第五章透射電子顯微鏡生物樣品制備技術(shù)

1、 第五章 透射電子顯微鏡生物透射電子顯微鏡生物 樣品的制備技術(shù)樣品的制備技術(shù) 通過前段的學(xué)習(xí)大家已知到，電子顯微鏡可分為透射和掃描兩種，它們的成像原理是完全不同的。透射電鏡的成像是和光學(xué)顯微鏡的原理基本相同，因此它只能觀察薄片樣品和微顆粒樣品，它主要是用來觀察研究組織或細(xì)胞的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)。而掃描電鏡是電子束在樣品表面掃描激發(fā)出的二次電子轉(zhuǎn)換成樣品的圖像，它既可以觀察較大的塊狀樣品也可觀察顆粒樣品。但它只能觀察研究樣品的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)。所以兩種電鏡的樣品制備方法是完全不同的。 第一節(jié)第一節(jié) 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 生物樣品的生物樣品的 超薄切片制備技術(shù)超薄切片制備技術(shù) 透射電鏡的樣品制備技術(shù)

2、，主要有超薄切透射電鏡的樣品制備技術(shù)，主要有超薄切片技術(shù)、負(fù)染色技術(shù)和冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)。片技術(shù)、負(fù)染色技術(shù)和冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)。 超 薄切片樣品制作技術(shù)，是透射電鏡生物醫(yī)學(xué)樣品制備的最常用技術(shù)，其制作程序和石蠟切片的方法步驟基本相同，但是在所使用的某些化學(xué)試劑及切片機是完全不同的，對各技術(shù)步驟的操作要求要比石蠟切片嚴(yán)格很多。一個能滿足透射電鏡觀察要求的超薄切片應(yīng)具備以下幾點： 1、切片厚度均勻，厚度在5070nm. 2、切片無劃痕、無震顫、無人工污染。 3、耐高真空，在真空中不變形、不升華。 4、耐電子束的轟擊。 根據(jù)上述要求，制作一個合格的超薄切片需要經(jīng)過以下步驟：取材、固定（雙固定）、清洗、

3、脫水、置換、浸透、包埋、聚合、修塊、超薄切片、撈片、電子染色。 由于透射電鏡是觀察研究組織或細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，也就是主要研究細(xì)胞器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，它對觀察樣品的要求十分嚴(yán)格。所以在樣品的制備過程中一定要慎重的對待每一操作步驟，否則會造成實驗結(jié)果的失敗。因為有很多材料不能重復(fù)取材（如人的病理組織），所以一旦結(jié)果不好或失敗， 是不可彌補的。 一、取材一、取材 從動、植物體上獲得所需實驗材料的過程叫取材。 1、取材的方法、取材的方法動物和植物的取材方法稍有不同。動物組織的取材：動物組織的取材：取動物材料時需要先處死動物，然后要在盡短的時間內(nèi)（要求在分鐘之要求在分鐘之內(nèi)）內(nèi)）把所需要的組織取出放入預(yù)冷（

4、40C ）的固定液中，稍加固定后再切成適當(dāng)大小的塊(要要求立方毫米大?。┣罅⒎胶撩状笮。?；植物組織的取材：植物組織的取材：植物材料可直接切成適當(dāng)大小的塊，放入預(yù)冷的固定液中，如果材料漂在液體上面，需抽氣讓組織沉到液體的底部，以便使組織得到充分的固定游離細(xì)胞的取材：游離細(xì)胞的取材：懸液培養(yǎng)的細(xì)胞需要離心獲得細(xì)胞的沉淀物，然后再用預(yù)冷的固定液進行固定處理；貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞要先想辦法收集細(xì)胞團再進行固定處理。細(xì)菌的取材：細(xì)菌的取材：取材方法基本和培養(yǎng)細(xì)胞的方，法相同。懸液培養(yǎng)的要離心獲得細(xì)菌沉淀物進行固定，平板和斜面培養(yǎng)的可直接獲得菌團進行固定。人體病理組織的取材：人體病理組織的取材：需提前做好準(zhǔn)備，

