity School of Basic Medical science 二二 125I標(biāo)記放射性配基的制備標(biāo)記放射性配基的制備 受體放射分析中常用的放射性核素是受體放射分析中常用的放射性核素是3H和和125I。3H標(biāo)記配基一般都是商品，普通實(shí)驗(yàn)室不能自行制備。標(biāo)記配基一般都是商品，普通實(shí)驗(yàn)室不能自行制備。此處主要介紹此處主要介紹125I標(biāo)記多肽或蛋白的技術(shù)標(biāo)記多肽或蛋白的技術(shù). Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University

20、School of Basic Medical science 125I標(biāo)記放射性配基標(biāo)記放射性配基 *凡是多肽或蛋白中含有酪氨酸殘基的都可引入放射性碘凡是多肽或蛋白中含有酪氨酸殘基的都可引入放射性碘. *最常用的核素是最常用的核素是125I，它的半衰期為，它的半衰期為60.2天，最大的放射天，最大的放射性比活度為性比活度為2175Ci/mmol，以核外電子俘獲的方式衰變，以核外電子俘獲的方式衰變，主要發(fā)射低能量主要發(fā)射低能量X和和 線。線。 *蛋白質(zhì)的碘標(biāo)技術(shù)比較成熟，操作簡(jiǎn)便，一般生物學(xué)工蛋白質(zhì)的碘標(biāo)技術(shù)比較成熟，操作簡(jiǎn)便，一般生物學(xué)工作者均可自行操作。作者均可自行操作。 Dept.of

21、Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science *避免氧化劑引起配基結(jié)合活性和生物活性丟失的問(wèn)題避免氧化劑引起配基結(jié)合活性和生物活性丟失的問(wèn)題 碘標(biāo)記技術(shù)是利用氧化劑將負(fù)碘離子氧化為碘分子，碘分子碘標(biāo)記技術(shù)是利用氧化劑將負(fù)碘離子氧化為碘分子，碘分子自行分裂成正碘和負(fù)碘離子，正碘離子便置換酪氨酸分子中自行分裂成正碘和負(fù)碘離子，正碘離子便置換酪氨酸分子中酚酚羥基鄰位氫羥基鄰位氫而生成放

22、射性碘標(biāo)記的酪氨酸殘基。而生成放射性碘標(biāo)記的酪氨酸殘基。 最常用的氧化劑是氯胺最常用的氧化劑是氯胺-T, 乳過(guò)氧氣化物酶乳過(guò)氧氣化物酶-過(guò)氧化氫，氯甘脲過(guò)氧化氫，氯甘脲 (Iodogen) 等三種等三種 配基結(jié)合活性和生物活性丟失主要的原因是多肽分子中的甲配基結(jié)合活性和生物活性丟失主要的原因是多肽分子中的甲硫氨酸、半胱氨酸對(duì)氧化劑十分敏感，使甲硫氨酸中的硫原子硫氨酸、半胱氨酸對(duì)氧化劑十分敏感，使甲硫氨酸中的硫原子氧化成亞砜基團(tuán)，半胱氨酸則可能形成二硫鍵。氧化成亞砜基團(tuán)，半胱氨酸則可能形成二硫鍵。 (一一) 125I標(biāo)記放射性配基的幾個(gè)共同性問(wèn)題標(biāo)記放射性配基的幾個(gè)共同性問(wèn)題Dept.of Bi

23、ophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science * 碘標(biāo)記位置不同對(duì)配基結(jié)合活性和親和力的影響碘標(biāo)記位置不同對(duì)配基結(jié)合活性和親和力的影響 利用放射性碘標(biāo)記多肽或蛋白分子屬于非同位素標(biāo)記，酪氨酸利用放射性碘標(biāo)記多肽或蛋白分子屬于非同位素標(biāo)記，酪氨酸殘基酚羥基鄰位有兩個(gè)氫原子都可被置換，生成一碘標(biāo)記物，殘基酚羥基鄰位有兩個(gè)氫原子都可被置換，生成一碘標(biāo)記物，雙碘標(biāo)記物，往往一碘標(biāo)記物是有效的

