CNAS-GL41臨床微生物檢驗程序驗證指南

1、WORD格式導(dǎo)讀包括顯微鏡檢查、別離培養(yǎng)及鑒定、藥敏試驗等在內(nèi)的臨床微生物的檢驗方法 檢驗程序如何驗證？很多人對此非常困惑。 由 CNAS2021.5.30新鮮發(fā)布的 "臨床微生物檢驗程序驗證指南" 猶如一盞明燈給大家指明了具體的方向。 雖然是針對認(rèn)可實驗室制定的指南文件，其他實驗室亦可參考。局部內(nèi)容節(jié)選顯微鏡檢查4.3顯微鏡檢查顯微鏡檢查程序包括涂片制備、染色鏡檢和結(jié)果報告過程。實驗室在開展各種類型顯微鏡檢查如革蘭染色、抗酸染色、墨汁染色等前應(yīng)對本實驗室使用的檢驗程序進(jìn)展驗證，并由經(jīng)培訓(xùn)有涂片鏡檢能力的實驗室人員操作。檢查方法可包括手工染片法和自動化染片法。所有樣品及其盛

2、放容器均應(yīng)當(dāng)作有傳染性物質(zhì)，并按照實驗室生物平安要求進(jìn)展操作。4.3.1驗證要求顯微鏡檢查程序的驗證應(yīng)包括能力驗證/ 實驗室間比對和實驗室內(nèi)人員比對當(dāng)多專業(yè)資料整理WORD格式名人員從事該工程時。如果沒有可獲得的能力驗證或室間質(zhì)評，實驗室應(yīng)自行組織實驗室專業(yè)資料整理WORD格式間比對 宜與通過認(rèn)可的實驗室比對。假設(shè)實驗室同時開展手工染片法和自動化染片法，應(yīng)專業(yè)資料整理WORD格式進(jìn)展兩種方法的實驗室內(nèi)部比對。4.3.2比對方案4.3.2.1樣品數(shù)量專業(yè)資料整理WORD格式每項檢查應(yīng)使用至少5份樣品進(jìn)展驗證，覆蓋全部樣品類型，無菌樣品類型包含陰性和陽性結(jié)果。實驗室應(yīng)優(yōu)先使用結(jié)果的留樣樣品，當(dāng)不可

3、獲取時可采用模擬樣品。4.3.2.2檢驗程序按臨床標(biāo)本常規(guī)方式處理, 由本崗位工作人員使用實驗室檢驗程序進(jìn)展涂片制備、染色、鏡檢、判讀。4.3.2.3結(jié)果報告根據(jù)實驗室程序文件規(guī)定進(jìn)展結(jié)果報告，其中抗酸桿菌應(yīng)根據(jù)“分級報告標(biāo)準(zhǔn)報告鏡檢結(jié)果。4.3.3可承受標(biāo)準(zhǔn)每項檢查的比對結(jié)果符合率80% 。專業(yè)資料整理WORD格式別離培養(yǎng)4.4.1 血培養(yǎng)血培養(yǎng)檢驗程序包括從病人血液采集、運(yùn)送、接收、 孵育及監(jiān)測的全過程。目前臨床實驗室廣泛使用全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)。 臨床微生物實驗室血培養(yǎng)系統(tǒng)性能驗證的主要目的是評估系統(tǒng)使用的培養(yǎng)基能否用于培養(yǎng)臨床常見微生物包括酵母菌、 厭氧菌、 苛養(yǎng)菌等 以及儀器自動化系統(tǒng)能

4、否及時檢測出血液中的大局部病原菌。血培養(yǎng)性能驗證常用 留樣驗證 和血培養(yǎng)系統(tǒng)平行比對兩種方法。血培養(yǎng)系統(tǒng)平行比對用于評估驗證系統(tǒng)和參比系統(tǒng)檢出細(xì)菌能力的一致性，但需要樣本量大， 臨床采樣有難度。 留樣驗證的優(yōu)點那么在于可評估其檢測不常見病原菌的能力。實驗室可根據(jù)醫(yī)院病人數(shù)量和地區(qū)、病種特征等具體情況和兩種方法的特點選擇其中一種適宜的驗證方法，或兩種方法同時應(yīng)用。4.4.1.1留樣驗證4.4.1.1.1驗證要求專業(yè)資料整理WORD格式驗證應(yīng)覆蓋臨床常見微生物, 需氧成人/ 兒童血培養(yǎng)瓶驗證菌株應(yīng)包括需氧/ 兼性厭氧革蘭陽專業(yè)資料整理WORD格式性菌、需氧/ 兼性厭氧革蘭陰性菌、苛養(yǎng)菌如：流感嗜血