5、到手術(shù)室取材。 2、取材的注意事項、取材的注意事項 1）、取材的全過程要求在冷（40C ）的環(huán)境中進行，所用的液體要提前進行預(yù)冷。 2）、切割樣品時要采取一刀切開的方法，不能用拉鋸式切割法，盡量減少對樣品的機械損傷。 3）、樣品的塊要小，要求是1個立方毫米。這樣可使樣品在較短的時間內(nèi)得到充分的固定。 4）、如果所取樣品的表面有污染物，動物材料要用冷的生理鹽水洗；植物材料可用無離子水或自來水洗，但清洗的時間一定要短。 二、固定二、固定 用物理或化學(xué)的方法迅速殺死細(xì)胞的過程叫固定。 1、固定的目的：、固定的目的：保存細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)，防止組織細(xì)胞的自溶；保護樣品使其組成物質(zhì)在以后的清洗、脫水和包埋過

6、程中不至溶解和丟失，并使組織適度硬化，防止切片的變形。 2、固定的方法：、固定的方法：有物理固定法和化學(xué)固定法。 1 1）、物理固定法：）、物理固定法：用高溫、冷凍、干燥等物理手段，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定，一般不用。 2 2）、化學(xué)固定法：）、化學(xué)固定法：用化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞結(jié)構(gòu)進行固定，是常用的方法。 化學(xué)固定又可分為化學(xué)固定又可分為： （1）、）、單一固定法。單一固定法。即對樣品只用一種固定劑進行固定，這種方法只是在一些特殊要求的樣品制備中使用（如電鏡細(xì)胞化學(xué)樣品制備時），常規(guī)制樣一般不使用。 （2）、雙重固定法。）、雙重固定法。用兩種或兩種以上的性質(zhì)不同的固定劑對同一種樣品進行固定，這種方法是最常選

7、用的。它可以相互彌補固定劑各自的不足，使細(xì)胞內(nèi)的各種結(jié)構(gòu)都得到充分的固定。 （3）、原位固定法。）、原位固定法。主要用于動物深層組織取材過程中使用的方法，可以防止細(xì)胞的自溶。 （4）、灌流固定法。）、灌流固定法。也是在動物組織取材時選用的一種臨時固定方法，從動脈向組織內(nèi)灌注固定液，使組織在短時間內(nèi)得到充分的固定，本方法適用于獨立性好的器官取材時的的臨時固定。3、影響固定效果的因素、影響固定效果的因素1 1）、固定液的）、固定液的PHPH值：值：固定液的 PH值必須接近被固定樣品的PH值。這樣可以避免蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，大部分的動物組織的平均PH值為7.4，選用PH值7.27.4較為適宜；植

8、物組織常用pH值6.87.1固定液，固定效果較好。2）、固定液的濃度：）、固定液的濃度：固定液的濃度一定要合適，戊二醛的常用濃度為13，鋨酸一般為12。3）、固定液的滲透壓：）、固定液的滲透壓：一般堤身固定液可使細(xì)胞膨脹，而高身固定液可使細(xì)胞收縮。固定液的滲透壓可通過改變緩沖液的濃度或增加納、鈣和鎂等電解質(zhì)或葡萄糖、蔗糖等非電解質(zhì)來調(diào)節(jié)。4）、組織塊的大?。海?、組織塊的大?。航M織塊大固定的時間要長，固定效果差；組織塊小，固定時間短固定效果好。5）、固定溫度：）、固定溫度：為降低酶的活性，防止細(xì)胞的自溶，固定大都在4度中進行。 4、常用固定劑的種類及溶液的配制、常用固定劑的種類及溶液的配制 1

9、1）、固定劑的選擇）、固定劑的選擇: : 一種優(yōu)良的固定劑應(yīng)具備以下條件：滲透能力強；使蛋白質(zhì)交滲透能力強；使蛋白質(zhì)交聯(lián)成穩(wěn)定的凝膠，而蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生明聯(lián)成穩(wěn)定的凝膠，而蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯的變化和凝集；能保存酶的一定活力和細(xì)胞顯的變化和凝集；能保存酶的一定活力和細(xì)胞內(nèi)其它成分（核酸、核蛋白、糖元及脂類）；內(nèi)其它成分（核酸、核蛋白、糖元及脂類）；對細(xì)胞沒有收縮和膨脹作用；對細(xì)胞不產(chǎn)生人對細(xì)胞沒有收縮和膨脹作用；對細(xì)胞不產(chǎn)生人工假象，并能提高電子反差工假象，并能提高電子反差。根據(jù)以上條件，適用于電鏡樣品固定的固定劑常見的有：戊二醛、鋨酸、多聚甲醛、高錳酸鉀等。 （1）、戊二醛）、戊二醛