24、，雙碘標(biāo)記物無(wú)效雙碘標(biāo)記物，往往一碘標(biāo)記物是有效的，雙碘標(biāo)記物無(wú)效. 一個(gè)多肽分子可能存在一個(gè)以上的酪氨酸殘基，不同位置的一個(gè)多肽分子可能存在一個(gè)以上的酪氨酸殘基，不同位置的酪氨酸殘基它的配基結(jié)合親和性是不同的，例如：胰高血糖素酪氨酸殘基它的配基結(jié)合親和性是不同的，例如：胰高血糖素（glucagon）雖都是一碘標(biāo)記物，但因碘標(biāo)位置不同，不但結(jié)）雖都是一碘標(biāo)記物，但因碘標(biāo)位置不同，不但結(jié)合活性不一樣，而且親和力也不同，合活性不一樣，而且親和力也不同，125I-Tyr13-標(biāo)記物和標(biāo)記物和125I-Tyr10-標(biāo)記物對(duì)肝細(xì)胞受體的標(biāo)記物對(duì)肝細(xì)胞受體的Kd值分別是值分別是1.3nmol/L和和0.3

25、nmol/L，兩者相差四倍。，兩者相差四倍。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science * 碘標(biāo)記后由于標(biāo)記配基衰變?cè)斐膳浠Y(jié)合活性的改變碘標(biāo)記后由于標(biāo)記配基衰變?cè)斐膳浠Y(jié)合活性的改變 對(duì)受體的測(cè)定來(lái)說(shuō)，由于要依靠標(biāo)記配基的比活度來(lái)計(jì)對(duì)受體的測(cè)定來(lái)說(shuō)，由于要依靠標(biāo)記配基的比活度來(lái)計(jì)算受體的數(shù)量和親和力，所以配基的比活度必需準(zhǔn)確標(biāo)定算受體的數(shù)量和親和力，所以配基

26、的比活度必需準(zhǔn)確標(biāo)定. 對(duì)對(duì)125I標(biāo)記的配基，需要考慮儲(chǔ)存引起的衰變以及衰變后標(biāo)記的配基，需要考慮儲(chǔ)存引起的衰變以及衰變后是否仍有和受體結(jié)合的活性。是否仍有和受體結(jié)合的活性。 有些標(biāo)記配基衰變可能導(dǎo)致化合物某些鍵的斷裂，結(jié)果有些標(biāo)記配基衰變可能導(dǎo)致化合物某些鍵的斷裂，結(jié)果衰變產(chǎn)物失去和受體結(jié)合的能力，如某些小分子標(biāo)記配基。衰變產(chǎn)物失去和受體結(jié)合的能力，如某些小分子標(biāo)記配基。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University Sc

27、hool of Basic Medical science (二二) 幾種常用的碘標(biāo)技術(shù)幾種常用的碘標(biāo)技術(shù)* 氯胺氯胺-T法法* Iodogen法法 * 乳過(guò)氧化物酶法乳過(guò)氧化物酶法 * 偶聯(lián)標(biāo)記法偶聯(lián)標(biāo)記法Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 氯胺氯胺-T 法法氯胺氯胺-T的化學(xué)名稱為的化學(xué)名稱為N-氯代甲苯磺酰胺鈉鹽氯代甲苯磺酰胺鈉鹽,迄今仍然是實(shí)驗(yàn)室

28、迄今仍然是實(shí)驗(yàn)室最常用的碘化方法之一。最常用的碘化方法之一。 氧化原理氧化原理:氯胺氯胺-T 次氯酸次氯酸 水解水解碘陰離子碘陰離子氧化氧化碘分子碘分子 負(fù)碘離子負(fù)碘離子正碘離子正碘離子裂解裂解與酪氨酸分子中酚基鄰位氫置換與酪氨酸分子中酚基鄰位氫置換 生成放射性碘標(biāo)記的酪氨酸殘基生成放射性碘標(biāo)記的酪氨酸殘基Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 氯胺氯胺-T

