核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù)

1、核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù)核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù) 第一節(jié) 核酸分析技術(shù)n講述內(nèi)容： 1、核酸電泳 2、雜交技術(shù) 3、PCR技術(shù) 4、基因芯片一、核 酸 電 泳 n（一）DNA的凝膠電泳n凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于2001000bp的片段; 操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離5500bp的片段; 效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對大量的DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析 瓊脂糖凝膠電泳的基本過程n材料：電泳緩沖液（常用TAE或TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）

2、、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴(kuò)散和用于電泳時(shí)間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。 n基本過程：制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時(shí)間后停止電泳 取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果 n注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時(shí)要帶手套注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時(shí)要帶手套不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（，（，W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（分子的有效分離范圍（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.

3、2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2影響DNA在凝膠中遷移速率的因素： n1 DNA分子的大小n2 構(gòu)象n3 凝膠濃度n4 電壓n5 緩沖液瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡過程中 DNA Ladder的形成PCR產(chǎn)物的瓊脂 糖電泳 聚丙烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析特殊的凝膠電泳n倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE）：用于分離分子量102000kb的DNA分子；n鉗位均勻電場電泳（CHEF電泳）：可分離大于107bp的DNA分子 基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要

4、嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外，因?yàn)镽NA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 （二）RNA 電 泳二 核酸雜交技術(shù)n（一）Southern Blotn原理：原理：將待檢測的將待檢測的DNA分子用分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的物標(biāo)記的DNA或或RNA探針

5、進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。的片段及其相對大小。用途：檢測樣品中的用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài)及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。 Southern Blot 操作步驟：操作步驟：DNA 瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交預(yù)雜交 雜交（變性探針

6、）雜交（變性探針） 洗膜洗膜 放射自顯影或顯色放射自顯影或顯色n原理原理：在變性條件下將待檢的在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。n用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。及其含量。 （二）（二）Northern Blot 操作過程操作過程 mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學(xué)發(fā)光（三）探針標(biāo)記技術(shù)（三）探針標(biāo)記技術(shù)n1 標(biāo)

7、記物標(biāo)記物：放射性和非放射性兩種n放射性： n非放射性：生物素生物素、地高辛素、熒光素 n2、標(biāo)記方法、標(biāo)記方法 n（1）切口平移法 n（2）隨機(jī)引物法n（3）末端標(biāo)記法n（4）單鏈DNA探針標(biāo)記n（5）寡核苷酸探針標(biāo)記法 32P、35S和和3H 三 PCR技術(shù)nPCR (Polymerase chain reaction) 是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性退火DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)2530個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。 nDr. Karry Mullis 1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎；目的目的: 用

8、于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。 （一）原理：（一）原理：雙鏈雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈通過高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈DNA 變性變性 與一對寡核苷酸引物（與一對寡核苷酸引物（5， 3）降低溫度退火）降低溫度退火 DNA加熱變性加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為退火退火 適溫延伸適溫延伸5/3引物形成新鏈變成引物形成新鏈變成4條鏈條鏈DNA 延伸延伸 第二輪：變性第二輪：變性退火退火延伸延伸呈指數(shù)增長呈指數(shù)增長 理論值：一輪一倍理論值：一輪一倍 10輪輪 103=1000倍倍 20輪輪 106 30 輪輪 109 理論理論 模板擴(kuò)增模板擴(kuò)增

9、30輪輪 1ng-1g 實(shí)際實(shí)際 模板擴(kuò)增模板擴(kuò)增30輪輪 1ng-10 gn1 Taq DNA聚合酶聚合酶：n 水生棲熱菌水生棲熱菌(thermus aquaticus,Taq)的的DNA聚合酶聚合酶n 53DNA聚合酶活性；聚合酶活性；n 無無35外切酶活性外切酶活性，n 35輪輪0.25%錯(cuò)配錯(cuò)配，與原始模板有差別；與原始模板有差別；n 最適聚合酶最適聚合酶 溫度溫度72，選擇，選擇72延伸延伸n 半衰期：半衰期：92.5 130min n 95 40min n 97.5 56minn 變性溫度：變性溫度：95使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性（二）基本要素

