6代謝組學技術(shù)及其在中藥研究中的應用PPT課件

1、LOGO代謝組學技術(shù)及其在代謝組學技術(shù)及其在中藥研究中的應用中藥研究中的應用Wuhan university武漢大學武漢大學 周本宏周本宏 LOGO 代謝組學代謝組學 概概 念念n 是生物體或細胞在外源性物質(zhì)或病理生理刺激和遺是生物體或細胞在外源性物質(zhì)或病理生理刺激和遺傳因素改變的條件下，傳因素改變的條件下，內(nèi)源性代謝物內(nèi)源性代謝物會發(fā)生變化，會發(fā)生變化，利用現(xiàn)代分析方法對體液、細胞或組織中的利用現(xiàn)代分析方法對體液、細胞或組織中的所有所有低低分子量分子量內(nèi)源性代謝物組內(nèi)源性代謝物組（endogenousmetabolitesendogenousmetabolites）進行定性、定量分析，定量檢

2、測其代謝變化，通過進行定性、定量分析，定量檢測其代謝變化，通過測定整個機體的系統(tǒng)測定整個機體的系統(tǒng)代謝圖譜代謝圖譜來探討基因功能調(diào)控來探討基因功能調(diào)控機制的學科機制的學科 Wuhan universityLOGO吸收吸收分布分布代謝代謝排泄排泄內(nèi)源性代謝物改變內(nèi)源性代謝物改變藥物藥物外源性代謝產(chǎn)物外源性代謝產(chǎn)物內(nèi)源性代謝產(chǎn)物是基因表達的終產(chǎn)物，代謝組學所內(nèi)源性代謝產(chǎn)物是基因表達的終產(chǎn)物，代謝組學所關(guān)注的是相對分子質(zhì)量為關(guān)注的是相對分子質(zhì)量為1,0001,000以下的小分子物質(zhì)以下的小分子物質(zhì)Wuhan university病理生理的變化病理生理的變化LOGO歷史沿革歷史沿革n 英國帝國理工大學

3、英國帝國理工大學J.K NicholsonJ.K Nicholson教授的研究小組教授的研究小組利用核磁共振利用核磁共振( (NMRNMR) )技術(shù)分析大鼠的尿液技術(shù)分析大鼠的尿液, , 并于并于19991999年年J.K NicholsonJ.K Nicholson教授等教授等3 3名科研人員共同發(fā)名科研人員共同發(fā)表了一篇表了一篇“代謝組學代謝組學”研究論文，一個新的學科研究論文，一個新的學科從此誕生，從此誕生，NicholsonNicholson教授也由于其在代謝組學發(fā)教授也由于其在代謝組學發(fā)展中的開拓性的貢獻，而被譽為展中的開拓性的貢獻，而被譽為“國際代謝組學國際代謝組學之父之父”Wuh

4、an universityLOGO歷史沿革歷史沿革 n 是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄物組學、蛋白質(zhì)組學之后的一門新型學科，是系統(tǒng)是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄物組學、蛋白質(zhì)組學之后的一門新型學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分生物學的重要組成部分n 系統(tǒng)生物學（系統(tǒng)生物學（system biologysystem biology）研究的四個層次：）研究的四個層次： Wuhan universityLOGO系系統(tǒng)統(tǒng)生生物物學學 基因與蛋白質(zhì)的表達緊密相連基因與蛋白質(zhì)的表達緊密相連, ,代謝代謝物則更多地反映了細胞所處的環(huán)境。正物則更多地反映了細胞所處的環(huán)境。正如如Billy DavidBilly David所言所言:“:

5、“基因組學和蛋白基因組學和蛋白質(zhì)組學告訴你可能發(fā)生什么質(zhì)組學告訴你可能發(fā)生什么, ,而代謝組學而代謝組學則告訴你已經(jīng)發(fā)生了什么則告訴你已經(jīng)發(fā)生了什么” 歷史沿革歷史沿革Wuhan universityLOGO歷史沿革歷史沿革 n 19991999年年NicholsonNicholson首次提出了以首次提出了以NMRNMR分析為主的代謝組學研究模分析為主的代謝組學研究模式并聯(lián)合國際六大醫(yī)藥公司式并聯(lián)合國際六大醫(yī)藥公司（Bristol-Meyers-Bristol-Meyers-Squibb,EliSquibb,Eli lilly,Hoffmann-laRoche,NovoNordisklilly

6、,Hoffmann-laRoche,NovoNordisk, , Pfizer,PharmaciaPfizer,Pharmacia）英國帝國學院（英國帝國學院（Imperial Imperial College,LondonCollege,London）面對風險的挑戰(zhàn)，）面對風險的挑戰(zhàn)，于于20012001年組織并公布了一個研究計劃年組織并公布了一個研究計劃COMETCOMET（Consortium for Consortium for MetabonomicMetabonomic Toxicology Toxicology）, ,應用代謝物組學評價藥物毒性，應用代謝物組學評價藥物毒性，進行候

7、選藥物的臨床前毒性篩選，進而對廣泛模型化合物評價進行候選藥物的臨床前毒性篩選，進而對廣泛模型化合物評價和安全性預測，和安全性預測，以縮短藥物開發(fā)的時間，減少損失以縮短藥物開發(fā)的時間，減少損失.3.3年中對大年中對大鼠和小鼠的尿液用鼠和小鼠的尿液用NMRNMR分析研究了分析研究了150150個肝腎毒性模型個肝腎毒性模型 Wuhan universityLOGO歷史沿革歷史沿革n 自自20022002年第一屆國際植物代謝組學大會在荷蘭瓦赫寧根召年第一屆國際植物代謝組學大會在荷蘭瓦赫寧根召開以來，植物代謝組學分析技術(shù)和方法發(fā)展迅速已開始應開以來，植物代謝組學分析技術(shù)和方法發(fā)展迅速已開始應用于植物科學