29、法法 (N-氯代甲苯磺酰胺鈉鹽氯代甲苯磺酰胺鈉鹽 ) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1 氧化劑的用量氧化劑的用量 如理論上氧化如理論上氧化1 mCi (0.46納克原子數(shù)納克原子數(shù)) 無(wú)載體，無(wú)保護(hù)劑的無(wú)載體，無(wú)保護(hù)劑的Na125I理論上只要用理論上只要用0.075 g氯胺氯胺-T. 實(shí)際用量都要大實(shí)際用量都要大.過(guò)量的氯胺過(guò)量的氯胺-T使反應(yīng)徹底快速完成，使反應(yīng)徹底快速完成，其次如果碘源含保護(hù)劑其次如果碘源含保護(hù)劑(Na2SO3)，還要加，還要加35倍的氯胺倍的氯胺-T氧化還原劑氧化還原劑. 所以氯胺所以氯胺-T用量為用量為10-20 g比較合適比較合適 .Dept.of Biophysics, Pek

30、ing University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 2 碘化反應(yīng)完成后，還需加碘化反應(yīng)完成后，還需加1.52倍的還原劑偏重亞硫倍的還原劑偏重亞硫酸鈉酸鈉 (Na2S2O5) 中和多余的氯氨中和多余的氯氨-T。 3 標(biāo)記蛋白的用量一般是標(biāo)記蛋白的用量一般是120 g，碘化反應(yīng)的體積控，碘化反應(yīng)的體積控制在制在0.1ml之內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間為之內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間為1min左右。左右。 4 蛋白質(zhì)中含有甲硫氨酸，半胱氨酸對(duì)氧化劑敏感

31、蛋白質(zhì)中含有甲硫氨酸，半胱氨酸對(duì)氧化劑敏感 ,要要減少氯胺減少氯胺-T的用量和縮短作用時(shí)間的用量和縮短作用時(shí)間. 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Iodogen法法 Iodogen商品名為氯甘脲，化學(xué)名商品名為氯甘脲，化學(xué)名1,3,4,6-四氯四氯3 ,6 -二苯二苯-甘脲，它與氯胺甘脲，它與氯胺-T同屬氯酰胺類，也是氧化劑，氧化作

32、用同屬氯酰胺類，也是氧化劑，氧化作用中等，不溶于水，可溶于二氯甲烷等有機(jī)溶劑中，將其溶中等，不溶于水，可溶于二氯甲烷等有機(jī)溶劑中，將其溶液涂布于試管表面，干后形成固相氧化劑，碘化反應(yīng)就在液涂布于試管表面，干后形成固相氧化劑，碘化反應(yīng)就在涂有固相氧化劑的試管內(nèi)進(jìn)行涂有固相氧化劑的試管內(nèi)進(jìn)行. Iodogen用量在用量在10-20 g左右，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短視不同蛋白左右，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短視不同蛋白質(zhì)而定，一般在質(zhì)而定，一般在15min之間，碘化反應(yīng)完畢吸出反應(yīng)混之間，碘化反應(yīng)完畢吸出反應(yīng)混合物，反應(yīng)即終止。合物，反應(yīng)即終止。 主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)蛋白質(zhì)損傷小主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)蛋白質(zhì)損傷小, 它不用還原劑，不存在因還它不

33、用還原劑，不存在因還原劑引起對(duì)蛋白質(zhì)中二硫鍵的破壞。原劑引起對(duì)蛋白質(zhì)中二硫鍵的破壞。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 乳過(guò)氧化物酶法乳過(guò)氧化物酶法 乳過(guò)氧化物酶乳過(guò)氧化物酶 (LPO) 在本法中用作催化劑，它和過(guò)氧化氫在本法中用作催化劑，它和過(guò)氧化氫作用，生成新生態(tài)氧，使負(fù)碘離子氧化成分子碘，最后形成作用，生成新生態(tài)氧，使負(fù)碘離子氧化成分子碘，最后形

34、成正碘離子，置換蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基中酚羥基鄰位的氫。正碘離子，置換蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基中酚羥基鄰位的氫。 在反應(yīng)中，乳過(guò)氧化物酶用量極少，僅為標(biāo)記配基在反應(yīng)中，乳過(guò)氧化物酶用量極少，僅為標(biāo)記配基1% 的的量，以減少酶自身碘化而引入放化雜質(zhì)。量，以減少酶自身碘化而引入放化雜質(zhì)。 過(guò)氧化氫的用量也很少，起始加入過(guò)氧化氫的用量也很少，起始加入50-100ng，以后每隔，以后每隔10-15min補(bǔ)加過(guò)氧化氫補(bǔ)加過(guò)氧化氫 (30ng-50ng) 一次，共一次，共4次左右，最后用次左右，最后用硫基乙醇終止反應(yīng)。硫基乙醇終止反應(yīng)。 本法也比較溫和，但操作比較麻煩，現(xiàn)在多數(shù)已被本法也比較溫和，但操作比較麻煩，現(xiàn)