10、（二）基本要素pfu DNA 聚合酶n耐熱n53DNA聚合酶活性聚合酶活性n35外切酶活性n精確度：pfu Taq 但pfu擴(kuò)增效率通常比Taq酶略差n文獻(xiàn)報(bào)道：文獻(xiàn)報(bào)道：Taq+pfu 會起到較好效果會起到較好效果n n 2 .引物n 人工合成短寡核苷酸20bp-25bpTm=55-60，n Tm值要相近，每條10-50pmol /100l n 設(shè)計(jì)原則： （1）靠近5上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同n 3下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補(bǔ)，與負(fù)鏈相同n 正鏈5 3 上游Primern 下游Primer 負(fù)鏈 3 5n 例如：n IL-3正鏈n 5GCTCCATGACCCAG- GCG

11、ATCTTTTGAGTCCAA 3n 負(fù)鏈3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5n 上游： 與其相同n 下游： 先寫出相應(yīng)負(fù)鏈35然后倒過來53n 所以負(fù)鏈Primer：5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3（2）Primer 本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列 形成loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu) 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意減少Primer間互補(bǔ)序列 導(dǎo)致2個(gè)Primer形成dimer 一般不要超過3個(gè)互補(bǔ)bp 如：CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC n n n 修飾修飾n 如：32P、生物素

12、、熒光素，不影響其效果n 突變：突變：n AGCTCCATGACCCAG n 5CGCTCCATGACCCAG 3n 注意：絕不可以在注意：絕不可以在3端進(jìn)行上述改造端進(jìn)行上述改造n DNA聚合酶是53聚合，若3端改造不能互補(bǔ)不能延伸n （4）Primer 5未端可修飾、突變:n （5 5）primer 5primer 5端增加堿基端增加堿基n n n 內(nèi)切酶識別點(diǎn)內(nèi)切酶識別點(diǎn)：n （G）GAATTC GCTCCATGACCCAG n 保護(hù)bpn 對PCR產(chǎn)物cloning有很大好處n 便于內(nèi)切酶消化，不同內(nèi)切酶需保護(hù)bP數(shù)量不同n EcoRI 1 BglII 2-3n XbaI 2-3 Hi

13、nd 3n BamHI 2-3 PstI 4n XhoI 4 NotI 10n 如果所用保護(hù)bp數(shù)量不合適影響內(nèi)切酶消化影響下步克隆n 未切開，連接不上n ATG起始密碼TAA、TAG、TGA終止密碼如：可溶性受體的表達(dá)，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。 3. 3.模板模板： 可選可選：DNA mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA DNA包括： 質(zhì)粒 噬菌體 染色體DNA 較小 較大 目的gene是單拷貝 變性較易 變性較難 非常大，變性難 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意： 防止交叉污染4.dNTP4.dNTP：四種脫氧核苷酸，四種脫氧核苷酸，基本原料基本原料

14、終濃度：終濃度：5050 M M 注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長會失效注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長會失效 5.Mg2+ TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要Mg2+ 不同的酶需不同Mg2+ Taq：較少，Mg2+ 對反應(yīng)影響很大，0.5-1.5mM終濃度 pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍 外界影響外界影響： EDTA鰲合Mg2+ 選較低濃度TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+ 結(jié)合， 降低Mg2+ 有效濃度。 如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的 MgMg2+2+濃度濃

15、度 （1）變性溫度：94-95 Templete：GC比例高、長度很長，則變性T （2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于Tm值：Tm退火T； Tm退火T若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3）延伸：500nt-1min 500nt3min一般：4060sec 6.溫度和時(shí)間：（三）PCR技術(shù)的應(yīng)用n1. 基因檢測：n2. 基因克隆化n3. DNA突變n4. DNA序列分析 四、基因芯片四、基因芯片n利用核酸雜交的原理，應(yīng)用于DNA、RNA的研究背景資料背景資料基因芯片（ ）就是利用點(diǎn)樣機(jī)等機(jī)械裝置，在玻璃等支持物表面整齊地點(diǎn)上高密度的、成千上萬個(gè)“點(diǎn)”，每個(gè)“點(diǎn)”含有可與一種基因雜交的一

