食品中大腸菌群的測定

1、 培養(yǎng)特性： 記錄在記錄在24h 24h 和和48h 48h 內(nèi)產(chǎn)氣的內(nèi)產(chǎn)氣的LST LST 肉湯管數(shù)。肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進行復(fù)產(chǎn)氣者則進行復(fù)發(fā)酵試驗發(fā)酵試驗。 大腸桿菌大腸桿菌0157顯色顯色培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上的菌落的菌落在伊紅美蘭乳糖在伊紅美蘭乳糖瓊脂（EMB）上）上 大腸菌群在去氧膽酸鈉瓊脂上的典型特征大腸菌群在去氧膽酸鈉瓊脂上的典型特征 典型菌落為紅典型菌落為紅色色 , 菌落周圍菌落周圍有紅色的膽鹽有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落沉淀環(huán)。菌落直徑為直徑為 2-3mm 或更大。或更大。 大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅瓊脂大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅瓊脂(VRBA)上

2、典型特征上典型特征 典型菌落為紫典型菌落為紫紅色紅色 , 菌落周菌落周圍有紅色的膽圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為落直徑為 0.5mm 或更或更大。大。 大腸桿菌在大腸桿菌在MFC瓊脂上的典型特征瓊脂上的典型特征 試驗流程試驗流程1 1、 樣品的稀釋樣品的稀釋按第一法中的稀釋方法進行。按第一法中的稀釋方法進行。（1 1） 選取選取2 2個個3 3個適宜的連續(xù)稀釋度個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋，每個稀釋度接種度接種兩個無菌平皿兩個無菌平皿，每皿每皿1m1mL L。同時分別取。同時分別取1m1mL L生生理鹽水加入兩個無菌平皿理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照作空白對照。（2 2） 及時

3、將及時將15 mL-20m15 mL-20mL L冷至冷至46 46 的的結(jié)晶紫中性結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（紅膽鹽瓊脂（VRBA VRBA ）約傾注于每個平皿中。小心約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，后，再加再加3 mL-4m3 mL-4mL LVRBAVRBA 覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于置于3636l l 培養(yǎng)培養(yǎng)18h-24h 18h-24h 。2 2、 平板計數(shù)平板計數(shù) （3 3） 平板菌落數(shù)的選擇平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在1515-150-150 之間的平板，分別計數(shù)

4、之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典典型菌落型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 0.5 mm 或更大?；蚋?。2、 平板計數(shù)平板計數(shù) （4 4）、）、 證實試驗證實試驗 從從VRBA VRBA 平板上挑取平板上挑取10 10 個個不同類型的不同類型的典型和典型和可疑菌落可疑菌落，分別移種于，分別移種于BGLBBGLB 肉湯管內(nèi)，肉湯管內(nèi)，36361 1 培養(yǎng)培養(yǎng)24h-48h24h-48h ，觀察產(chǎn)氣情況。凡，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB BGLB 肉湯管肉湯管

5、產(chǎn)氣產(chǎn)氣，即可報告為，即可報告為大腸菌群陽性大腸菌群陽性。2、 平板計數(shù)平板計數(shù) （5 5）大腸菌群平板計數(shù)的報告）大腸菌群平板計數(shù)的報告 經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3 3）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。2、 平板計數(shù)平板計數(shù)例：例：10-4樣品稀釋液樣品稀釋液1 mL，在，在VRBA平板上平板上有有100個典型和可疑菌落，挑取個典型和可疑菌落，挑取 其中其中10個接種個接種BGLB肉湯管，證實有肉湯管，證實有6個陽個陽性管，則