35、在多數(shù)已被Iodogen法取代。法取代。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 偶聯(lián)標(biāo)記法偶聯(lián)標(biāo)記法 又稱簡(jiǎn)接標(biāo)記法，或又稱簡(jiǎn)接標(biāo)記法，或Bolton-Hunter法。如果待標(biāo)記的配基不法。如果待標(biāo)記的配基不含酪氨酸殘基，上述三種方法將有困難，可以考慮采用偶聯(lián)標(biāo)含酪氨酸殘基，上述三種方法將有困難，可以考慮采用偶聯(lián)標(biāo)記法。記法。 以氯胺以氯胺-T法制備碘標(biāo)記

36、的法制備碘標(biāo)記的3,5-(4-羥基苯羥基苯)-丙酸丙酸N-羥基琥珀酰亞羥基琥珀酰亞胺酯胺酯 (HPNS)，然后與蛋白質(zhì)中，然后與蛋白質(zhì)中的游離氨基縮合，生成含放射的游離氨基縮合，生成含放射性碘的蛋白質(zhì)或多肽配基性碘的蛋白質(zhì)或多肽配基. 上面是125I標(biāo)記的HPNS. 下面是125I標(biāo)記HPNS脫去羥基琥珀酰亞胺基，連接到多肽鏈的末端游離氨基，形成氨基末端加125I標(biāo)記3-(4-羥基苯)-丙酸的標(biāo)記多肽.125I -HPNSDept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysic

37、s, Peking University School of Basic Medical science 三三 放射性配基的質(zhì)量鑒定放射性配基的質(zhì)量鑒定 1. 放射化學(xué)純度放射化學(xué)純度: 放射性配基的放射化學(xué)純度對(duì)受體結(jié)合率及分析靈敏度放射性配基的放射化學(xué)純度對(duì)受體結(jié)合率及分析靈敏度均有較大影響。除新鮮制備的產(chǎn)品外，存放一定時(shí)間后的均有較大影響。除新鮮制備的產(chǎn)品外，存放一定時(shí)間后的標(biāo)記配基均應(yīng)重測(cè)其放化純度，以保證分析的準(zhǔn)確性。一標(biāo)記配基均應(yīng)重測(cè)其放化純度，以保證分析的準(zhǔn)確性。一般要求放化純度應(yīng)在般要求放化純度應(yīng)在95以上。以上。 2. 結(jié)合活性的鑒定結(jié)合活性的鑒定 : 受體結(jié)合分析中，放射性

38、配基和受體的結(jié)合活性特別重要。受體結(jié)合分析中，放射性配基和受體的結(jié)合活性特別重要。目前，測(cè)定配基的活性主要是指與受體的結(jié)合能力目前，測(cè)定配基的活性主要是指與受體的結(jié)合能力（bindability）, 即測(cè)定其最大結(jié)合即測(cè)定其最大結(jié)合%, 理論上應(yīng)為理論上應(yīng)為100%。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 結(jié)合活性的測(cè)量方法結(jié)合活性的測(cè)量方法(JC Ker

39、mode 提出提出):以定量標(biāo)記配基加逐級(jí)增加至過(guò)量的受體制劑進(jìn)行反應(yīng)，以定量標(biāo)記配基加逐級(jí)增加至過(guò)量的受體制劑進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定結(jié)合百分率。測(cè)定結(jié)合百分率。以結(jié)合百分率的倒數(shù)對(duì)受體濃度的倒數(shù)作圖，獲得一條以結(jié)合百分率的倒數(shù)對(duì)受體濃度的倒數(shù)作圖，獲得一條直線。直線。延長(zhǎng)直線與縱座標(biāo)的交點(diǎn)，即可算出該標(biāo)記配基結(jié)合活延長(zhǎng)直線與縱座標(biāo)的交點(diǎn)，即可算出該標(biāo)記配基結(jié)合活性。性。左圖左圖: 標(biāo)記配基結(jié)合活性測(cè)標(biāo)記配基結(jié)合活性測(cè)定示意圖定示意圖. 交點(diǎn)值為交點(diǎn)值為1.14, 結(jié)結(jié)合活性合活性=1/1.14=88.7%1Dept.of Biophysics, Peking University School of