8、研究、生物安全性評價等多個領(lǐng)域，在基因用于植物科學研究、生物安全性評價等多個領(lǐng)域，在基因功能研究、代謝途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機理的解析等方面發(fā)功能研究、代謝途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機理的解析等方面發(fā)揮重要作用揮重要作用n 我國植物代謝組學的研究于我國植物代謝組學的研究于20052005年前后開始起步，目前已年前后開始起步，目前已形成較好的發(fā)展趨勢形成較好的發(fā)展趨勢Wuhan universityLOGO代謝組學研究的優(yōu)勢代謝組學研究的優(yōu)勢 與研究蛋白組或基因組相比，研究代謝組具有許多優(yōu)勢：與研究蛋白組或基因組相比，研究代謝組具有許多優(yōu)勢： (1)(1)生物體的小分子代謝產(chǎn)物所構(gòu)成的代謝組要比轉(zhuǎn)錄物組生物

9、體的小分子代謝產(chǎn)物所構(gòu)成的代謝組要比轉(zhuǎn)錄物組蛋白組簡單得多蛋白組簡單得多( (例如釀酒酵母有例如釀酒酵母有6 0006 000多個基因，但代謝物多個基因，但代謝物僅有僅有600600個個) )，那么分析代謝組就降低了樣本的復雜性；，那么分析代謝組就降低了樣本的復雜性； (2)(2)對多數(shù)小分子內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的作用及其所在代謝通路對多數(shù)小分子內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的作用及其所在代謝通路代謝調(diào)控已有相當?shù)恼J識，而目前對基因功能與調(diào)控的認識代謝調(diào)控已有相當?shù)恼J識，而目前對基因功能與調(diào)控的認識仍相當有限仍相當有限Wuhan universityLOGO代謝組學研究的優(yōu)勢代謝組學研究的優(yōu)勢 (3)(3)代謝組是

10、基因功能活動的終點。代謝控制理論和實驗證代謝組是基因功能活動的終點。代謝控制理論和實驗證明在一個生化反應中，雖然酶的濃度和代謝通量不會發(fā)生明在一個生化反應中，雖然酶的濃度和代謝通量不會發(fā)生重大變化，但是代謝物的濃度會發(fā)生很大變化，因此針對重大變化，但是代謝物的濃度會發(fā)生很大變化，因此針對代謝變化重大的代謝物進行分析更加直觀，也更加敏感代謝變化重大的代謝物進行分析更加直觀，也更加敏感 代謝組是基因表達的下游產(chǎn)物，所以它更能正確地反映細代謝組是基因表達的下游產(chǎn)物，所以它更能正確地反映細胞的功能水平，與蛋白組或基因組相比，代謝組具有終點胞的功能水平，與蛋白組或基因組相比，代謝組具有終點放大的特征。研

11、究表明代謝通量不僅受基因表達控制，而放大的特征。研究表明代謝通量不僅受基因表達控制，而且還受環(huán)境的調(diào)節(jié)，因此，測量下游產(chǎn)物代謝物較為合適且還受環(huán)境的調(diào)節(jié)，因此，測量下游產(chǎn)物代謝物較為合適從這一角度分析，代謝組包含的信息量要大于基因組、蛋從這一角度分析，代謝組包含的信息量要大于基因組、蛋白組學白組學Wuhan universityLOGO代謝組學研究的優(yōu)勢代謝組學研究的優(yōu)勢 (4)(4)代謝組變化揭示的是系列關(guān)聯(lián)代謝組變化揭示的是系列關(guān)聯(lián)生物標記物生物標記物(biomarker)(biomarker)的綜合差異，要比傳統(tǒng)依賴單一標志物的診斷方法具有更的綜合差異，要比傳統(tǒng)依賴單一標志物的診斷方法具

12、有更高的準確性，而且其最小限度的侵入性以及時空動態(tài)性，高的準確性，而且其最小限度的侵入性以及時空動態(tài)性，是基因組和蛋白組學研究所無法比擬的。是基因組和蛋白組學研究所無法比擬的。 (5)(5)代謝物譜在不同生物樣本中基本上都是一樣的，再加代謝物譜在不同生物樣本中基本上都是一樣的，再加上其檢測技術(shù)的多樣性，代謝組學的研究具有較好的便利上其檢測技術(shù)的多樣性，代謝組學的研究具有較好的便利性性Wuhan universityLOGO代謝組學研究的特點代謝組學研究的特點代謝組學作為一門新興學科，概括起來具有以下特點代謝組學作為一門新興學科，概括起來具有以下特點: : 對機體損傷小，其檢測的體液主要是尿液與