5、桿菌、肺炎鏈球菌等和真菌，專業(yè)資料整理WORD格式厭氧血培養(yǎng)瓶驗證菌株應(yīng)包括兼性厭氧革蘭陽性菌、兼性厭氧革蘭陰性菌、專性厭氧菌， 其專業(yè)資料整理WORD格式他特殊用途血培養(yǎng)瓶參照廠家要求選擇適宜類型菌株進(jìn)展驗證。每種類型至少株，總體不少于 15株。應(yīng)盡可能使用真實患者的臨床別離菌株性能驗證用臨床留樣菌株宜經(jīng)質(zhì)譜或DNA 序列分析確認(rèn)。對于特殊、苛養(yǎng)菌可使用標(biāo)準(zhǔn)菌株或質(zhì)控菌株。某些特殊菌株需要在培養(yǎng)瓶中參加無菌、未使用抗生素的廠家推薦血液標(biāo)本，如不加可能不生長，如流感嗜血桿菌。4.4.1.1.2驗證方案模擬臨床血流感染患者的細(xì)菌含量，用留樣菌株進(jìn)展一系列稀釋，接種細(xì)菌的最終濃度為5-30CFU/

6、 瓶。假設(shè)苛養(yǎng)菌需添加適量的新鮮無菌血液成人瓶 5-10ml ，兒童瓶 1-3ml后置于血培養(yǎng)系統(tǒng)上進(jìn)展培養(yǎng)、檢測。4.4.1.1.3可承受標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)資料整理WORD格式如果在廠家說明書規(guī)定時間內(nèi)檢測出所有菌株那么該方法通過驗證。3天時間應(yīng)足以專業(yè)資料整理WORD格式檢測出至少95%的臨床相關(guān)細(xì)菌，須具備苛養(yǎng)菌、真菌、厭氧菌等的檢出能力。假設(shè)未能檢專業(yè)資料整理WORD格式出應(yīng)使用一樣菌株進(jìn)展重復(fù)試驗來驗證。假設(shè)仍不能檢測，實驗室和/ 或制造商應(yīng)在臨床使用專業(yè)資料整理WORD格式該系統(tǒng)前采取糾正措施。如果血培養(yǎng)儀升級，原系統(tǒng)和新系統(tǒng)的差異不大，培養(yǎng)瓶也沒有改專業(yè)資料整理WORD格式變，那么由供應(yīng)商

7、技術(shù)代表核查儀器性能即可，無需再次驗證。 功能核查將對孵育系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)以及軟件是否按照制造商規(guī)定運(yùn)行進(jìn)展評價。4.4.1.2血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)比對4.4.1.2.1驗證要求因血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)比對要求較高，并非強(qiáng)制要求執(zhí)行。同一廠家由同一系統(tǒng)控制采集數(shù)據(jù)的多個血培養(yǎng)模塊不需進(jìn)展比對。檢測系統(tǒng)比對允許根據(jù)患者情況和實驗室條件來評價新系統(tǒng)的性能，通常比對所需臨床標(biāo)本數(shù)量應(yīng) 100 例。專業(yè)資料整理WORD格式4.4.1.2.2驗證方案同一病人按照同樣的采血方法采集血液標(biāo)本，接種驗證血培養(yǎng)瓶和參考血培養(yǎng)瓶中，分別放入各自的培養(yǎng)系統(tǒng)上進(jìn)展培養(yǎng)、檢測。4.4.1.2.3可承受標(biāo)準(zhǔn)與參考方法相比，新培養(yǎng)系統(tǒng)檢測