40、 Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 3. 放射性配基比活度的測(cè)定放射性配基比活度的測(cè)定 *受體結(jié)合分析結(jié)果的計(jì)算離不開準(zhǔn)確的比活度數(shù)據(jù)。受體結(jié)合分析結(jié)果的計(jì)算離不開準(zhǔn)確的比活度數(shù)據(jù)。*從配基的比活度算出復(fù)合物的比活度，然后復(fù)合物的放從配基的比活度算出復(fù)合物的比活度，然后復(fù)合物的放射性活度除以該比活度，算出受體的分子數(shù)。射性活度除以該比活度，算出受體的分子數(shù)。*測(cè)定配基的比活度，關(guān)鍵是準(zhǔn)確測(cè)定配基的化學(xué)量測(cè)定配基的比活度，關(guān)鍵是準(zhǔn)確測(cè)定配基的化學(xué)量

41、, 目目前前,商品化的標(biāo)記配基商品化的標(biāo)記配基, 放射活度和化學(xué)量的定量都很精確放射活度和化學(xué)量的定量都很精確,通常不需要在實(shí)驗(yàn)室再測(cè)定通常不需要在實(shí)驗(yàn)室再測(cè)定. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第二節(jié)第二節(jié) 受體標(biāo)本的制備受體標(biāo)本的制備一一 組織切片組織切片第一種方法先體內(nèi)給放射性配基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)后取組織切片第一種方法先體內(nèi)給放射性配基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)

42、后取組織切片第二種方法先取進(jìn)行切片再進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)第二種方法先取進(jìn)行切片再進(jìn)行結(jié)合反應(yīng) 整體注射放整體注射放射配基射配基在位灌在位灌流固定流固定取出臟器取出臟器常規(guī)切片常規(guī)切片大體、光鏡或電大體、光鏡或電鏡自顯影鏡自顯影組織切片整體給放射配基的操作流程圖組織切片整體給放射配基的操作流程圖 新鮮組織新鮮組織冰凍切片冰凍切片離體放射配離體放射配基結(jié)合反應(yīng)基結(jié)合反應(yīng)大 體 或 光大 體 或 光鏡自顯影鏡自顯影常 規(guī) 超常 規(guī) 超薄切片薄切片電鏡自電鏡自顯影顯影組織切片離體給放射配基的操作流程圖組織切片離體給放射配基的操作流程圖 多聚甲醛多聚甲醛 Dept.of Biophysics, Peking U

43、niversity School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 二二 完整活細(xì)胞完整活細(xì)胞 *用細(xì)胞懸液進(jìn)行反應(yīng)用細(xì)胞懸液進(jìn)行反應(yīng)制備細(xì)制備細(xì)胞懸液胞懸液試管內(nèi)進(jìn)行放射試管內(nèi)進(jìn)行放射配基結(jié)合反應(yīng)配基結(jié)合反應(yīng)收集細(xì)胞收集細(xì)胞測(cè)量放射性測(cè)量放射性直接向貼壁細(xì)胞加放射直接向貼壁細(xì)胞加放射配基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)配基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng) 收集細(xì)胞收集細(xì)胞測(cè)量放射性測(cè)量放射性需要注意的問(wèn)題需要注意的問(wèn)題*每個(gè)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)孔的細(xì)胞數(shù)應(yīng)相同每個(gè)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)孔的細(xì)胞數(shù)

44、應(yīng)相同 *少數(shù)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)孔可不加放射配基供細(xì)胞定量用少數(shù)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)孔可不加放射配基供細(xì)胞定量用,蛋白定量蛋白定量,細(xì)胞記數(shù)細(xì)胞記數(shù). *細(xì)胞收集方法細(xì)胞收集方法,酶消化酶消化,細(xì)胞收集器等細(xì)胞收集器等 *要有一定數(shù)量的培養(yǎng)瓶做非特異結(jié)合要有一定數(shù)量的培養(yǎng)瓶做非特異結(jié)合 *用貼壁細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)用貼壁細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)需要注意的問(wèn)題需要注意的問(wèn)題: 結(jié)果以每結(jié)果以每105或或106細(xì)胞的受體數(shù)表示細(xì)胞的受體數(shù)表示, 注意保證受體完好無(wú)損注意保證受體完好無(wú)損 抽濾法抽濾法Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical scien