10、 它是一種還原劑，分子量是100.12，商品是25的水溶液。 PH為4.05.0 。它的穿透能力很強，是蛋白質(zhì)的優(yōu)良交聯(lián)劑，對細(xì)胞膜系統(tǒng)、細(xì)胞骨架、糖元、核蛋白和細(xì)胞基質(zhì)的固定效果較好。但不能保存脂類物質(zhì)，不能有效地提高樣品的電子反差。 （2）、鋨酸）、鋨酸 是一種強氧化劑，分子量為254.2，水溶液為中性。它對脂類物質(zhì)固定效果很好，對核蛋白、蛋白質(zhì)都有較好的固定效果，能有效地提高樣品的電子反差。但不能保存糖類物質(zhì)，對人體的粘膜組織刺激很強，毒性大。用時一定要在通風(fēng)條件好的環(huán)境中進行。 2）、緩沖液和固定液的配制）、緩沖液和固定液的配制 （1）、緩沖液的配制）、緩沖液的配制 在電鏡樣品制備中。

11、常用的有磷酸和二甲砷酸鈉兩種緩沖液。 A A、 0.2mol0.2mol磷酸緩沖液的配制磷酸緩沖液的配制 甲液：甲液：0.2M的磷酸氫二鈉溶液 磷酸氫二鈉（含2個水分子） 36.61g (含7個水分子） 53.65g （含12個是分子） 71.64g 加雙蒸水至 1000ml 乙液：乙液：0.2M磷酸二氫鈉溶液 磷酸二氫鈉（含1個水分子） 27.60g (含2個水分子） 31.21g 加雙蒸水至 1000ml 不同不同PHPH的的0.2M 0.2M 的磷酸緩沖液的配制的磷酸緩沖液的配制 PH 6.4 6.6 PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 6.8 7.0 7.2 7.4

12、甲液甲液( (ml) 13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5ml) 13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 乙液乙液( (ml) 36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5ml) 36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 B、 二甲砷酸鈉緩沖液的配制二甲砷酸鈉緩沖液的配制 甲液：二甲砷酸鈉 4.28g 加雙蒸水至 100ml 乙液：0.2N的鹽酸。 按下表混合得不同按下表混合得不同PHPH值的緩沖液值的緩沖液 PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液(ml) 50 50 50 50 50 50 乙液(ml)

13、 18.3 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7（2 2）、固定液的配制）、固定液的配制 A、 0.1M0.1M磷酸緩沖戊二醛固定液磷酸緩沖戊二醛固定液 戊二醛的最終濃度（）戊二醛的最終濃度（） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 0.2M磷酸緩沖液磷酸緩沖液(ml) 50 50 50 50 50 50 50 25戊二醛水溶液戊二醛水溶液(ml) 4 6 8 10 12 16 20 雙蒸水加至雙蒸水加至(ml) 100 100 100 100 100 100 100 B、 0.1M0.1M二甲砷酸鈉緩沖戊二醛固定液二甲砷酸鈉緩沖戊二醛固定液 戊二醛最終濃度（）戊二醛最終

14、濃度（） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.01.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.2M 0.2M二甲砷酸鈉緩沖液（二甲砷酸鈉緩沖液（ml) 50 50 50 50 50 ml) 50 50 50 50 50 25% 25%戊二醛水溶液戊二醛水溶液( (ml) 4 6 8 10 12ml) 4 6 8 10 12 雙蒸水加至雙蒸水加至( (ml) 100 100 100 100 100ml) 100 100 100 100 100 對生物樣品的固定，戊二醛的常用濃度是2.5 ，有時為了加快固定的速度，也常用3.0的。使用的量一般是樣品總體積的1020倍，對大多數(shù)樣品固定的時間是12小時