13、血液；對機體損傷小，其檢測的體液主要是尿液與血液； 信息量大，代謝組學能夠提供整個機體功能統(tǒng)一性信息；信息量大，代謝組學能夠提供整個機體功能統(tǒng)一性信息； 檢測更容易，基因和蛋白質(zhì)表達的有效的微量變化會在代檢測更容易，基因和蛋白質(zhì)表達的有效的微量變化會在代謝物上得到放大；謝物上得到放大； 無需特征化的數(shù)據(jù)庫；無需特征化的數(shù)據(jù)庫； 檢測物種類少，代謝物的種類數(shù)遠遠小于基因和蛋白數(shù)目檢測物種類少，代謝物的種類數(shù)遠遠小于基因和蛋白數(shù)目 代謝物產(chǎn)物具有通用性；代謝物產(chǎn)物具有通用性； 能夠反映生理病理狀態(tài)能夠反映生理病理狀態(tài)Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 代謝組學研究步驟包括：代

14、謝組學研究步驟包括：樣品采集與制備；樣品采集與制備；樣品分析與鑒定；樣品分析與鑒定；數(shù)據(jù)處理與分析；數(shù)據(jù)處理與分析；生物標志物（生物標志物（MarkersMarkers）分析）分析 Wuhan universityLOGOWuhan universityLOGO研究方法研究方法 樣品采集與制備：樣品采集與制備： 采集后的樣品需首先進行預處理，而且整個預處理過程應盡采集后的樣品需首先進行預處理，而且整個預處理過程應盡可能保留和體現(xiàn)樣品中完整的代謝物組分信息?？赡鼙Ａ艉腕w現(xiàn)樣品中完整的代謝物組分信息。 組織樣品取樣后，由于酶活性和氧化過程的繼續(xù)，會引起代組織樣品取樣后，由于酶活性和氧化過程的繼續(xù)，

15、會引起代謝物的生成和改變，故樣品需即時用謝物的生成和改變，故樣品需即時用液氮冷凍，低溫（液氮冷凍，低溫（- -8080）貯存）貯存。血和尿樣也應在。血和尿樣也應在-80-80保存，尿樣中還要加疊保存，尿樣中還要加疊氮化鈉抑菌氮化鈉抑菌Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 尿樣或稀釋的尿樣可直接進樣，優(yōu)點是在樣品制備時，代尿樣或稀釋的尿樣可直接進樣，優(yōu)點是在樣品制備時，代謝物沒有損傷，高通量。缺點是直接用謝物沒有損傷，高通量。缺點是直接用ESI/MSESI/MS分析時，鹽分析時，鹽類有抑制作用（代謝物之間也會相互抑制），在類有抑制作用（代謝物之間也會相互抑制），在ESIESI

16、過程中過程中生成加合物，不揮發(fā)物的積累會降低儀器性能。生成加合物，不揮發(fā)物的積累會降低儀器性能。 血液和尿樣常用甲醇、乙腈或混合溶劑沉淀蛋白，離心后血液和尿樣常用甲醇、乙腈或混合溶劑沉淀蛋白，離心后取上清液進行分析或除去溶劑后，用取上清液進行分析或除去溶劑后，用LCLC流動相溶解后分析流動相溶解后分析 溶劑萃取應用得最早，冷凍的組織樣品常用溶劑萃取，樣溶劑萃取應用得最早，冷凍的組織樣品常用溶劑萃取，樣品需要在冷凍情況下粉碎，選用極性與非極性溶劑的結(jié)合品需要在冷凍情況下粉碎，選用極性與非極性溶劑的結(jié)合如甲醇如甲醇/ /氯仿，可形成雙相，分別對水溶性及脂溶性相進行氯仿，可形成雙相，分別對水溶性及脂

17、溶性相進行分析分析Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 樣品分析與鑒定：樣品分析與鑒定： 近年來，各種分離分析手段如色譜、質(zhì)譜、核磁共振近年來，各種分離分析手段如色譜、質(zhì)譜、核磁共振（NMRNMR）、毛細管電泳、紅外光譜等及其聯(lián)用技術(shù)都應用于）、毛細管電泳、紅外光譜等及其聯(lián)用技術(shù)都應用于代謝組學的研究中，其中最常用的分析技術(shù)是代謝組學的研究中，其中最常用的分析技術(shù)是NMRNMR技術(shù)和技術(shù)和GC-GC-MSMS、LC-MSLC-MS等各種聯(lián)用技術(shù)。等各種聯(lián)用技術(shù)。NMRNMR方法具有無損傷性，無偏向方法具有無損傷性，無偏向性等特點，但其靈敏度較低；性等特點，但其靈敏度較低；G

18、C-MSGC-MS方法具有較高的分辨率方法具有較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有標準譜圖庫可以對照，但對于揮發(fā)性和檢測靈敏度，并且有標準譜圖庫可以對照，但對于揮發(fā)性較低的代謝產(chǎn)物需要進行衍生化處理，且預處理過程相對繁較低的代謝產(chǎn)物需要進行衍生化處理，且預處理過程相對繁瑣；瑣；LC-MSLC-MS方法具有良好的客觀性、選擇性和分辨率，避免方法具有良好的客觀性、選擇性和分辨率，避免了了GC-MSGC-MS中衍生化等繁瑣的預處理過程中衍生化等繁瑣的預處理過程Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 數(shù)據(jù)處理與分析：數(shù)據(jù)處理與分析： 代謝組學是通過數(shù)據(jù)引導的一門學科，數(shù)據(jù)處理與分代謝組學