45、ce Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 三三 亞細(xì)胞組分的差速離心法分離亞細(xì)胞組分的差速離心法分離 細(xì)胞的質(zhì)膜細(xì)胞的質(zhì)膜,胞漿胞漿,胞核有很多蛋白受體胞核有很多蛋白受體, 打碎成勻漿后，不同打碎成勻漿后，不同的受體就有不同的密度，在一定的介質(zhì)中它們的沉降速度不同，的受體就有不同的密度，在一定的介質(zhì)中它們的沉降速度不同，用差速離心法可以將它們分離用差速離心法可以將它們分離. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medic

46、al science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 亞細(xì)胞組分制備中的要注意的幾個(gè)具體問(wèn)題亞細(xì)胞組分制備中的要注意的幾個(gè)具體問(wèn)題 1 去除內(nèi)源性配基及蛋白水解酶去除內(nèi)源性配基及蛋白水解酶 要用含蛋白水解酶抑制劑的離心緩沖液介質(zhì)溶解標(biāo)本要用含蛋白水解酶抑制劑的離心緩沖液介質(zhì)溶解標(biāo)本, 反復(fù)離心反復(fù)離心 (40000g, 1530min)，3次以上次以上, 棄上清棄上清, 收集沉淀即可收集沉淀即可. 名稱應(yīng)用濃度名稱應(yīng)用濃度EDTAEGTA苯甲基磺酰氟 (PMSF)抑蛋白酶肽(Aproti

47、nin)110mmol/L110mmol/L100ug/ml1-2g/ml亮抑蛋白酶肽 Leupeptin胃蛋白酶抑制劑 Pepstatin ATLCK tosyllysine chloromethyl ketoneTPCK tosylphenylalanine chloromethyl ketone1-2g/ml1-2g/ml50g/ml100g/ml常用于受體放射配基測(cè)定介質(zhì)中的蛋白水解酶抑制劑常用于受體放射配基測(cè)定介質(zhì)中的蛋白水解酶抑制劑 2 受體標(biāo)本的保存受體標(biāo)本的保存 一般標(biāo)本的勻漿一般標(biāo)本的勻漿(除結(jié)合反應(yīng)外除結(jié)合反應(yīng)外)都在都在0-4下操作下操作, -70保存保存, 一般能保存半

48、年一般能保存半年. 這種方法最常用于膜制劑，所以也稱為洗膜法。這種方法最常用于膜制劑，所以也稱為洗膜法。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 3 受體蛋白從膜結(jié)構(gòu)或核中溶脫成為可溶性受體蛋白受體蛋白從膜結(jié)構(gòu)或核中溶脫成為可溶性受體蛋白 一般來(lái)說(shuō)核受體主要用高濃度一般來(lái)說(shuō)核受體主要用高濃度KCl，膜受體主要用表面活性，膜受體主要用表面活性劑劑(去垢劑去垢劑

49、) 溶解溶解, 通過(guò)離心和冷凍濃縮通過(guò)離心和冷凍濃縮, 獲得純度教高的蛋白獲得純度教高的蛋白.受體類別主要溶脫試劑(均用緩沖液配制)基本溶脫條件（不同受體可能有一定差異）核受體酪氨酸激酶受體離子通道受體G-蛋白偶聯(lián)受體0.4 mol/L KCl1% (V/V) Triton X-1001% CHAPS1.5% 毛地黃皂甙04, 振搖1小時(shí)室溫振搖半小時(shí)或04振搖1小時(shí)04，振搖0.51小時(shí)04，振搖0.51小時(shí)幾種溶脫劑的使用方法幾種溶脫劑的使用方法4 受體蛋白的進(jìn)一步純化受體蛋白的進(jìn)一步純化 常用的親合層析常用的親合層析,離子交換層析離子交換層析, 高效液相色譜等技術(shù)高效液相色譜等技術(shù) 主要

