基因克隆步驟完整版

1、精品1總 RNA 提取(1)液氮研磨或冰上勻漿實(shí)驗(yàn)材料；先將1ml Trizol 加到離心管中待用(2)將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5 min ；打開離心機(jī)預(yù)冷(3) 加 200 L氯仿，振蕩 15 sec ，室溫放置 3 min ，分層；(4) 4 o C，12,000 g，離心 15 min ；(5) 取上清，加 500 L異丙醇，混勻，室溫放置 10 min ；(6) 4 o C，12,000 g，離心 10 min ；(7) 棄上清，加 1 mL75% 乙醇，漂浮洗滌沉淀，振蕩充分；再用100% 乙醇清洗(8) 4 o C，7,500 g ，離心 5 min ；(9) 棄上

2、清，離心，用槍吸取多余液體，放在超凈臺(tái)里干燥后， 加 50 LDEPC水， 80 o C 保存。此操作中所用到的器皿均需經(jīng)過DEPC 滅活 RNA 酶處理。提取的總RNA需經(jīng) RNA 電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。OD 260 值為核酸的吸收值，OD 280 值為蛋白的吸收值， OD 260/280 值在 1.8-2.0 間一般說明該核酸蛋白含量在允許的范圍內(nèi)， 可正常使用；此外還有 OD 230 值為多糖和酚類的吸收值，比較干凈的核酸OD 260/230 值能達(dá)到 2.2 左右。 RNA 濃度計(jì)算公式： 總 RNA 濃度（g/mL）=A 260 ×稀釋倍數(shù)×4

3、0 。-可編輯-精品2 反轉(zhuǎn)錄 /cDNA第一鏈的合成純化 RNA 以去除基因組DNA ，操作按 TaKaRa 公司的 PrimeScriptRTreagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進(jìn)行。其體系為：Total RNA1 g5× gDNA Eraser Buffer2 LgDNA Eraser1 LRNase Free dH 2 O補(bǔ)齊至 10 L條件為： 42 o C，2min ；RNA 純化后，即可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。其體系為：5×PrimeScript Buffer 2（ for Real Time ）4LPrimeScr

4、ipt RT enzyme mix1 LRT Primer Mix1 L上一步的反應(yīng)液10 LRNase Free dH 2 O補(bǔ)齊至 20 L操作條件為：(1) 37 oC 放置 15 min ； (2) 85 o C， 5 sec ； (3) 4 o C 保存。3 PCR按 TaKaRa 公司的 Premix Taq Version 2.0 操作， PCR 反應(yīng)體系如下：-可編輯-精品Premix Taq25 L模板5 L引物 1 (10M)1L引物 2 (10M)1LddH 2O18 LPCR 反應(yīng)條件為： 94 °C預(yù)變性 5min ；94 °C變性 30s ， 5

5、3 °C退火 30s ，72 °C延伸 30s ，循環(huán) 36 次； 72 °C延伸 10min 。PCR 反應(yīng)完畢，取5L反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳（若割膠回收則用 10 L反應(yīng)產(chǎn)物）。4 基因克隆及測(cè)序4.1PCR 產(chǎn)物切膠回收將 PCR 產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察并切下預(yù)期大小的 DNA 片段。使用 TIANGEN 公司的 Universal DNA Purification Kit割膠回收試劑盒進(jìn)行純化，步驟如下：(1) 平衡吸附柱： 向吸附柱 CB2 中（吸附柱放入收集管中） 加入 500 L平衡液 BL， 13,400 

6、15;g 離心 1 min ，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2 重新套回收集管中；(2) 按 100 mg agarose 膠加入 100 L溶液 PC，置于 50 o C 中 10 min 左右，中途混勻幾次，至膠完全融化；(3) 將樣品倒入一個(gè)吸附柱 CB2 中（吸附柱放入收集管中） ，室溫下 13,400×g 離心 1 min ，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2 重新套回收集管中；-可編輯-精品(4) 向吸附柱 CB2 中加入 600 L漂洗液 PW （加乙醇），室溫下 13,400 ×g離心 1 min ，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2 重新套回收集管中；(5)

7、重復(fù)上一步驟；(6) 將吸附柱 CB2 放入收集管中，室溫下 13,400 ×g 離心 2 min ，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；(7) 將柱子套入一新的滅菌 1.5 mL 離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50 L 洗脫緩沖液，室溫放置2 分鐘， 13,400 ×g 室溫離心 2 min ，收集到的洗脫液即為回收的DNA 純化液；(8) 取 5L 的純化液體進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，以檢查純度，并測(cè)量溶液中 DNA 含量。4.2 目的片段與載體連接(1) 膠回收產(chǎn)物與 T 載體連接體系，參考 Takara 公司 pMD18-T 載體的試劑盒說明

8、書。在滅菌的 0.5 mL 離心管中配制如下溶液（ 10 L：）回收 DNA4 LLigation Solution5 LpMD18-T Vector1 L(2) 16 oC 反應(yīng) 30 分鐘，所得產(chǎn)物保存于 4 o C 冰箱備用。4.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli DH5(1) 將 5 L 連接產(chǎn)物加入到 100 LE.coli DH5 感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管混勻內(nèi)容物，冰上靜置 30 min ；(2) 42 oC 水浴熱激轉(zhuǎn)化 90 sec ，立即放回冰上，放置 3 min ；-可編輯-精品(3) 每管加入 500 L LB 培養(yǎng)基（室溫放置）， 37 o C 160-180 rpm振蕩培養(yǎng) 45-60 min，使菌體復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因；(4) 在含有 Amp （ 100 g/mL）的選擇性平板上加入60-100 L 菌液，用無菌涂布棒輕輕涂布均勻后，用Parafilm膜封好；(5) 將培養(yǎng)皿正放， 37 o C 約 50 min ，待液體全部吸收后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng) 10-16 h 。4.4 轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定(1) 用無菌槍頭挑取 LB 平板上 3-5 個(gè)單菌落，分別接種到 3.5 mL LB 液體培養(yǎng)基中（含 100 g/mL Amp ）， 37 o C，16