16、條探針。由于芯片上有序地排列著探針，因此也被稱為微陣列（）。在芯片上滴加樣品后，在合適的條件下，樣品中含有的各種核酸片段（或）就與相應(yīng)的探針雜交。由于核酸片段上已標(biāo)記有熒光素，激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度就與樣品中所含有的相應(yīng)核酸片段的量成正比，也就代表該基因的表達(dá)量。經(jīng)激光共聚焦掃描儀等裝置掃描后，所獲得的信息經(jīng)專用軟件分析處理，即可獲得成千上萬種基因的表達(dá)情況。正因?yàn)檫@種特點(diǎn)，基因芯片技術(shù)已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。 操作流程操作流程 n（1）探針的設(shè)計(jì)、合成與芯片的制作（商品化產(chǎn)品）；n（2）靶基因樣品的制備；n 靶基因的制備：RT-PCR （設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組）n 標(biāo)記方法：分別進(jìn)行熒光素

17、標(biāo)記如：Cy3和Cy5n（3）生化雜交反應(yīng)；與常規(guī)的分子雜交過程基本相似n 封閉 預(yù)雜交 雜交 洗脫n（4）雜交信號的檢測與結(jié)果的分析n 激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)收集熒光信號，計(jì)算機(jī)分析n 基因芯片的應(yīng)用n用于基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測、基因組分析和后基因組研究 舉例：美國斯坦福大學(xué)Davis等用PCR法從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中得到了1046種cDNA片段，制成芯片，然后與熱處理的T淋巴細(xì)胞和未處理的T細(xì)胞種提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄出的單鏈cDNA片段雜交，經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表達(dá)的基因，其中11個(gè)是被熱誘導(dǎo)的，6個(gè)是被熱抑制的。經(jīng)序列分析證實(shí)，其中3個(gè)是未報(bào)導(dǎo)的新基因。第二節(jié)

18、蛋白質(zhì)分析技術(shù)n講述內(nèi)容：一、一、Western Blot 二、二、ELISA三、免疫熒光技術(shù)三、免疫熒光技術(shù)四、免疫組織化學(xué)技術(shù)四、免疫組織化學(xué)技術(shù) 五、五、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)一 Western Blotn1 1 原理原理：n將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密

19、度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。 2 操作過程nSDS-PAGE電泳電泳 轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）或硝酸纖維素膜）n封閉封閉 一抗一抗 洗滌洗滌 酶標(biāo)二抗反應(yīng)酶標(biāo)二抗反應(yīng)n洗滌洗滌 顯色或化學(xué)發(fā)光顯影顯色或化學(xué)發(fā)光顯影 Hours 0 4 8 16 Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed

20、in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control 0h 4h 8h 16h Western Blot analysis of cytochrome C release. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10M gossy

21、pol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. Cyto-CX-Protein3 注意的問題n（1） 蛋白質(zhì)電泳n常用SDS-PAGE：單一亞基組成的蛋白質(zhì)n非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)nTris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒

22、性，操作時(shí)要戴手套（2）轉(zhuǎn)膜n戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫钄噢D(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致n以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜1530min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。n方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極n排去濾紙、膠和膜間的氣泡。n電轉(zhuǎn)時(shí)間：100V 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇n轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率n膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置（3）封閉n用5脫脂奶粉或3BSAn（含（含0.1Tween20 TBS或或PBS配制）配制）n時(shí)間：室溫2h或4C過夜（4）顯色或顯

23、影n顯色n辣根過氧化物酶：底物為DABn堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBTn化學(xué)發(fā)光顯影化學(xué)發(fā)光顯影n最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）n注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的的TBS或或PBS洗滌一次洗滌一次n 曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定（5）膜的再利用n化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer洗滌后（洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2SDS和100mm的 2ME ） 用不同的一抗進(jìn)行雜交，檢測其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用

24、34次。n堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交n 1 原理：nELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。 二