6、該樣品的大腸菌群數(shù)為：性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。）。國標國標4789.3的的08版與版與03版主要不同版主要不同1 1、名稱更改、名稱更改 以以大腸菌群計數(shù)大腸菌群計數(shù)代替原來的代替原來的大腸菌群測定。大腸菌群測定。2 2、增加增加了大腸菌群的了大腸菌群的平板計數(shù)法和紙片檢測法。平板計數(shù)法和紙片檢測法。3 3、大腸菌群的、大腸菌群的MPNMPN法以法以乳糖為主乳糖為主改為以改為以月桂基硫月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（酸鹽胰蛋白胨（LSTLST）肉湯為主）肉湯為主的要培養(yǎng)基的的要培養(yǎng)基的MPNMPN法。法。4 4、大腸菌群的、大腸菌

7、群的MPNMPN法中原法中原“報告每報告每100 ml 100 ml （或（或g g）大腸菌群的大腸菌群的MPNMPN值值”改為改為“報告每報告每1 ml 1 ml （或（或1g1g）大腸菌群的大腸菌群的MPNMPN值值”。比較區(qū)別比較區(qū)別GB/T4789.38 - 2008大腸桿菌的計數(shù)大腸桿菌的計數(shù)03版版 流程流程 一、一、 步驟步驟 取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗方法取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗方法相同相同，做成做成1:10的均勻稀釋液為檢樣。的均勻稀釋液為檢樣。同一稀釋度在做菌落總數(shù)測定的同時接同一稀釋度在做菌落總數(shù)測定的同時接種乳糖膽鹽發(fā)酵管，并且用大腸埃希氏種乳糖膽鹽發(fā)酵管，并且用

8、大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種作對照菌、產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種作對照 。 1、乳糖發(fā)酵試驗乳糖發(fā)酵試驗 根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z樣污染程根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z樣污染程度的估計，選擇度的估計，選擇三個稀釋度三個稀釋度，每個稀釋，每個稀釋度接種度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。 接種量在接種量在1ml以上者以上者，用用雙料乳糖膽鹽雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管發(fā)酵管，1ml及及1ml以下者以下者，用用單料乳糖膽鹽單料乳糖膽鹽發(fā)酵管發(fā)酵管，同時用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌，同時用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種混合接種于混合菌種混合接種于1支作單料乳糖膽鹽發(fā)酵支作單料乳糖膽鹽發(fā)酵管對照。管對照。置置361溫

9、箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)242小時小時，如所有如所有發(fā)酵管都發(fā)酵管都不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣，則可報告為則可報告為大腸菌群大腸菌群陰性陰性，如如有產(chǎn)氣者有產(chǎn)氣者，則與對照的混合菌則與對照的混合菌種一起種一起按下列程序進行按下列程序進行。 2 、分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別在將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別在伊紅美蘭瓊脂伊紅美蘭瓊脂（EMB瓊脂）平板上劃線分離。然后置瓊脂）平板上劃線分離。然后置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824小時小時后取出后取出，觀察觀察菌落形態(tài)菌落形態(tài)，并作并作革蘭氏染色革蘭氏染色和和證實證實試驗試驗。 可疑菌落特點：可疑菌落特點：具有金屬光澤的深紫黑色菌落；具有金屬光澤的深紫黑色菌落；不帶或略帶

10、金屬光澤的菌落；不帶或略帶金屬光澤的菌落；中心色較深的淡紫黑色菌落。中心色較深的淡紫黑色菌落。3 、證實試驗證實試驗 在上述平板上挑取可疑大腸菌落在上述平板上挑取可疑大腸菌落12個進行個進行革蘭氏染色革蘭氏染色，同時接種同時接種乳糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵管管，置置361溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)242小時小時,觀察觀察產(chǎn)氣情況產(chǎn)氣情況，凡凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為即可報告為大腸大腸菌群陽性菌群陽性。 4 、報告報告 根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每表，報告每100ml（g）大腸菌群的）大腸菌群的MP