8、符合率至少為95%。如果未能滿足性能要求, 那么該實驗不能通過驗證或者制造商和/ 或使用者須采取正確的糾正措施并再次進(jìn)展驗證。4.4.2一般培養(yǎng)非血液標(biāo)本一般培養(yǎng)包括各類標(biāo)本痰液、尿液、糞便、分泌物、組織等的細(xì)菌含厭氧菌、結(jié)核分枝桿菌、真菌、支原體等的培養(yǎng)。培養(yǎng)程序包括標(biāo)本處理、接種、培養(yǎng)基選擇和適宜培養(yǎng)條件 ( 溫度、氣體等 ) 。實驗室在開展各種類型標(biāo)本微生物培養(yǎng)檢驗前應(yīng)針對培養(yǎng)目的對本實驗室使用的檢驗程序進(jìn)展驗證。如果沒有可獲得的能力驗證或室間質(zhì)評，實驗室可采用培養(yǎng)基驗證方法對培養(yǎng)程序進(jìn)展驗證。使用質(zhì)控菌株或留樣菌株模擬標(biāo)本進(jìn)展培養(yǎng)，驗證該培養(yǎng)程序是否滿足檢出性能要求。4.4.2.1驗證

9、要求每項檢查每種樣品類型至少1份標(biāo)本。培養(yǎng)基根據(jù)其用途主要分為兩種： 選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基。 選擇性培養(yǎng)基包含能夠抑制某些微生物生長的抗生素或化學(xué)試劑，非選擇性培養(yǎng)基那么不含抑制微生物生長的物質(zhì)，能夠促進(jìn)大多數(shù)微生物的生長。無論商品化培養(yǎng)基還是自配培養(yǎng)基，都需要在使用前對培養(yǎng)基性能進(jìn)展驗證，驗證菌株可選擇質(zhì)控菌株或臨床菌株。對于某些苛養(yǎng)細(xì)菌專用培養(yǎng)基，實驗室必須確定該培養(yǎng)基能保證對應(yīng)苛養(yǎng)細(xì)菌的生長。如：厭氧菌、百日咳博德特菌、彎曲菌、螺桿菌、軍團(tuán)菌、淋病奈瑟菌、以及其他需要特殊生長條件的細(xì)菌。 而對于一些非選擇性培養(yǎng)基，如血平板和巧克力平板需保證其能支持大局部細(xì)菌的生長。4.4.2.2

10、驗證方案標(biāo)準(zhǔn)菌株、能力驗證/ 室間質(zhì)評活動使用的菌株、從臨床病人標(biāo)本別離的具有穩(wěn)定表型的菌株均可用做驗證菌株，實驗室對其生化特征及鑒定結(jié)果應(yīng)做好相關(guān)記錄。4.4.2.2.1直接接種法按照實驗室細(xì)菌別離培養(yǎng)SOP 直接接種菌株至培養(yǎng)基上，觀察細(xì)菌生長情況。如果使用直接接種， 應(yīng)慎重操作。 接種菌量過多或者過少都將掩蓋培養(yǎng)基的促進(jìn)或抑制生長的特性。如果在使用直接接種法時出現(xiàn)驗證不合格，那么改用標(biāo)準(zhǔn)化菌懸液進(jìn)展驗證。4.4.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)化菌懸液法不同實驗室之間可進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)化菌懸液驗證比對。較高濃度的菌懸液能夠較好測試選擇性培養(yǎng)基抑制特定微生物生長的能力。較低濃度的菌懸液那么能夠驗證非選擇性培養(yǎng)基充分

11、支持細(xì)菌生長的能力。第一步：菌懸液的準(zhǔn)備1直接菌落法：使用培養(yǎng)18到 24個小時的菌落，在0.85% 無菌生理鹽水中制成菌懸液，使其濁度達(dá)0.5麥?zhǔn)蠞岫?。專業(yè)資料整理WORD格式2生長法： 從 24h培養(yǎng)物中接種3到 5個菌落至無菌肉湯以此制備懸浮液。孵育數(shù)小時使其濁度達(dá)0.5麥?zhǔn)蠞岫取５诙剑航臃N1驗證非選擇性培養(yǎng)基用無菌肉湯或者生理鹽水將0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙哼M(jìn)展1:100稀釋，每個測試平板接種10 l 0.01ml 懸浮液，均勻涂布。如果菌落過密，那么可將菌液稀釋1000倍后再接種。2驗證選擇性培養(yǎng)基用無菌肉湯或者生理鹽水將0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙哼M(jìn)展1:10稀釋，每個測試平板接種專業(yè)資料整理

