SummerResearch

1、Summer ResearchSummer Research清華大學清華大學生命科學系生命科學系04級級孫敏瑜孫敏瑜891645Introduction2002年暑假我來到位於高雄的國立中山大學-卓忠隆老師的分子生物實驗室。卓老師讓我跟著他的得意門生-陳錦苡學長做一些簡單的分生實驗，以練習基本技術(shù)為主。錦苡學長的研究主題是:利用抑制性扣減雜交(Suppressor Subtractive hybridization，SSH)找出調(diào)控大鼠腦幹死亡過程的基因。學長利用SSH建構(gòu)了相關(guān)基因的cDNA library。而我所要做的就是將這些gene cloned，確定insert是正接或反接，然後送定

2、序，可供後續(xù)研究用。我總共cloned了兩個gene: GMF-及s100。原料:網(wǎng)狀腹外側(cè)核（rostral ventrolateral medulla（RVLM )cDNA 實驗過程實驗過程 (1)以RVLM的cDNA ，加入欲clone gene的primer(f&r)， 再加入Taq polymerase ，run PCR。(2)Run electrophoresis，check有產(chǎn)物。(3)使用kit來purify PCR product。(4)以分光光度計來測量DNA的濃度及純度。(5)Run electrophoresis，與marker對照確定是我要的DNA片段。(6)將這些純

3、化的產(chǎn)物保存在-200C 冰箱。實驗過程實驗過程(7)接下來要準備transformation了， 所以我要自己製作agar plate(with amp & w/o amp) 還有自己製作competent cell (來源: e.coli JM-109) 。(8)Ligation: 將純化的PCR產(chǎn)物與本實驗所用的pGEMT easy vector進行l(wèi)igation 。(9)Transformation (10)從plate上挑菌 (藍白篩選法)挑白色菌，種到含有LB medium的試管中，培養(yǎng)16-20hr。(11)隔日，抽plasmid ，以EcoR I切3hr，再以electrop

4、horesis確定是否有成功insert。實驗過程實驗過程(12)成功insert的那幾管菌，再重新培養(yǎng)到新的試管中。(13)以kit 抽plasmid ，此時抽出的plasmid較純， 送定序check是正接or反接。(14)本來想利用insert上的restriction enzyme切位與vector上的切位，使用適當?shù)膔estriction enzyme來切， 可判斷是正接或反接。但上網(wǎng)查了一下GMF-B及s100上的切位，發(fā)現(xiàn)所需要的enzyme實驗室沒有。所以還是送定序來確定是正接或反接(因為兩者的序列可在網(wǎng)上查到) 。 實驗流程實驗流程製製 作作 c co om m p pe e

5、t te en nt t c ce el ll l送送 定定 序序重重 新新 培培 養(yǎng)養(yǎng) 菌菌用用 k ki it t抽抽 p pl la as sm m i id d用用 r re es st tr ri ic ct ti io on n e en nz zy ym m e e切切 割割e el le ec ct tr ro op ph ho or re es si is s確確 定定 有有 成成 功功 i in ns se er rt t抽抽 p pl la as sm m i id d藍藍 白白 篩篩 選選挑挑 菌菌種種 菌菌T T r ra an ns sf fo or rm m a

6、at ti io on n將將 P PC C R R 產(chǎn)產(chǎn) 物物 進進 行行 l li ig ga at ti io on n用用 k ki it t純純 化化 P PC C R R 產(chǎn)產(chǎn) 物物以以 分分 光光 光光 度度 計計 測測 D D N N A A 的的 濃濃 度度 及及 純純 度度- -2 20 0C C 保保 存存e el le ec ct tr ro op ph ho or re es si is sc ch he ec ck k有有 產(chǎn)產(chǎn) 物物R R V V L L M M ( (c cD D N N A A ) )P P C C R R放放 大大 G G M M F F-

7、-B B 片片 段段實驗結(jié)果實驗結(jié)果1. GMF-(1)PCR產(chǎn)物由電泳圖來看量還算夠?qū)嶒灲Y(jié)果(2)Transformation效率不高， 可能是我做的competent cell效率不夠強， 或是ligation效果不夠好 。(3)restriction enzyme切割結(jié)果:實驗結(jié)果大部分都有成功insert ， 我從這些成功的insert中挑了四管，再純化plasmid 。(4)送定序(5)定序結(jié)果:四個recombined plasmid都是正接的 定序圖定序圖實驗結(jié)果實驗結(jié)果2. s100(1)PCR產(chǎn)物由電泳圖來看量還算夠?qū)嶒灲Y(jié)果(2)Transformation效率不高， 可能是

8、我做的competent cell效率不夠強， 或是ligation效果不夠好。 (3)restriction enzyme切割結(jié)果:實驗結(jié)果實驗結(jié)果相當奇怪!切出的片段有的不一樣長，只好將plasmid再做一次PCR ，確定有insert到正確片段(學長教的) 。 實驗結(jié)果由圖看no.3是錯的， no.1有兩條band也怪怪的，所以只有2.4.5.6比較有可能成功。學長說no.1的情形可能是最初PCR時，溫度沒有設(shè)好，所以primer不專一的接到別的片段，所以純化時也連這些片段一起純化。 ligation後產(chǎn)生兩種recombined DNA ，使transformation後有兩種菌產(chǎn)生:含有S100 及另一種insert的菌。為了確定，我又重挑了四管菌:no9-12 。實驗結(jié)果實驗結(jié)果抽plasmid切割後，與之前的no.2切割片段及plasmid PCR產(chǎn)物比較，發(fā)現(xiàn)竟然不一樣長可見果然有insert到錯誤的DNA片段實驗結(jié)果因為後來純化plasmid的kit沒了， 而且暑假也結(jié)束了， 所以來不及將s100送定序 -交給其他學長姐完成 。感想 這是我第一次進入實驗