15、以上 ，也可在本固定液中把樣品保存一段時間，但不能太長。 C C、2%2%鋨酸儲存液的配制鋨酸儲存液的配制 鋨酸一般是0.5克為一個包裝，在使用時大多數(shù)情況下，先配制成2%的水溶液儲存，用時再加等量的0.2M的緩沖液配成1%的使用。 由于戊二醛是還原劑，鋨酸是氧化劑。所以，如果對同一樣品進行戊二醛和鋨酸雙固定時，戊二醛固定結(jié)束，一定要用與配制戊二醛相同濃度和PH值的緩沖液徹底清洗后（清洗的時間一般在2小時以上），才能再用鋨酸固定。 鋨酸的使用濃度是1（用0.2M 緩沖液等比例稀釋儲存液）的水溶液，在本液中固定的時間不能太長，一般是1.52小時。鋨酸固定結(jié)束，一般用雙蒸水清洗樣品，直到把鋨酸清洗

16、干凈。 整個固定和清洗時間都應(yīng)在40C環(huán)境中進行（是為了避免液體體積發(fā)生變化，造成對組織微細(xì)結(jié)構(gòu)的損傷）。 三、清洗與脫水三、清洗與脫水 1 1、清洗：、清洗：在超薄切片制備技術(shù)中，清洗主要是指：當(dāng)用兩種化學(xué)性質(zhì)完全不同的固定液對同一樣品進行固定時，前一種固定液固定結(jié)束，一定要進行徹底清洗后，才能用另一種固定液進行固定。如戊二醛和鋨酸雙重固定，用戊二醛固定結(jié)束，必須用與配制戊二醛所用的相同濃度和相同PH值的緩沖液徹底清洗后，再用鋨酸固定。否則會發(fā)生不良反應(yīng)，對樣品造成不良影響，甚至損傷樣品，使實驗失??；再就是用鋨酸固定結(jié)束，要用雙蒸水徹底清洗后，才能進行脫水。 清洗的時間一般不少于2小時，中間

17、要換幾次新清洗液。 2 2、脫水：、脫水：用脫水劑逐漸取代掉組織中水分的過程叫脫水。 常用的脫水劑有酒精、丙酮。因丙酮對組織內(nèi)的物質(zhì)有抽提作用，因此，在制作超薄切片時，組織的脫水都用酒精，很少用丙酮。 脫水是采用逐漸提高脫水劑濃度的方法對樣品進行逐級脫水。脫水劑設(shè)置的濃度級差一般有：50、70、80、90、100（2次）。在每級中脫水的時間據(jù)材料的質(zhì)地不同有一定變化，動物組織一般每級20分鐘；植物樣品應(yīng)加長脫水的時間。對一些含水多，柔軟的樣品，應(yīng)適當(dāng)增加脫水劑的濃度級差，可從30開始脫水。 3 3、脫水時的注意事項、脫水時的注意事項（1）、整個脫水過程應(yīng)在較冷的環(huán)境中進行（要求4攝氏度）。（2

18、）、在更換液體的過程中一定要避免樣品的自然干燥。（3）、當(dāng)進入高濃度的脫水劑時，要及時蓋好容器的蓋子，防止空氣中的水分進入脫水劑，也要避免低濃度的脫水劑過多的帶入高濃度的脫水劑中。（4）、脫水一定要徹底、干凈。否則，會造成包埋劑不能滲透到組織細(xì)胞的每個部位，使制片失敗。 四、浸透與包埋四、浸透與包埋 1 1、置換：、置換：由于脫水劑酒精不能與包埋劑互溶，所以在浸透之前必須用既能和脫水劑互溶又能與包埋劑互溶的溶劑對經(jīng)過脫水的樣品進行處理（即置換），以便包埋劑滲透到組織細(xì)胞的各部位中。常用的置換劑是環(huán)氧丙烷。置換的方法是逐漸提高置換劑的濃度，使樣品最后進入純置換劑中，一般用純酒精和環(huán)氧丙烷等量混合