12、WORD格式10 l 0.01ml懸浮液。如果菌落過密，那么可將菌液稀釋100倍后再接種。專業(yè)資料整理WORD格式3驗證培養(yǎng)管專業(yè)資料整理WORD格式用10 L0.01mL 未稀釋的0.5麥?zhǔn)蠞岫葢腋∫哼M(jìn)展接種。專業(yè)資料整理WORD格式培養(yǎng)溫度、氣體條件和培養(yǎng)時間執(zhí)行實驗室SOP文件規(guī)定。專業(yè)資料整理WORD格式4.4.2.3可承受標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)資料整理WORD格式4.4.2.3.1在選擇性培養(yǎng)基上驗證菌株長勢良好、菌落大小與預(yù)期相符、菌落形態(tài)典型，并且能夠抑制特定微生物的生長，可判定性能符合要求，驗證合格。4.4.2.3.2在非選擇性培養(yǎng)基上驗證菌株長勢良好、菌落大小與預(yù)期相符、菌落形態(tài)典型，血培

13、養(yǎng)基上的溶血類型符合，可判定非選擇性培養(yǎng)基驗證合格。4.4.3活菌計數(shù)臨床微生物實驗室需對中段尿、肺泡支氣管灌洗液等標(biāo)本進(jìn)展活菌計數(shù)?；罹嫈?shù)定量培養(yǎng)除驗證對病原菌的別離能力外，還需對定量接種環(huán)進(jìn)展驗證。定量接種環(huán)不如微量加樣器準(zhǔn)確，但仍不失為半定量培養(yǎng)或者稀釋的一種很好的方法，在允許 20%誤差存在時可以使用定量接種環(huán)。4.4.3.1驗證要求定量接種環(huán)使用前應(yīng)進(jìn)展驗證使用微量加樣器只需計量檢定，一次性定量接種環(huán)每批次應(yīng)抽樣驗證。4.4.3.2驗證方案可以采用鉆頭法和浸染法兩種方法，鉆頭法適用于重復(fù)使用金屬環(huán)，浸染法適用于重復(fù)使用金屬環(huán)和一次性接種環(huán)。浸染法較易于實施，方法如下：專業(yè)資料整理W

14、ORD格式第一步：配制Evans blue染液EBD。用蒸餾水稀釋Evans blue染液為1:500、1:1000、專業(yè)資料整理WORD格式1:2000、 1:4000 。專業(yè)資料整理WORD格式第二步：用 1ul 環(huán)取 10 環(huán) EBD原液至 10ml 蒸餾水中； 10ul 環(huán)取 10 環(huán) EBD原液至 100ml 蒸餾水中，或至 10ml 蒸餾水中后再稀釋 10 倍。第三步：用722 分光光度計600nm波長比色，重復(fù)四次。第四步：計算1ul 環(huán)和 10ul 環(huán)分別配置溶液的吸光度應(yīng)與1:1000EBD 稀釋液相符。以1:1000 稀釋液的吸光度為比對測定值，計算接種環(huán)定量配制溶液吸光度

15、與比對測定值的偏差。專業(yè)資料整理WORD格式偏差 =檢測測定值 - 比對測定值 / 檢測測定值× 100%。4.4.3.3可承受標(biāo)準(zhǔn)允許X圍：平均偏差不超過20%。微生物鑒定試驗4.5微生物鑒定試驗4.5.1微生物鑒定系統(tǒng)包括傳統(tǒng)生化鑒定系統(tǒng)、質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)、分子生物學(xué)鑒定系統(tǒng)等。本指南主要適用于商業(yè)化配套的傳統(tǒng)生化鑒定系統(tǒng)，質(zhì)譜和分子鑒定系統(tǒng)的驗證可參考執(zhí)行，但還需滿足該技術(shù)的專項要求。4.5.1.1驗證要求按優(yōu)先順序依次選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株、質(zhì)控菌株或其它菌株，試驗應(yīng)覆蓋實驗室使用的全部卡片種類和 / 或方法一些大型醫(yī)院，其患病人群更復(fù)雜、微生物種類更多，這類醫(yī)院應(yīng)對更多的菌株進(jìn)展評估。