19、是通過數(shù)據(jù)引導的一門學科，數(shù)據(jù)處理與分析技術(shù)在代謝組學研究中具有至關(guān)重要的作用。這就析技術(shù)在代謝組學研究中具有至關(guān)重要的作用。這就要求充分運用要求充分運用化學計量學理論和多元統(tǒng)計分析化學計量學理論和多元統(tǒng)計分析新方法新方法對采集的對采集的多維海量原始數(shù)據(jù)多維海量原始數(shù)據(jù)進行壓縮降維和歸類以實進行壓縮降維和歸類以實現(xiàn)從大量的原始數(shù)據(jù)中挖掘出隱含其中的有效信息，現(xiàn)從大量的原始數(shù)據(jù)中挖掘出隱含其中的有效信息，最終實現(xiàn)代謝模式的正確識別最終實現(xiàn)代謝模式的正確識別 Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 數(shù)據(jù)處理與分析數(shù)據(jù)處理與分析 模式識別技術(shù)主要分為模式識別技術(shù)主要分為2 2大類：

20、非監(jiān)督（大類：非監(jiān)督（un-supervisedun-supervised）學習方）學習方法和有監(jiān)督（法和有監(jiān)督（supervisedsupervised）學習方法。非監(jiān)督學習方法主要適用）學習方法。非監(jiān)督學習方法主要適用于在不具備任何相關(guān)背景知識的情況下，進行生物樣本的類別判于在不具備任何相關(guān)背景知識的情況下，進行生物樣本的類別判斷和生物標志物識別。常用的方法有斷和生物標志物識別。常用的方法有主成分分析法（主成分分析法（PCAPCA）、）、非非線性映射（線性映射（NLMNLM）、簇類分析（）、簇類分析（HCAHCA）等。其中以）等。其中以PCAPCA方法最為常方法最為常用，用，PCAPCA的

21、原理是將高維數(shù)據(jù)降維，并將數(shù)據(jù)投影變換到變異最的原理是將高維數(shù)據(jù)降維，并將數(shù)據(jù)投影變換到變異最大的主軸上，從而提取出數(shù)據(jù)集的特征，它對所用的數(shù)據(jù)進行無大的主軸上，從而提取出數(shù)據(jù)集的特征，它對所用的數(shù)據(jù)進行無歧視的分析，無論是內(nèi)源性物質(zhì)，還是外源性物質(zhì)的代謝產(chǎn)物峰歧視的分析，無論是內(nèi)源性物質(zhì)，還是外源性物質(zhì)的代謝產(chǎn)物峰都能進行分析，是目前代謝組學數(shù)據(jù)處理的主要方法都能進行分析，是目前代謝組學數(shù)據(jù)處理的主要方法Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 數(shù)據(jù)處理與分析數(shù)據(jù)處理與分析 有監(jiān)督學習方法用于建立類別間的數(shù)學模型，使各類有監(jiān)督學習方法用于建立類別間的數(shù)學模型，使各類樣品間達到

22、最大的分離，并利用建立的多參數(shù)模型對樣品間達到最大的分離，并利用建立的多參數(shù)模型對未知的樣本進行預測。常用的方法有未知的樣本進行預測。常用的方法有偏最小二乘法偏最小二乘法（PLSPLS）、）、軟獨立建模分類法（軟獨立建模分類法（SIMCASIMCA）、偏最小二乘）、偏最小二乘法顯著性分析（法顯著性分析（PLS-DAPLS-DA）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANNANN）技術(shù)）技術(shù)等其中最常用的也是最基礎(chǔ)的分析方法是等其中最常用的也是最基礎(chǔ)的分析方法是PLSPLSWuhan universityLOGO代謝組學各分析流程技術(shù)代謝組學各分析流程技術(shù)Wuhan universityLOGO代組

23、學相關(guān)數(shù)據(jù)庫代組學相關(guān)數(shù)據(jù)庫Wuhan universityLOGO在中醫(yī)藥研究中的應用在中醫(yī)藥研究中的應用 評價藥物的毒性評價藥物的毒性 藥物的安全性研究藥物的安全性研究 中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究 中醫(yī)證候模型的研究中醫(yī)證候模型的研究 中藥質(zhì)量控制研究中藥質(zhì)量控制研究 中藥活性成分代謝產(chǎn)物研究中藥活性成分代謝產(chǎn)物研究 中藥及其復方的多靶點藥效作用機制研究等中藥及其復方的多靶點藥效作用機制研究等 Wuhan universityLOGO基于代謝組學的中藥整體藥效研究基于代謝組學的中藥整體藥效研究代謝組是生物體整體功能狀態(tài)的代謝組是生物體整體功能狀態(tài)的“生化表

24、型生化表型”，因而對于表征中藥，因而對于表征中藥“多組份、多靶點弱效應協(xié)同、有機整合整體效應多組份、多靶點弱效應協(xié)同、有機整合整體效應”具有突出優(yōu)勢具有突出優(yōu)勢多成分多成分多靶點效應多靶點效應血管保護血管保護 擴張冠脈擴張冠脈 降低耗氧量降低耗氧量 強心作用強心作用 綜合作用評價綜合作用評價 特異藥效特異藥效作用弱作用弱臨床療效確切臨床療效確切 ？Wuhan universityLOGO不足之處不足之處 分析手段有限，尚無任何一個分析技術(shù)能夠同時對所有代分析手段有限，尚無任何一個分析技術(shù)能夠同時對所有代謝物進行分析。尚無有效數(shù)據(jù)分析手段將所得到的全部信謝物進行分析。尚無有效數(shù)據(jù)分析手段將所得到

