SOD、MDA、GSH

1、改良的鹽酸羥胺法測生物樣品SOD活性一 SOD（T-SOD）活力測定：原理：羥胺在有氧環(huán)境下發(fā)生自氧化可產(chǎn)生超氧陰離子，產(chǎn)生的超氧陰離子可由NBT還原率而檢測，在SOD存在下，超氧陰離子被分解，NBT還原被抑制。因此，用比色法測定NBT還原產(chǎn)物可以間接反映SOD的酶活力。儀器：可見光分光光度計試劑：75mM Na2CO3 /NaHCO3緩沖液（pH=10.2，含0.15mM EDTA-Na2）5mM NH2OH·HCl0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml甲酸步驟：1. 用1:5組織勻漿（血清可直接取樣），3000rpm離心30min，

2、取上清20ul稀釋至0.1ml2. 按順序加入如下試劑：75mM Na2CO3 /NaHCO3緩沖液 2.0ml5mM NH2OH·HCl 0.5ml0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml3. 立即計時，于37恒溫水浴10min（避光）。4. 2.0ml甲酸終止反應(yīng)。5. E560nM比色，記錄OD值。計算結(jié)果：酶單位表示：在本實驗條件下，抑制率達(dá)50%所對應(yīng)的提取液SOD含量即一個SOD單位（U）。可用每g蛋白（U/g protein）表示。二 Mn-SOD活性測定：基于氰化物抑制CuZn-SOD非Mn-SOD活性的原理，在上述緩沖液

3、中加入KCN，使最終反應(yīng)體系中的KCN濃度達(dá)到2mM，即將緩沖液配成含3mM的KCN。37孵育45分鐘，以抑制CuZn-SOD。其余操作、步驟、計算方法同上。三 CuZn-SOD酶活力 = T-SOD酶活力單位 Mn-SOD酶活力注意事項：1) 對照組（非酶管）取樣品同體積的三蒸水，其余步驟同樣品。2) 若測血中SOD，可取血清20ul，其余地操作步驟同上。來自：第四軍醫(yī)大學(xué)碩士王建宏學(xué)位論文診斷劑量超聲對鼠胚胎和人絨毛脂質(zhì)過氧化及超微結(jié)構(gòu)的影響。導(dǎo)師：錢蘊(yùn)秋。單位及專業(yè)：西京醫(yī)院超聲診斷科，超聲診斷學(xué)。1991.5-1992.6。參考秦緒軍、常耀明碩士論文原始參考文獻(xiàn)：1、 Kono Y.

4、Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Arch Biochem Biophys. 1978 Feb; 186(1):189-95. 或者Yasuhisa Kono. Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Anchives of Bioche

5、mistry and Biophysics. 1978 Feb; 186(1):189-95.2、 Yisun et al. Free Rad Res Comms 1988; 4:299-309.劉樹元制作2003-5-7熒光法測定血清脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）原理：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（簡稱MDA），可與硫代巴比妥酸（簡稱TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物。此紅色物質(zhì)在波長532nm有極大吸收峰，可用分光光度法進(jìn)行定量測定。若以515nm為激發(fā)光，則在553nm有最強(qiáng)熒光強(qiáng)度，故可用熒光法進(jìn)行微量測定。靈敏度高，再現(xiàn)性好，試樣用量少，是該方法的優(yōu)點。儀器：熒光分光光度計試劑：1) MDA標(biāo)準(zhǔn)儲

6、備液（1mmol/L 四乙氧基丙烷或四甲氧基丙烷水溶液）：準(zhǔn)確稱取22.03mg1，1，3，3-四乙氧基丙烷加水定容至100ml，放4冰箱，可保存三個月。2) MDA標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（1mol/L）：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1ml于100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，用時再準(zhǔn)確稀釋（現(xiàn)用現(xiàn)配）。3) 1/24mol/L H2SO4 4) 10% 磷鎢酸溶液5) 0.67 硫代巴比妥酸（TBA）：新鮮配制（溶于水與冰醋酸等體積混合液）。6) 正丁醇（水飽和）步驟：血清樣品 50l1/24mol/L H2SO4 4.0ml10%磷鎢酸 500l混勻放置5min 2000rpm離心10分鐘棄上清 ，空在濾紙

7、上1/24mol/L H2SO4 2.0ml10%磷鎢酸 300l混勻放置5min， 2000rpm離心5分鐘棄上清 ，空在濾紙上樣品管 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管雙蒸水 1.0ml(震1分鐘) 1.0ml /標(biāo)準(zhǔn)品 / / 1/0.5/0.25/0.125/0.0625各1.0ml0.67TBA 1.0ml 1.0ml 1.0ml振蕩、混勻 100準(zhǔn)確水浴1h取出流水冷卻至室溫正丁醇（水飽和） 4.0ml振蕩抽提1分鐘，2000rpm離心5分鐘取上清（正丁醇層）約3.0ml(若出現(xiàn)混濁，可加一滴無水乙醇)測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)光（515nm）發(fā)射光（553nm）計算結(jié)果：丙二醛濃度=0.5×1.0