19、液處理樣品2030分鐘，再用純環(huán)氧丙烷處理30分鐘。即可進行包埋劑的浸透處理。 2 2、浸透：、浸透：用包埋劑逐漸取代組織中的置換劑并滲透到細(xì)胞的各個部位的過程叫浸透。 （1）包埋劑的種類及配方）包埋劑的種類及配方 A A、包埋劑的選擇條件：、包埋劑的選擇條件：包埋劑的選擇在超薄切片樣品制備中很關(guān)鍵，因為它是滲入到組織的各個部位，固化后起支撐作用。如果選擇的包埋劑不合適，在固化后會出現(xiàn)空泡或硬度和組織的硬度有差別，這樣就起不到很好的支撐作用，甚至?xí)骨衅?。一種優(yōu)良的包埋劑應(yīng)具備：包埋劑單體的粘度低，這樣可便于向組織內(nèi)滲透；固化后收縮率小，可降低對組織的收縮損傷；耐電子束轟擊；在高真空中不便

20、形、不升華；固化后有良好的切削性能。 B B、包埋劑的種類：、包埋劑的種類：根據(jù)上述選擇條件，可用于制作超薄切片的包埋劑有三種：甲基丙烯酸酯類；聚脂樹脂類和環(huán)氧樹脂類。常用的是環(huán)氧樹脂（EPON812），它是從國外進口的，它是一種塑料單體，為淡黃色的粘稠的液體。 它必須與一定比例的催化劑、固化劑（也叫交聯(lián)劑）混合后才能使用。常用的催化劑有：2，4，6三（二甲基苯酚）（簡稱DMP30），還有二乙基苯胺，乙二胺等；固化劑有：十二烷基琥珀酸酐（簡稱DDSA)和甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐（簡稱MNA)；使用不同比例的固化劑可以改變包埋劑硬化后的硬度范圍。 有時為了改變包埋劑的切削性能，在配方中加少量的增

21、塑劑（也叫增韌劑），如鄰苯二甲酸二丁酯（簡稱DBP）。 C C、常見的包埋劑配方有：、常見的包埋劑配方有： 國產(chǎn)618樹脂（無錫樹脂廠生產(chǎn)）配方 618樹脂 6ml DDSA 4ml DBP 0.5ml DMP-30 0.1ml 適合不同季節(jié)使用的適合不同季節(jié)使用的EPON812EPON812配方配方 適合冬季 適合夏季 EPON812 10.7ml 11.5ml MNA 5.9ml 7ml DDSA 6.6ml 6.5ml DMP-30 0.44ml 0.37ml 不同硬度的包埋劑配方不同硬度的包埋劑配方 成分 A B C D E EPON812 9.44ml 9.44ml 9.44ml 9

22、.44ml 9.44ml DDSA 20.0ml 15.0ml 10.0ml 5.0ml 0.0ml MNA 0.0ml 3.33ml 6.67ml 10.0ml 13.33ml DMP-30 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 軟 硬 改良EPON812配方 EPON812 13ml DDSA 8ml MNA 7ml DMP30 0.42ml 包埋劑在配制時，要在干燥的環(huán)境中進行；對上述藥品逐一進行均勻的混合；由于包埋劑是粘稠的液體，在混合時一定要避免產(chǎn)生氣泡。（2 2）、浸透的方法）、浸透的方法 是采用逐漸提高包埋劑濃度的方法，把組織內(nèi)的置換劑徹底取代掉。對動組織的

23、浸透一般是：環(huán)氧丙烷與包埋劑等量混合液浸透處理1224小時，純包埋劑浸透1224小時就可以了。 植物材料的浸透用時間較動物材料長很多，一般是3比1的環(huán)氧丙烷比包埋劑處理24小時或更長；環(huán)氧丙烷與包埋劑等量混合液浸透2472小時；純包埋劑浸透2次，每次2472小時。有些木質(zhì)化程度高的材料，每步驟還需要加長時間。 不管是動物材料還是植物材料，浸透是很關(guān)鍵的一步，要使純包埋劑滲入到組織細(xì)胞的各個部位，浸透一定要徹底、完全。只有這樣包埋劑固化后，才能使組織細(xì)胞得到很好的支撐，才能切出較理想的切片。 另外，因為動物組織和植物組織的質(zhì)地（硬度）不同，所使用的包埋劑的配方也有差別，植物組織的浸透要選用較硬的