25、、ELISAELISA 常用的酶和底物常用的酶和底物n辣根過氧化物酶，底物為辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃色深桔黃色 ，檢測波長，檢測波長492nmn TMB， 藍(lán)綠色，檢測波長藍(lán)綠色，檢測波長450nm 堿性磷酸酶，底物為堿性磷酸酶，底物為PNPP（對消基苯磷酸酯）（對消基苯磷酸酯）, 黃色黃色 檢測波長檢測波長405nm ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間各步驟的反應(yīng)時(shí)間 包被：包被：2436h，蛋白濃度為，蛋白濃度為15ug/ml 封閉：封閉：37C 2h 或或4C過夜（過夜（3BSA） 樣本反應(yīng)時(shí)間：樣本反應(yīng)時(shí)間：37C 45min-1h 酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間：酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間： 37C

26、45min-1h 顯色時(shí)間：顯色時(shí)間：15min(避光）避光） 設(shè)對照設(shè)對照 可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆每梢砸淮伟欢鄩K板，凍存?zhèn)溆?2 類型（1）間接法測抗體）間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗 體，檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。方法：方法： 抗原包被 封閉 待檢抗體 洗滌 酶標(biāo)二抗 洗滌 顯色反應(yīng) 終止反應(yīng) ELISA Reader檢測 OD值(2) 雙抗體夾心法測抗原n是檢測抗原最常用的方法。是檢測抗原最常用的方法。 只

27、要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。固相載體和制備酶結(jié)合物。 常用的組合：常用的組合：單克隆抗體多克隆抗體單克隆抗體多克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體 后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。酶結(jié)合物。 用途：測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用用途：測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用 于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成于測定半抗

28、原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成 兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測。兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測。 n雙抗體夾心法測抗原的方法：雙抗體夾心法測抗原的方法： 捕獲抗體包被 封閉（3BSA） 待測抗原 洗滌（含0.1Tween的PBS) 酶標(biāo)單抗或多抗 洗滌 顯色 檢測(3)競爭法測抗原n1）抗體固相測抗原）抗體固相測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。n其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。n方法：方法：抗體包被 封閉 同時(shí)加入

29、待測抗原和酶標(biāo)抗原n 洗滌 酶底物 顯色 ELISA reader檢測n2）抗原固相測抗原其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。方法: a: 抗原包被96孔板； b:封閉; c: 待測抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間； d: 加入96孔板 e: 洗滌 f：加入酶標(biāo)二抗 g：洗滌 h：顯色和檢測如臨床血清樣本的檢測以及細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測如臨床血清樣本的檢測以及細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測（4）IgM抗體的檢測抗體的檢測1 1）間接法）間接法： 間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗

30、體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。方法方法 a: 抗原包被96孔酶標(biāo)板； b:封閉; c: 待測血清與A蛋白反應(yīng)一定時(shí)間后離心 d: 吸取上清液加入96孔酶標(biāo)板 e: 洗滌 f：加入酶標(biāo)抗IgM的抗體 g：洗滌 h：顯色和檢測2）捕獲包被法（夾心法）捕獲包被法（夾心法）先用抗人IgM抗體包被ELISA板，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（包括針對抗原特異性的IgM和非特異性的IgM)。然后加入相應(yīng)抗原，

31、繼而加入針對抗原特異的酶標(biāo)抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標(biāo)本中的IgM含量成正相關(guān)。方法： a: 抗人IgM抗體包被96孔酶標(biāo)板； b:封閉; c: 加入待測血清； d: 洗滌96孔酶標(biāo)板 e: 加入相應(yīng)抗原 f：加入抗原特異的酶標(biāo)抗體 g：洗滌 h：顯色和檢測（5） ABS-ELISA技術(shù) （Avidin Biotin system-ELISA原理原理親和素是一種分子量是60，000的堿性蛋白，由四個(gè)相同亞基組成，每個(gè)亞基有一個(gè)生物素分子結(jié)合點(diǎn)。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種材料所標(biāo)記，成為一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素化抗體可捕獲多個(gè)親和素，后者再與酶結(jié)合，加