8、0/0.05×1.05/0.5×f/F = 21×f/F nmol/ml血液f：樣品溶液的熒光強(qiáng)度F：標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度注意事項：棄上清時，不要回手。改良熒光法測定還原型谷胱甘肽原理：OPT在PH為8.0的時候與還原型谷胱甘肽合成GSH-OPT，在一定的激發(fā)波長和發(fā)射波長下進(jìn)行熒光測定，從而對GSH進(jìn)行定量。儀器：熒光分光光度計試劑：1）0.1%鄰苯二甲醛（OPT）溶液：臨用前稱取OPT10mg溶于10ml甲醇，混勻。2）0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（含5mmol/L EDTA）：稱取Na2HPO4.12H2O 35.814g、 EDTA-Na2 1.861g，

9、用蒸餾水溶解并定容至1L，調(diào)節(jié)pH至8.3。3）1：4甲醛溶液：1體積甲醛加4體積磷酸鹽緩沖液混合。4）GSH標(biāo)準(zhǔn)儲存液：新鮮配制，將GSH配成1mg/ml水溶液5）GSH標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：新鮮配制，取標(biāo)準(zhǔn)儲備液用水稀釋成0.5ug/ml的溶液。6）10%的三氯醋酸溶液步驟：試劑（ml） 測定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白待測樣品 0.2 應(yīng)用液 0.2 雙蒸水 0.210%的三氯醋酸 0.2 0.2 0.2搖勻，室溫靜置10 min，5000g離心10min,，吸上清上清液 0.1 0.1 0.1甲醛 0.1 0.1 0.1搖勻，靜置5min0.1mol/L緩沖液 3.6 3.6 3.6搖勻，立即加入OPT溶液

10、0.2ml，搖勻，靜置40min測定：激發(fā)波長350nm, 發(fā)射波長425nm，空白調(diào)0，讀取熒光讀數(shù)。計算結(jié)果：測定管熒光讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)管熒光讀數(shù)GSH 濃度(umol/L)= ×1000÷307.3注意事項：1）GSH的濃度是在2.5ug/ml內(nèi)，線性關(guān)系良好，最低檢出限為25ng/ml。2）本法測定過程中，加入OPT后，40min熒光值達(dá)最高讀數(shù)，在其后20min內(nèi)穩(wěn)定。3）可用偏磷酸沉淀劑代替10%的三氯醋酸，但須在40C下完全沉淀。4）用三氯醋酸沉淀蛋白，為達(dá)到最佳PH值8.0，故使用pH8.3的磷酸鹽緩沖液。5）甲醛的作用是降低非特異性干擾。 熒光法測定氧化型谷胱甘肽

11、原理：OPT在PH為12時，與GSSG特異地結(jié)合成GSSG-OPT，在一定的激發(fā)波長和發(fā)射波長下可進(jìn)行熒光測定，從而對GSSG定量。N-乙基馬來酰亞胺（NEM）能與GSH絡(luò)合，并防止GSH轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG，可用來消除GSH轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG對GSSG含量測定結(jié)果的影響。儀器：熒光分光光度計試劑：1）25%偏磷酸 2）1mg/mlOPT：用甲醇配制。 3）0.04mol/L NEM水溶液 4）0.1mol/L NaOH 5）GSSG標(biāo)準(zhǔn)液：0.5ug/ml，用0.1mol/LNaOH配制。步驟：1）樣品制備：采集全血，加入0.06體積的SBE抗凝，12000g離心1.5min，分離上清，冰浴待測。或取

12、組織0.5g，加入7.5ml磷酸鈉-EDTA緩沖液、25%偏磷酸溶液2ml，制成5%的勻漿。室溫下6500g離心15分鐘，分離上清液，置冰浴中待測。 2）吸取0.5ml上清，加入0.2ml NEM溶液，室溫靜置30min。 3）加入0.1mol/L NaOH溶液4.3ml，混勻待測。 4）加樣檢測：試劑（ml） 0 1 2 3 4 5 樣品管GSSG標(biāo)準(zhǔn)液 0 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 /待測樣品液 / / / / / / 0.1NaOH 2.0 1.9 1.5 1.0 0.5 0 1.9OPT-甲醇液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1GSSG含量（