25、的全部信息進行分析和解釋息進行分析和解釋 數(shù)據(jù)庫很不完善數(shù)據(jù)庫很不完善 缺乏代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)的標準值缺乏代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)的標準值 另外樣品之間的差異、儀器動力學范圍的局限和分析誤差另外樣品之間的差異、儀器動力學范圍的局限和分析誤差的存在也給代謝組學分析帶來巨大的挑戰(zhàn)。因此在取樣方的存在也給代謝組學分析帶來巨大的挑戰(zhàn)。因此在取樣方法法, ,新型分析儀器和分析技術(shù)等方面，都需要有很多進一步新型分析儀器和分析技術(shù)等方面，都需要有很多進一步深入的工作深入的工作Wuhan universityLOGO雄黃、朱砂雄黃、朱砂國家標準中收載含朱砂、雄黃的中成藥占收載的全部的中國家標準中收載含朱砂、雄黃的中成藥占收載的

26、全部的中成方制劑的成方制劑的6.34%6.34%u應用廣泛，歷史悠久應用廣泛，歷史悠久u有效和有毒的雙重性有效和有毒的雙重性u安全性倍受關(guān)注安全性倍受關(guān)注Wuhan universityLOGOWeiWei等采用代謝組學的方法對雄黃、朱砂的毒性進等采用代謝組學的方法對雄黃、朱砂的毒性進行了研究：行了研究：雄性雄性WistarWistar大鼠灌胃給藥；大鼠灌胃給藥；采集尿液；采集尿液；1 1H NMRH NMR對代謝物進行分析；對代謝物進行分析；生物標志物的分析；生物標志物的分析；Lai Wei, Peiqiu Liao,et al Toxicology and Applied Pharmaco

27、logy234 (2009) 314325LOGO結(jié)果表明結(jié)果表明: : 尿液中，三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸鹽尿液中，三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸鹽(citrate)(citrate)、琥珀酸、琥珀酸鹽鹽( (succinatesuccinate) )、2 2酮戊二酸鹽酮戊二酸鹽(2-ketoglutarate)(2-ketoglutarate)顯著增顯著增加；乙酸乙酯、?；撬峒樱灰宜嵋阴?、牛磺酸( (taurinetaurine)、丙酮顯著增加，并伴隨、丙酮顯著增加，并伴隨著二甲基甘氨酸著二甲基甘氨酸( (dimethylglycinedimethylglycine) )、丙酮酸、丙酮酸( (py

28、lllvatepylllvate) )和和腸道菌產(chǎn)物苯乙尿酸腸道菌產(chǎn)物苯乙尿酸( (phenylacetylglycinephenylacetylglycine) )、馬尿酸鹽、馬尿酸鹽( (hippuratehippurate) )等內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的減少，且這些內(nèi)源性代謝等內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的減少，且這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。產(chǎn)物的變化呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。 二甲基甘氨酸為腎乳頭的毒性標志物，丙酮為腎臟皮層二甲基甘氨酸為腎乳頭的毒性標志物，丙酮為腎臟皮層S3S3段段的毒性標志物。牛磺酸為肝臟受損的指標上述代謝產(chǎn)物分的毒性標志物。牛磺酸為肝臟受損的指標上述代謝產(chǎn)物分析表明，對肝

29、腎具有一定的毒性析表明，對肝腎具有一定的毒性LOGOSchematic representation of the energy metabolic networkLOGO. Schematic representation of the degradation pathway of cholineLOGO n 朱砂主要成分為朱砂主要成分為HgSHgS，雄黃主要成分為，雄黃主要成分為AsAs2 2S S2 2n 朱砂、雄黃在人體內(nèi)的毒性程度與以下因素相關(guān)：朱砂、雄黃在人體內(nèi)的毒性程度與以下因素相關(guān)： （1 1）在體內(nèi)產(chǎn)生的可溶性砷、汞量）在體內(nèi)產(chǎn)生的可溶性砷、汞量 （2 2）上述可溶性的砷、汞

30、在體內(nèi)的存在價態(tài)）上述可溶性的砷、汞在體內(nèi)的存在價態(tài) Wuhan universityLOGO砷的不同價態(tài)及其毒性：砷的不同價態(tài)及其毒性：砷化氫（砷化氫（AsH3AsH3）亞砷酸）亞砷酸(As)(As)和砷酸和砷酸(As) (As) 甲基砷酸甲基砷酸( () )和二甲基砷酸和二甲基砷酸( () )胂甜菜堿胂甜菜堿( () )和胂膽堿和胂膽堿( () ) 基本無毒基本無毒汞的不同價態(tài)及其毒性汞的不同價態(tài)及其毒性 ：甲基汞乙基汞甲基汞乙基汞Hg2+Hg2+HgHg Wuhan universityLOGO 有研究表明，含朱砂、雄黃的中藥制劑經(jīng)口服后，其所含的有研究表明，含朱砂、雄黃的中藥制劑經(jīng)口服

31、后，其所含的砷或汞基本不被人體吸收。實驗表明：在糞便中所檢測到的砷或汞基本不被人體吸收。實驗表明：在糞便中所檢測到的總砷、總汞，分別占給藥量的總砷、總汞，分別占給藥量的9999和和98.598.5 因此僅以砷、汞元素的總量作為判斷其是否安全是不科學的因此僅以砷、汞元素的總量作為判斷其是否安全是不科學的 研究雄黃中砷、朱砂中汞在體內(nèi)可溶性部分的含量及其研究雄黃中砷、朱砂中汞在體內(nèi)可溶性部分的含量及其可溶可溶性的砷、汞在體內(nèi)的存在價態(tài)，性的砷、汞在體內(nèi)的存在價態(tài)，合理評價該類藥物，保證含合理評價該類藥物，保證含朱砂、雄黃中成藥的安全性和有效性朱砂、雄黃中成藥的安全性和有效性Wuhan univer