11、N值。值。 二、結(jié)果二、結(jié)果 根據(jù)證實大腸菌群的陽性管數(shù)根據(jù)證實大腸菌群的陽性管數(shù)，查查MPN檢索表檢索表(見附錄見附錄)報告每報告每100ml(克克)大大腸菌群的最可能數(shù)腸菌群的最可能數(shù)。三、注意事項三、注意事項1、第一步乳糖膽鹽發(fā)酵試驗是樣品的、第一步乳糖膽鹽發(fā)酵試驗是樣品的發(fā)酵結(jié)果，發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵試驗不是純菌的發(fā)酵試驗，初發(fā)，初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰性。只做一步，會有相當多的合格樣品性。只做一步，會有相當多的合格樣品作為不合格處理，應(yīng)注意。作為不合格處理，應(yīng)注意。 2、膽鹽膽鹽可抑制可抑制革蘭氏革蘭氏陽性菌的生長，陽性菌的生長，有

12、利于大腸桿菌的生長繁殖。有利于大腸桿菌的生長繁殖。 3 3、接種量在、接種量在1ml以上者以上者，用用雙料雙料乳糖膽乳糖膽鹽發(fā)酵管鹽發(fā)酵管，1ml及及1ml以下者以下者，用用單料單料乳糖膽乳糖膽鹽發(fā)酵管。鹽發(fā)酵管。 4、大腸菌群菌落在、大腸菌群菌落在EMB瓊脂上瓊脂上大多呈大多呈紫紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤黑色有金屬光澤或無金屬光澤。應(yīng)。應(yīng)取典型菌落，取典型菌落，如無應(yīng)多取幾個菌落，以免出現(xiàn)假陽性。如無應(yīng)多取幾個菌落，以免出現(xiàn)假陽性。 一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，且且革蘭氏染色革蘭氏染色為陰性，可做出判定。為陰性，可做出判定。 5、對初發(fā)酵時未產(chǎn)氣

13、的發(fā)酵管、對初發(fā)酵時未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問時，可用手輕輕敲動或搖動試管，有疑問時，可用手輕輕敲動或搖動試管，如有氣泡沿管壁上升，應(yīng)考慮有氣體產(chǎn)如有氣泡沿管壁上升，應(yīng)考慮有氣體產(chǎn)生，做進一步試驗。生，做進一步試驗。 6、 MPN檢索表是采用三個稀釋檢索表是采用三個稀釋度九管法，較理想的結(jié)果是度九管法，較理想的結(jié)果是最低最低3管為陽性管為陽性，最高最高3管為陰性管為陰性。如無法估測樣品中的菌數(shù)。如無法估測樣品中的菌數(shù)時，應(yīng)做一定范圍的稀釋度。時，應(yīng)做一定范圍的稀釋度。 7、 MPN檢索表只提供了檢索表只提供了3個稀釋個稀釋度，若改用其它濃度時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)度，若改用其它濃度時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加或

14、減少。增加或減少。醬油（醬油（GB/T2717-2003）細菌菌落總數(shù)：細菌菌落總數(shù)： 30000cfu/ml大腸菌群：大腸菌群： 30MPN/100ml腸道致病菌：腸道致病菌： 不得檢出不得檢出全脂奶粉、脫脂奶粉（全脂奶粉、脫脂奶粉（GB5410-1999） 特級特級 一級一級 二級二級細菌菌落總數(shù)：細菌菌落總數(shù)：20000 30000 50000（cfu/ml）大腸菌群大腸菌群 40 90 90（MPN/100g）腸道致病菌：腸道致病菌： 不得檢出不得檢出 不得檢出不得檢出 不得檢出不得檢出巴氏殺菌乳（巴氏殺菌乳（GB5408.1-1999）細菌菌落總數(shù)：細菌菌落總數(shù)： 30000cfu/ml大腸菌群：大腸菌群： 90MPN/100ml腸道致病菌：腸道致病菌： 不得檢出不得檢出生活飲用水衛(wèi)生標準（生活飲用水衛(wèi)生標準（GB5749-2006）菌落總數(shù)菌落總數(shù)cfu/ml： 100總大腸菌群總大腸菌群cfu/100ml或或MPN/100ml ：不得檢：不得檢出出耐熱大腸菌群耐熱大