32、入底物后，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這一系統(tǒng)可以大大提高ELISA的靈敏度。操作過程：操作過程：抗原包被 封閉 待檢標(biāo)本 生物素化抗體 洗滌 酶標(biāo)記親和素 洗滌 加底物顯色和檢測 三 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) n利用某些熒光素，如FITC、R-PE等通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測未知抗原或相應(yīng)配體。（一）細(xì)胞膜蛋白分子的檢測n原理：n細(xì)胞膜表面的抗原或受體可特異地與相應(yīng)的抗體或配體結(jié)合，將針對細(xì)胞表面抗原的抗體或配體用不同的熒光素標(biāo)記，根據(jù)不同熒光物質(zhì)的最大激發(fā)和發(fā)射波

33、長的不同，即可準(zhǔn)確定量每種熒光物質(zhì)的強(qiáng)度，從而推出相應(yīng)細(xì)胞表面抗原表達(dá)量n1 直接法直接法：細(xì)胞熒光素標(biāo)記的抗CD分子的抗體 4C反應(yīng)30-60min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析。n2 間接法間接法：細(xì)胞抗CD分子的抗體 4C 反應(yīng)30-60min 熒光素標(biāo)記的二抗 4C 反應(yīng)30-60min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析懸浮細(xì)胞：用PBS洗二次后再做染色貼壁細(xì)胞：先用胰酶消化成懸浮細(xì)胞再染色1 細(xì)胞膜細(xì)胞膜CD分子的檢測分子的檢測 2 Annexin V檢測技術(shù) (檢測細(xì)胞凋亡的一個(gè)常規(guī)指標(biāo))n磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋

34、亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 原理原理樣本處理和染色方法1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.51106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5u

35、l，避光反應(yīng)5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。3 爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。 （二）細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的檢測等。操作過程：操作過程：（1）直接法： 細(xì)胞 3多聚甲醛固定和 滲透化 封閉 熒光素標(biāo)記的 抗體 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析 （2）間接法： 細(xì)胞 3多聚甲醛固定和

36、滲透化 封閉 針對蛋白的特異 抗體 洗滌 熒光素標(biāo)記的二抗 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析 凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 nTFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)

37、生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。n1 懸浮細(xì)胞的染色：懸浮細(xì)胞的染色：（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.51106），PBS洗2次， （2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm10min。（3）加入PBS-T溶液，37C孵育15min，PBS洗2次，n（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。（5）加入 FITC標(biāo)記的TFAR19單抗，4C反應(yīng)30min（6）熒光細(xì)胞洗液洗2次，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察T

38、FAR19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。2：貼壁細(xì)胞的原位染色：貼壁細(xì)胞的原位染色（1） 貼壁生長的對數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到50%80%滿時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。 （2） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。 （3） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ul）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。n原理：n是指酶標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的成色反應(yīng)，對相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位和定量測定的一項(xiàng)技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、

39、組織化學(xué)的可見性巧妙的結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等），并可在原位顯示相應(yīng)的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物。四免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組化染色技術(shù)的分類n免疫熒光法（Immunofluorescence technique）n免疫酶法（Immunoperoxidase technique）n免疫金銀法（Immunogold technique）nABC法（ Avidin-Biotin Complex）五五 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)1 GST融合蛋白進(jìn)行融

40、合蛋白進(jìn)行Pulldow實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) （1）原理）原理 細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。 兩種應(yīng)用：兩種應(yīng)用： 1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用 2）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白

41、質(zhì)間可疑的相互作用 （2）方法：）方法： 1） GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a, 單一明確的重組蛋白；b，細(xì)胞裂解蛋白混合液；c, 體外翻譯cDNA表達(dá)得到的未知蛋白） 2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng) 4C 2h 3）離心棄上清 4）沉淀加入2 蛋白Loading Buffer煮沸，離心 5）取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳， 6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確 定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做Western Blot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 該實(shí)驗(yàn)設(shè)立GST對照，反應(yīng)均在4C進(jìn)行GST-Pulldown Assay2 免疫共沉淀n（1）原理）原理n當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在