32、sityLOGO復方黃黛片的主要成分復方黃黛片的主要成分四硫化四砷四硫化四砷雄黃雄黃靛玉紅靛玉紅青黛青黛丹參酮丹參酮II-A -II-A -丹參丹參四硫化四砷四硫化四砷Tetraarsenic tetrasulfide靛玉紅靛玉紅Indirubin丹參酮丹參酮II-A治療急性早幼粒治療急性早幼粒細胞白血病細胞白血病(APL)(APL)的現(xiàn)代中藥配方的現(xiàn)代中藥配方制劑制劑LOGO本課題組關(guān)于代謝組學的實驗研究本課題組關(guān)于代謝組學的實驗研究基于代謝組學的天麻川基于代謝組學的天麻川芎芎 藥對配伍研究藥對配伍研究Wuhan universityLOGO研究背景研究背景-天麻天麻 川芎川芎Wuhan u

33、niversity成分：酚類，甾醇類、有機成分：酚類，甾醇類、有機 酸、氨基酸類酸、氨基酸類藥理作用：鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗藥理作用：鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥驚厥 成分：揮發(fā)油、生物堿、成分：揮發(fā)油、生物堿、酚性物質(zhì)、苯酞內(nèi)酯酚性物質(zhì)、苯酞內(nèi)酯 藥理作用：鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛藥理作用：鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛 、抗凝血抗凝血天麻天麻川芎川芎LOGO研究背景研究背景-天麻川芎天麻川芎 藥對藥對 配伍依據(jù)配伍依據(jù)：疾病特點疾病特點藥性及藥效藥性及藥效作用：作用：減少藥物毒性減少藥物毒性增強藥效增強藥效偏頭痛多屬于內(nèi)傷類頭痛，常和偏頭痛多屬于內(nèi)傷類頭痛，常和“風風”有關(guān)有關(guān)天麻川芎藥對恰合偏頭痛的病機天麻川芎藥對恰合偏頭痛的病機天麻能祛

34、風濕以天麻能祛風濕以 止痛、平肝熄風以止痙止痛、平肝熄風以止痙川芎具有活血、行氣、川芎具有活血、行氣、 祛風、止痛的功效祛風、止痛的功效Wuhan universityLOGO研究背景研究背景-天麻川芎天麻川芎 藥對藥對藥對藥對是古代醫(yī)家應用在中藥復方中的一種特殊形是古代醫(yī)家應用在中藥復方中的一種特殊形式，是中藥復方的最小單位，其配伍的規(guī)律及作式，是中藥復方的最小單位，其配伍的規(guī)律及作用機制是現(xiàn)代中藥研究的熱點之一。用機制是現(xiàn)代中藥研究的熱點之一。天麻和川芎常作為藥對使用，是歷代醫(yī)家用于治天麻和川芎常作為藥對使用，是歷代醫(yī)家用于治療療偏頭痛、眩暈偏頭痛、眩暈的經(jīng)典藥對組合的經(jīng)典藥對組合 ，不過

35、不同時，不過不同時期各大醫(yī)家對其配伍比例卻不盡相同，用法也各期各大醫(yī)家對其配伍比例卻不盡相同，用法也各異在異在本草綱目本草綱目等古代本草書籍中，記載的天等古代本草書籍中，記載的天麻川芎用量之比最常見的比例為麻川芎用量之比最常見的比例為1:41:4和和4:14:1 ，其，其中天麻川芎用量之比中天麻川芎用量之比1:41:4最為常見最為常見Wuhan universityLOGO 研究內(nèi)容研究內(nèi)容Wuhan university藥材分組：藥材分組： 天麻組天麻組 川芎組川芎組 天麻川芎天麻川芎A組（天麻：川芎組（天麻：川芎=1:4）天麻川芎天麻川芎B組（天麻：川芎組（天麻：川芎=4:1）提取方法：提

36、取方法：10倍量倍量70%乙醇乙醇提取時間提取時間1h提取提取3次次一、天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響一、天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響LOGO-天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響 Wuhan university流動相：甲醇流動相：甲醇-水水( 50:50)檢測波長：檢測波長：280nm；柱溫：柱溫：25；流速：流速：0.8mL.min-1川芎嗪的含量測定川芎嗪的含量測定LOGO-天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響 Wuhan university 川芎嗪含量測定結(jié)果川芎嗪含量測定

37、結(jié)果組別組別每克川芎含川芎嗪每克川芎含川芎嗪（mg）平均值平均值（mg）川芎嗪提取增加川芎嗪提取增加率（率（%）川芎組川芎組0.0730.0760.0740.074天麻川芎天麻川芎A組組0.0970.0950.09528.27%0.092天麻川芎天麻川芎B組組0.0830.0820.08210.81%0.083LOGO-天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響 Wuhan university流動相流動相:水水:甲醇甲醇:冰乙酸冰乙酸(95：5：1)流速流速: 0. 8mLmin-1檢測波長檢測波長: 270nm柱溫：柱溫：25天麻素含量測定天麻素含量測