24、配方。 整個浸透的過程也要在較干燥的環(huán)境中進行，包埋劑易吸收空氣中的水分。 3 3、包埋與聚合、包埋與聚合 （1 1）、準(zhǔn)備工作：）、準(zhǔn)備工作：主要是包埋容器的準(zhǔn)備，在包埋前應(yīng)對所使用的包埋容器進行干燥處理。 在制作超薄切片時，包埋使用的容器有：藥用膠囊、專用錐形底塑料包埋容器、多孔的橡膠包埋模板。 （2 2）、包埋的方法）、包埋的方法 A A、常規(guī)包埋法：、常規(guī)包埋法：本法適用于所有塊狀組織。操作方法是將干燥的包埋容器的尖端滴加一滴純包埋劑，用牙簽挑一塊浸透好的樣品放入包埋容器的尖部，然后緩緩加滿包埋劑，加入寫好的標(biāo)簽，使有字的一面緊貼包埋容器的內(nèi)壁，蓋好容器的蓋子，放入專用的聚合儀或恒溫培

25、養(yǎng)箱內(nèi)進行聚合處理。 聚合就是使包埋劑硬化的過程，一般操作是35度1224小時；45度1224小時；60度1224小時。包埋劑在35度時不硬化，所以在此溫度下仍有浸透的作用，一些植物材料可在35度中多放一些時間，可加強浸透的效果，進入45度就開始硬化。 B B、倒口包埋法：、倒口包埋法：本方法適用于單細(xì)胞、單層培養(yǎng)細(xì)胞和單個微小動、植物體的包埋。操作方法是將浸透好的材料放在一載玻片或蓋玻片上，將包埋膠囊內(nèi)加滿包埋劑，放入標(biāo)簽后，倒扣在有樣品的位置上，把它們一起放入聚合儀或恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行聚合，聚合結(jié)束后用低溫冷凍的辦法去掉載玻片或蓋玻片。 C C、二次包埋法、二次包埋法：這種包埋方法只是在彌補

26、上一次聚合后樣品制備的不足時使用的一種方法。一般是樣品的切片性能不好時，把有樣品的部位切下，再放入包埋容器內(nèi)加滿新的包埋劑，再進行聚合，以彌補上次的制樣的不足。有時也用于較大的單個細(xì)胞的二次包埋。（3 3）、包埋時的注意事項）、包埋時的注意事項 A、包埋的容器一定要干燥。 B、所有藥品要注意防潮，最好存放在干燥器 中。 C、配制包埋劑時，每加一種藥品要充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，在加另一種藥品。 D、配好的包埋劑不能有氣泡。 E、聚合好的包埋塊要存放在干燥器中，以防止受潮。 五、超薄切片 包埋聚合結(jié)束，組織和包埋劑成為一體的、具有一定硬度的包埋塊了。在進行超薄切片之前，還需完成包埋塊的修整、在支持銅網(wǎng)上做

27、上支持膜、制作玻璃刀等工作。 1、包埋塊的修整：包埋塊的修正有人工修塊方法和機械修塊法。人工修塊，是用單面刀片對包埋塊進行修整，一般操作熟練的技術(shù)人員，都是用這種方法。 機械修塊法是用修塊機修塊，這種方法修出的包埋塊形狀規(guī)則，但修快速度很慢，熟練者一般不用。不管采用哪種方法，修正好的包埋塊的形狀應(yīng)如下圖所示： 修塊機 2 2、支持膜的制備、支持膜的制備 （1 1）、銅網(wǎng)的選擇及清洗：）、銅網(wǎng)的選擇及清洗：超薄切片必須撈在特制的金屬載網(wǎng)（其作用如同石蠟切片的載玻片）上，才能在電鏡下觀察。電鏡使用的載網(wǎng)，根據(jù)制作材料的不同有多種。如尼龍網(wǎng)、銅網(wǎng)、鎳網(wǎng)等，它們的大小都是相同的，一般直徑為3毫米。各種