50、用來(lái)分析受體的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系主要用來(lái)分析受體的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第三節(jié)第三節(jié) 放射配基結(jié)合反應(yīng)放射配基結(jié)合反應(yīng)針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，放射配基結(jié)合反應(yīng)有多種類型針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，放射配基結(jié)合反應(yīng)有多種類型 單純求受體密度單純求受體密度 同時(shí)求受體密度和同時(shí)求受體密度和親和力親和力 可用選擇性放射配基做多點(diǎn)飽

51、可用選擇性放射配基做多點(diǎn)飽和分析和分析;也可用無(wú)選擇性的放射也可用無(wú)選擇性的放射配基和有選擇性的非標(biāo)記配基配基和有選擇性的非標(biāo)記配基作多點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。作多點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。 用單點(diǎn)結(jié)合分析用單點(diǎn)結(jié)合分析需要用多點(diǎn)飽和分析需要用多點(diǎn)飽和分析求不同亞型的受體求不同亞型的受體密度和親和力密度和親和力Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射配基結(jié)合反應(yīng)的一些共同

52、問(wèn)題放射配基結(jié)合反應(yīng)的一些共同問(wèn)題1 反應(yīng)介質(zhì)反應(yīng)介質(zhì) *放射配基結(jié)合分析盡量模擬生理?xiàng)l件，以達(dá)到高的結(jié)合率放射配基結(jié)合分析盡量模擬生理?xiàng)l件，以達(dá)到高的結(jié)合率 .*常見緩沖液有常見緩沖液有:磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、緩沖液、HEPES緩沖液等緩沖液等 , pH7.47.8 *制備受體標(biāo)本的緩沖液時(shí)通常要加一些附加成分制備受體標(biāo)本的緩沖液時(shí)通常要加一些附加成分: 附加成分中的蔗糖附加成分中的蔗糖0.25mol/L對(duì)一些結(jié)合反應(yīng)沒(méi)有影響，對(duì)一些結(jié)合反應(yīng)沒(méi)有影響，制備緩沖液和反應(yīng)緩沖液合二為一使用。制備緩沖液和反應(yīng)緩沖液合二為一使用。 兒茶酚胺類的受體容易氧化失活，制備標(biāo)本

53、和反應(yīng)時(shí)都兒茶酚胺類的受體容易氧化失活，制備標(biāo)本和反應(yīng)時(shí)都應(yīng)含還原劑如維生素應(yīng)含還原劑如維生素C。Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 鈉、鎂等離子在不同的受體系統(tǒng)中會(huì)有不同的影響，鈉、鎂等離子在不同的受體系統(tǒng)中會(huì)有不同的影響，需根據(jù)具體目的決定選用與否。需根據(jù)具體目的決定選用與否。 易被蛋白水解酶破壞的受體系統(tǒng)制備標(biāo)本時(shí)需加蛋白易被蛋白水解酶破壞的受體系

54、統(tǒng)制備標(biāo)本時(shí)需加蛋白酶抑制劑，反應(yīng)緩沖液也應(yīng)含蛋白酶抑制劑，但需注意有酶抑制劑，反應(yīng)緩沖液也應(yīng)含蛋白酶抑制劑，但需注意有些蛋白酶抑制劑有抑制某些受體系統(tǒng)特異性結(jié)合的作用，些蛋白酶抑制劑有抑制某些受體系統(tǒng)特異性結(jié)合的作用，應(yīng)當(dāng)設(shè)法避免。應(yīng)當(dāng)設(shè)法避免。 受體蛋白的反應(yīng)終濃度最好在受體蛋白的反應(yīng)終濃度最好在0.1mg/ml以上，蛋白量以上，蛋白量過(guò)少可能因管壁的吸附作用而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性過(guò)少可能因管壁的吸附作用而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophys

55、ics, Peking University School of Basic Medical science 2 標(biāo)記配基濃度標(biāo)記配基濃度標(biāo)記配基濃度的選擇標(biāo)記配基濃度的選擇, 一般來(lái)說(shuō)，應(yīng)當(dāng)兼顧兩個(gè)方面一般來(lái)說(shuō)，應(yīng)當(dāng)兼顧兩個(gè)方面: 一是在同一實(shí)驗(yàn)中放射性最低的一點(diǎn)應(yīng)能滿足測(cè)量統(tǒng)一是在同一實(shí)驗(yàn)中放射性最低的一點(diǎn)應(yīng)能滿足測(cè)量統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求計(jì)學(xué)的要求. 二是放射配基的用量應(yīng)盡可能低，使非特異結(jié)合不致太二是放射配基的用量應(yīng)盡可能低，使非特異結(jié)合不致太高，而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)的費(fèi)用控制在能承受的范圍內(nèi)高，而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)的費(fèi)用控制在能承受的范圍內(nèi). 標(biāo)記配基濃度一般選擇在標(biāo)記配基濃度一般選擇在0.110倍倍Kd間間