38、定 LOGO-天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響天麻川芎不同配伍比例對有效成分提取的影響 Wuhan university天麻素含量測定結(jié)果天麻素含量測定結(jié)果組別組別每克天麻含每克天麻含天麻素（天麻素（mg）平均值平均值（mg）天麻素提取天麻素提取增加率（增加率（%）天麻組天麻組8.288.308.288.25天麻川芎天麻川芎A組組8.818.858.856.88%8.88天麻川芎天麻川芎B組組8.768.728.745.56%8.73LOGO結(jié)論結(jié)論天麻川芎配伍后有利于其有效成分的天麻川芎配伍后有利于其有效成分的溶出溶出其中川芎嗪含量的提高比天麻素明顯其中川芎嗪含量的提高比天麻素明顯藥

39、對配伍比例會影響到有效成分的藥對配伍比例會影響到有效成分的溶出溶出率率其中其中天麻川芎用量之比天麻川芎用量之比1:41:4時其有效成分的時其有效成分的溶出率相對較高溶出率相對較高Wuhan universityLOGO二、二、天麻川芎藥對對大鼠尿液內(nèi)源性代謝天麻川芎藥對對大鼠尿液內(nèi)源性代謝時間軌跡分析時間軌跡分析 Wuhan university 正常對照組正常對照組川芎組川芎組 天麻組天麻組天麻川芎天麻川芎 A A組組天麻川芎天麻川芎B B組組 正常對照組：正常對照組：給予生理鹽水給予生理鹽水其余各組：其余各組：給予藥材提取液給予藥材提取液代謝籠采集大鼠尿液代謝籠采集大鼠尿液甲醇去蛋白，離心

40、甲醇去蛋白，離心1.動物分組動物分組2.灌胃給藥灌胃給藥3.尿樣采集尿樣采集LOGOWuhan university流動相：乙腈流動相：乙腈(A)、0.1甲酸甲酸(B)，流速：，流速：0.4 mLmin-1，進樣量：進樣量：3L，柱溫：，柱溫：35，梯度洗脫條件如下表：，梯度洗脫條件如下表：T（min）A(%)B(%)0010087030129010140100190100毛細管電壓為毛細管電壓為4000V4000V；霧化器壓力為；霧化器壓力為40 psi40 psi；干燥氣流速：干燥氣流速：10Lmin-110Lmin-1，干燥氣溫度：，干燥氣溫度：3503504. LC-MS數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采

41、集LOGOWuhan university將將LC-MS原始數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化后原始數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化后導入導入SIMCA-P軟件、軟件、MATLAB軟件進行主成分分析軟件進行主成分分析5. 數(shù)據(jù)分析主成分分析法：主成分分析法：將許多相關(guān)的變量轉(zhuǎn)為少數(shù)幾個彼此獨立的綜合指標的統(tǒng)計方法將許多相關(guān)的變量轉(zhuǎn)為少數(shù)幾個彼此獨立的綜合指標的統(tǒng)計方法它讓多個變量的復雜關(guān)系變得簡單，有利于獲取其中最有效的數(shù)據(jù)它讓多個變量的復雜關(guān)系變得簡單，有利于獲取其中最有效的數(shù)據(jù) 在進行主成分分析后，可在在進行主成分分析后，可在80以上的精度下，用以上的精度下，用2-3個新個新變量取代原來的變量取代原來的n個變量個變量LOGO單擊此

42、處添加標題由原始變量的觀測數(shù)據(jù)計算前由原始變量的觀測數(shù)據(jù)計算前k個主成分的得分，將其作為個主成分的得分，將其作為主成分主成分F1，F(xiàn)2，F(xiàn)k的觀的觀測值，來建立測值，來建立Y 與主成分與主成分回歸方程回歸方程生成生成得分圖得分圖生成生成載荷圖載荷圖分類信息分類信息尋找生物標尋找生物標志物志物Wuhan universityLOGO單擊此處添加標題X1X2X3X4.XnVar-1Var-2Var-3Var-4.Var-nY1樣本1峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n樣本2峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n樣本3峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積nY2樣本4峰面積1峰面積2峰面

43、積3峰面積4.峰面積n樣本5峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n樣本6峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積nY3樣本7峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n樣本8峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n樣本9峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積nLOGO通過得分矩陣可得到得分圖通過得分矩陣可得到得分圖 (Scores Plot(Scores Plot) )在得分圖上，樣本得分點之間的距離越大表明樣本之間的差在得分圖上，樣本得分點之間的距離越大表明樣本之間的差異越大，大鼠尿液的代謝物狀態(tài)差異越大異越大，大鼠尿液的代謝物狀態(tài)差異越大C0C0，C1C1，C2C2，C3C3，C4C

44、4分別表示正常對照組大鼠在第分別表示正常對照組大鼠在第1 1，8 8，15,15, 22,22, 2929天收集的尿液樣本；天收集的尿液樣本；A0A0，A1A1，A2A2，A3, A3, A4分別表示給分別表示給藥組大鼠在第藥組大鼠在第1 1，8 8，15,15, 22,22, 2929天收集的尿液樣本天收集的尿液樣本 Wuhan universityLOGO實驗結(jié)果實驗結(jié)果Wuhan university天麻組天麻組SIMCA-P平面得分圖平面得分圖 天麻組天麻組MATLAB平面得分圖平面得分圖 川芎組川芎組SIMCA-P平面得分圖平面得分圖 川芎組川芎組MATLAB平面得分圖平面得分圖 L