16、對于特定地區(qū)和機(jī)構(gòu),考慮到特殊標(biāo)本不易獲取以及病人等因素，驗證菌株的選擇可適當(dāng)調(diào)整。4.5.1.2驗證方案菌株種類的選擇應(yīng)參照廠商說明書，覆蓋革蘭陽性和革蘭陰性非苛養(yǎng)菌、苛養(yǎng)菌、厭氧菌、念珠菌、隱球菌等。包括臨床留樣菌株和標(biāo)準(zhǔn)/ 質(zhì)控菌株。每種類型應(yīng)至少1 株，總體不少于 20株。按廠家說明書或?qū)嶒炇覚z測程序規(guī)定對驗證菌株進(jìn)展檢測，一般要求鑒定至種水平。對于特殊類型的微生物如棒狀桿菌、厭氧菌，芽孢桿菌，可將鑒定到屬的水平作為可以承受的性能標(biāo)準(zhǔn)。4.5.1.3可承受標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) / 質(zhì)控菌株符合率應(yīng)為100%，臨床菌株的符合率應(yīng)在90 以上。 假設(shè)未能滿足要求 , 那么該檢測系統(tǒng)不能通過驗證或者制造

17、商和/ 或使用者須采取措施。修正后的檢測系統(tǒng)應(yīng)再次進(jìn)展驗證。4.5.2 血清學(xué)鑒定試驗血清學(xué)鑒定試驗包括沙門菌/ 志賀菌 / 致病大腸桿菌 / 弧菌等的血清學(xué)分型。4.5.2.1 驗證要求沙門菌至少包括傷寒沙門菌/ 甲型副傷寒沙門菌/ 乙型副傷寒沙門菌 / 丙型副傷寒沙門菌；志賀菌包括福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、痢疾志賀菌和鮑氏志賀菌四種；致病大腸桿菌/ 弧菌等根據(jù)當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政管理和實驗室情況進(jìn)展選擇。優(yōu)先選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株和質(zhì)控菌株，也可使用實驗室確認(rèn)過的留樣臨床別離株。4.5.2.2驗證方案參照實驗室操作規(guī)程進(jìn)展操作。每種本地區(qū)常見血清型菌株至少1株。4.5.2.3可承受標(biāo)準(zhǔn)要求準(zhǔn)確率100%。專業(yè)

18、資料整理WORD格式感染免疫學(xué)定性檢測專業(yè)資料整理WORD格式4.6感染免疫學(xué)定性檢測包括困難梭菌毒素檢測、梅毒免疫學(xué)檢測RPR/TPPA/TRUST、肥達(dá)外斐試驗、真菌免疫學(xué)檢測 G 試驗 /GM 試驗等。4.6.1驗證要求檢測至少20份樣品， 通常陽性樣品和陰性樣品各占一半。對檢測的報告X圍進(jìn)展驗證時應(yīng)包括弱陽性和強(qiáng)陽性樣品。假設(shè)弱陽性樣品不好獲取，可用適當(dāng)?shù)幕|(zhì)稀釋強(qiáng)陽性樣品獲得類似的效果。4.6.2驗證方案對于未經(jīng)修改的商業(yè)化試劑盒方法來說只需要驗證符合率即可，但假設(shè)該項測試為高度依賴人工操作的實驗還應(yīng)通過不同操作人員進(jìn)展重復(fù)性/ 重現(xiàn)性的驗證。符合率：將新檢測系統(tǒng)的實驗結(jié)果與參考方法金標(biāo)準(zhǔn)或比對方法 / 其他實驗室進(jìn)展比較，計算待驗證方法的陰陽性符合率。重復(fù)性 / 重現(xiàn)性應(yīng)經(jīng)不同批次進(jìn)展驗證。評估重復(fù)性時，應(yīng)在一個樣本批內(nèi)對至少兩個陽性樣品、 兩個陰性樣品進(jìn)展重復(fù)測定。然后在不同批次重復(fù)這一過程，必要時還要更換操作人員。4.6.3可承受標(biāo)準(zhǔn)符合率： 與參考方法 金標(biāo)準(zhǔn) 或比對方法 / 其他實驗室相比其符合率應(yīng)80重復(fù)性/ 重現(xiàn)性: 對于多人多批次檢測，結(jié)果應(yīng)完全一致?？咕幬锩舾行栽囼?.7抗菌藥物敏感性試驗抗菌藥物敏感性試驗藥敏試驗可分為紙片法和最低抑菌濃度法