56、. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 3 測(cè)量非特異結(jié)合的非標(biāo)記配基濃度測(cè)量非特異結(jié)合的非標(biāo)記配基濃度 特異結(jié)合特異結(jié)合=總結(jié)合總結(jié)合-非特異結(jié)合非特異結(jié)合 非特異結(jié)合通常都用平行管測(cè)定，該管反應(yīng)體積、孵非特異結(jié)合通常都用平行管測(cè)定，該管反應(yīng)體積、孵育條件、分離條件、受體濃度、放射配基濃度都和總結(jié)育條件、分離條件、受體濃度、放射配基濃度都和總結(jié)合管完全

57、相同合管完全相同. 非特異結(jié)合管含有較大量的非標(biāo)記配基，結(jié)果特異結(jié)非特異結(jié)合管含有較大量的非標(biāo)記配基，結(jié)果特異結(jié)合完全被抑制，于是測(cè)得的放射性就代表非特異結(jié)合。合完全被抑制，于是測(cè)得的放射性就代表非特異結(jié)合。 Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 測(cè)量非特異結(jié)合的非標(biāo)記配基濃度方法測(cè)量非特異結(jié)合的非標(biāo)記配基濃度方法: 向反應(yīng)系統(tǒng)中逐步增加測(cè)定非特異結(jié)合的非

58、放射性配基濃度向反應(yīng)系統(tǒng)中逐步增加測(cè)定非特異結(jié)合的非放射性配基濃度, 可以得到如圖所示的曲線可以得到如圖所示的曲線. 圖中低濃度時(shí)只有部分特意結(jié)合被抑制，隨濃度增加而抑制圖中低濃度時(shí)只有部分特意結(jié)合被抑制，隨濃度增加而抑制逐步顯著逐步顯著 (圖中圖中A段段). 到達(dá)一定濃度時(shí)為一個(gè)平段到達(dá)一定濃度時(shí)為一個(gè)平段.該平段表示特該平段表示特異結(jié)合已完全被抑制異結(jié)合已完全被抑制(圖中圖中B段段). 如果繼續(xù)加大非放射性配基濃如果繼續(xù)加大非放射性配基濃度，則非特異結(jié)合也將被抑制度，則非特異結(jié)合也將被抑制, 平段又開始下降平段又開始下降 (圖中圖中C段段)。 用于非特異結(jié)合測(cè)定的非標(biāo)記用于非特異結(jié)合測(cè)定的

59、非標(biāo)記配基濃度的合理選擇應(yīng)是平段的配基濃度的合理選擇應(yīng)是平段的濃度濃度, 應(yīng)當(dāng)選擇應(yīng)當(dāng)選擇B區(qū)區(qū). 通常非放射性配基的濃度是通常非放射性配基的濃度是放射形配基濃度的放射形配基濃度的1000倍倍Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 非特異結(jié)合是高容量、低親和力結(jié)合，不易飽和，如各非特異結(jié)合是高容量、低親和力結(jié)合，不易飽和，如各管所加管所加LT不同，則非特異結(jié)

60、合通常和不同，則非特異結(jié)合通常和LT的量呈線性關(guān)系，的量呈線性關(guān)系，在普通坐標(biāo)上呈一逐步上升的直線。據(jù)此，實(shí)際工作中不在普通坐標(biāo)上呈一逐步上升的直線。據(jù)此，實(shí)際工作中不需要每一不同劑量的需要每一不同劑量的LT都做平行的非特異結(jié)合管，只需都做平行的非特異結(jié)合管，只需總共做總共做3點(diǎn)，通過(guò)直線回歸即可求出任何點(diǎn)，通過(guò)直線回歸即可求出任何LT時(shí)的非特時(shí)的非特異結(jié)合。異結(jié)合。非特異結(jié)合特點(diǎn)非特異結(jié)合特點(diǎn):Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science Dept.of Biophysics, Peking Uni