45、OGOWuhan university天麻川芎天麻川芎A組組SIMCA-P平面得分圖平面得分圖 天麻川芎天麻川芎A組組MATLAB平面得分圖平面得分圖 天麻川芎天麻川芎B組組MATLAB平面得分圖平面得分圖 天麻川芎天麻川芎B組組SIMCA-P平面得分圖平面得分圖 LOGO小小 結(jié)結(jié)給藥時間為給藥時間為2929天時，天時，各給藥組大鼠內(nèi)源性代謝整體變化最大各給藥組大鼠內(nèi)源性代謝整體變化最大兩種軟件主成分分析得到的結(jié)果是一致的兩種軟件主成分分析得到的結(jié)果是一致的SIMCA-PSIMCA-P軟件比軟件比MATLABMATLAB軟件更適合軟件更適合在醫(yī)藥學研究中使用在醫(yī)藥學研究中使用 Wuhan u

46、niversityLOGO三、天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝影響三、天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝影響 Wuhan university正常對照組、模型組、正常對照組、模型組、天麻組、川芎組天麻組、川芎組天麻川芎天麻川芎A A組、天麻川芎組、天麻川芎B B組組陽性對照組陽性對照組正常對照組、模型組給予生理鹽水正常對照組、模型組給予生理鹽水陽性對組給予陽性藥物陽性對組給予陽性藥物其余各組分別給予相應的藥材提取液其余各組分別給予相應的藥材提取液除了正常對照組，各組大鼠均在給藥后于除了正常對照組，各組大鼠均在給藥后于右肩部注射硝酸甘油注射劑（右肩部注射硝酸甘油注射劑（10mg

47、.kg-110mg.kg-1）尿液收集及數(shù)據(jù)采集方法同前尿液收集及數(shù)據(jù)采集方法同前動物分組動物分組動物給藥動物給藥動物造模動物造模尿液、數(shù)據(jù)采集尿液、數(shù)據(jù)采集LOGO天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝影響天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝影響偏最小二乘法偏最小二乘法- -判別分析（判別分析（PLS-DAPLS-DA）與與PCAPCA分析相似，都是為了提取出主成分，簡化數(shù)據(jù)分析相似，都是為了提取出主成分，簡化數(shù)據(jù)與主成分的不同點是加入啞變量（分組信息）來引導分類與主成分的不同點是加入啞變量（分組信息）來引導分類X1X2X3X4.XnVar-1Var-2Var-3Var-4.Var

48、-nY1第一組1樣本1峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n1樣本2峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n1樣本3峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積nY2第二組2樣本4峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n2樣本5峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n2樣本6峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積nY3第三組3樣本7峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n3樣本8峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積n3樣本9峰面積1峰面積2峰面積3峰面積4.峰面積nLOGO天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響 Wuhan

49、 university基于代謝組學的硝酸甘油致偏頭痛大鼠模型驗證分析基于代謝組學的硝酸甘油致偏頭痛大鼠模型驗證分析 正常對照組與偏頭痛模型的正常對照組與偏頭痛模型的PLS-DA平面得分圖與三維得分圖平面得分圖與三維得分圖 正常對照組與偏頭痛模型的正常對照組與偏頭痛模型的PCA平面得分圖與三維得分圖平面得分圖與三維得分圖LOGO天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響 Wuhan university不同配伍比例的天麻川芎藥對對偏頭痛大鼠尿液內(nèi)源性物質(zhì)的影響不同配伍比例的天麻川芎藥對對偏頭痛大鼠尿液內(nèi)源性物質(zhì)的影響 1 1：正常對照組；：正

50、常對照組；2 2：陽性對照組；：陽性對照組；3 3：天麻川芎：天麻川芎A A組；組；4 4：天麻川芎：天麻川芎B B組；組；5 5：川芎組；：川芎組；:6:6：天麻組；：天麻組；:7:7：模型組：模型組 LOGO天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響 Wuhan university1 1：正常對照組；：正常對照組；2 2：陽性對照組；：陽性對照組；3 3：天麻川芎：天麻川芎A A組；組；4 4：天麻川芎：天麻川芎B B組；組；5 5：川芎組；：川芎組；:6:6：天麻組；：天麻組；:7:7：模型組：模型組LOGO天麻川芎藥對對偏頭痛模型

51、大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響 Wuhan university天麻川芎天麻川芎A A組對偏頭痛大鼠尿液內(nèi)源性物質(zhì)代謝途徑的影響組對偏頭痛大鼠尿液內(nèi)源性物質(zhì)代謝途徑的影響 正常對照組（藍），陽性對照組（綠），天麻川芎正常對照組（藍），陽性對照組（綠），天麻川芎A A組（橙）與模型組（紅）組（橙）與模型組（紅）PCAPCA平面得分圖與三維得分圖平面得分圖與三維得分圖 LOGO天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響天麻川芎藥對對偏頭痛模型大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響Wuhan university 正常對照組，陽性對照組，天麻川芎正常對照組，陽性對照組，天麻川芎A A組與模型組組與模型組PCAPCA載荷圖載荷圖 5.生物標志物的尋找與鑒定生物標志物的尋找與鑒定載荷圖中距離原點越遠的點，表示其代表的變量對分類的載荷圖中距離原點越遠的點，表示其代表的變量對分類的貢獻越大，越有可能成為潛在的生物標志物貢獻越大，越有可能成為潛在的生