13、1;g） 0 0.05 0.25 0.5 0.75 1.0將各管混勻，室溫下靜置30min選擇激發(fā)波長337.8nm，發(fā)射波長421.6nm，以標(biāo)準(zhǔn)曲線中的0管作對照，測定各管熒光強(qiáng)度。計算結(jié)果：以GSSG標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為坐標(biāo)橫軸，以其對應(yīng)的熒光強(qiáng)度值為坐標(biāo)縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求直線回歸方程。將樣品管的熒光測定值代入方程，可直接求出待測樣品中的GSSG的含量。注意事項：1）OPT可與GSH在PH8.0時結(jié)合，故可測定GSH含量，用0.1M磷酸鈉0.005M EDTA緩沖液(pH8.0)替換NaOH，同時樣品不用NEM處理。2）GSSG及GSH在室溫下形成熒光物質(zhì)需一定時間，20min尚不能穩(wěn)定，

14、25min反應(yīng)基本完全，2h內(nèi)穩(wěn)定不變，故選擇30min。3）本法的特點是可同時測定GSH與GSSG。分光光度法測定谷胱甘肽過氧化物酶的活力原理：谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）可促進(jìn)氫過氧化物與還原型谷胱甘肽的反應(yīng)。谷胱甘肽過氧化物酶的活力，可以其酶促反應(yīng)的速度來表示。另外，利用氧化型谷胱甘肽和輔酶2在谷胱甘肽還原酶作用下的反應(yīng)，測定輔酶2的減少，亦可求出谷胱甘肽過氧化物酶的活力。測定酶促反應(yīng)中過氧化物或還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶的活力，GSHPX ROOH+2GSH ROH+GSSG+H2O H2O2+2GSH 2H2O+GSSGGSSG+2NADPH NADP+GSH儀器：可見光分光光

15、度計試劑：1）疊氮化納磷酸緩沖液（PH7.0）：NaN3 0.065g、EDTA-Na2 11.6g、Na2HPO4.12H2O 8.74g、 NaH2PO4.2H2O 2.43g，以雙蒸水溶解，稀釋至100ml，再以NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，4保存。2）1.0mmol/L GSH溶液：須當(dāng)日配制。稱取GSH 3.07mg，以疊氮化納磷酸緩沖液溶解并稀釋至10.0ml。3）1.25-1.50mmol/L的H2O2溶液：須當(dāng)日配制。吸取30% H2O2 13ul，以蒸餾水稀釋至100ml。4）偏磷酸沉淀液：含1.67%偏磷酸、0.05% EDTA及28%NaCl。稱取適量試劑后用三蒸水溶解，可微

16、微加熱促溶，充分溶解后趁熱過濾。5）0.32mol/L的磷酸氫二鈉溶液6）DTNB顯色液：稱取0.04g DTNB、檸檬酸納1.0g溶于蒸餾水中并稀釋至100ml，盛于棕色瓶4可保存一個月。步驟： 1）GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定(ml)：10ml的容量瓶中試劑（ml） 1 2 3 4 5 6GSH液 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00偏磷酸沉淀液 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0蒸餾水 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0GSH系列（µmol/L）0 20 40 60 80 100標(biāo)準(zhǔn)液系列 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0磷酸氫二鈉

17、 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5DNTB溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.55min內(nèi)422nm比色，以蒸餾水調(diào)02）全血GPX的測定(ml)：樣品制作：采集全血50ul，蒸餾水稀釋到2.0ml酶促反應(yīng)（樣品管） 非酶促反應(yīng)（非酶管） 空白管GSH液0.4ml GSH液0.4ml /血樣稀釋液0.4ml 蒸餾水0.4ml /37水浴5min 37水浴5min /H2O2（37預(yù)溫）0.2ml H2O2（37預(yù)溫）0.2ml /偏磷酸沉淀液4.0ml 偏磷酸沉淀液4.0ml 顯色反應(yīng)(調(diào)0)混勻后，3000rpm離心10min上清2.0ml 上清2.0ml 蒸餾水

18、0.4ml 偏磷酸1.6ml磷酸二氫鈉2.5ml 磷酸二氫鈉2.5ml 磷酸二氫鈉2.5mlDTNB 0.5ml DTNB 0.5ml DTNB 0.5ml422nm5min內(nèi)讀取光密度計算結(jié)果：Log(非OD空OD)log(樣OD空OD)3min×0.004mlGPX= 谷胱甘肽過氧化物酶活力的測定DTNB直接顯示法一原理 測定酶促反應(yīng)中GSH的消耗量，則可求出酶的活力。（注意最后計算時，必須扣除非酶促反應(yīng)所引起的GSH減少部分。）GSH-Px2GSH+H2O2 GSSG+2H2OGSH量的測定：GSH+DTNB 5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子 該產(chǎn)物呈較穩(wěn)定的黃色，測定其在422nm波長的光吸收值，可計算出GSH的量，從而可反映并計算出GSH-Px的活性。二試劑與儀器1.試劑 1）疊氮化納磷酸緩沖液