28、材質(zhì)的載網(wǎng)根據(jù)在上面存有的網(wǎng)眼的多少不同，可分為單孔、雙孔、多孔、100目、 200目、300目 1000目。在生物樣品 制備中經(jīng)常用的載網(wǎng) 是200目銅網(wǎng)。 A A、銅網(wǎng)的清洗：、銅網(wǎng)的清洗：新銅網(wǎng)在使用前先用丙酮浸泡，再用酒精洗幾次，然后放在鋪有干凈濾紙的培養(yǎng)皿中干燥備用。 一些使用過的舊銅網(wǎng)，先在二氯乙烷中浸泡30分鐘，然后用超聲波清洗器處理25分鐘，再用二氯乙烷洗幾次，換酒精再超聲洗一次，用無水酒精洗2次，放培養(yǎng)皿中干燥。 B B、支持膜的制作：、支持膜的制作：在干凈的載網(wǎng)上覆蓋上一層薄膜，用以支持所要觀察的切片，這層膜就叫支持膜。支持膜的厚度一般為20nm. 支持膜有碳膜、火棉膠膜和

29、Formva（聚乙烯醇縮甲醛）膜，最 常用的是Formvar膜。 FormvarFormvar膜的制作方法膜的制作方法：先配制0.20.5的Formvar二氯乙烷（或氯仿）溶液。取一直徑8cm的結(jié)晶皿（或培養(yǎng)皿）盛滿蒸餾水，把一干凈光滑的載玻片（或制刀用的玻璃條）浸入上述溶液中，然后垂直提出，放置在干燥（相對濕度不能高于30）的地方，干燥后載玻片上就結(jié)有一層薄膜。用鋒利的刀片在載玻片的邊緣將膜劃破。然后將帶膜的玻片的前端與水面呈45度角與結(jié)晶皿中的水接觸，并慢慢向水中壓玻片，這時由于水的張力作用，膜會逐漸脫離玻片漂于水的表面，取出玻片。將干凈的銅網(wǎng)有光澤的一面向著漂在水面上的膜，均勻的擺放在膜

30、上，然后用一與膜等寬的擦鏡紙，平整的放在帶有銅網(wǎng)的模上，等水完全濕透紙，用鑷子將紙?zhí)岢?，帶有支持膜的銅網(wǎng)就沾在紙上。將有銅網(wǎng)面向上放在干凈的培養(yǎng)皿中干燥備用。 具體過程見下圖示： 火棉膠膜和碳膜因為一般不用，其制作方法在此不作介紹。有興趣者可看有關(guān)的參考書。 3 3、玻璃刀的制作：、玻璃刀的制作：在超薄切片技術(shù)中，所用的切片刀有兩種，一種是鉆石刀，它價格昂貴，常用于硬質(zhì)材料的切片（如植物、動物的骨骼材料等）；另一種是最常用的玻璃切片刀。制作玻璃刀用的玻璃是特制的專用玻璃，要求含硅量達到75以上，無雜質(zhì)，無氣泡，光潔度好，厚度在46.5mm。寬度是25mm的玻璃條。 制作玻璃刀有兩種方法，即手工

31、制作法和制刀機制作法，手工制作法成功率很低，一般不用，各電鏡室都用制刀機來制作玻璃切片刀。制刀機的結(jié)構(gòu)見下圖所示。 LKB的制刀機 LKB制刀機模式圖 制刀時首先用制刀機將玻璃條切割成25x25mm的方塊，然后再用制刀機把一塊方形玻璃制作成兩把切片刀（制刀的具體步驟不作詳述）。 制作出的刀應(yīng)檢制作出的刀應(yīng)檢 查用于切片的刀刃查用于切片的刀刃 是否合乎要求。是否合乎要求。 刀的質(zhì)量優(yōu)劣刀的質(zhì)量優(yōu)劣 見右圖所示見右圖所示： 切片的玻璃刀要用新制的，如果制的刀不用，時間長了刀刃會變得不鋒利了。 選好可使用的刀后，需要在刀刃的前面制作一個水槽，切片時把里面加滿雙蒸水，使切出的片子漂在水面上，以便進行收

32、集和撈片。制作水槽的方法見下圖所示： 做水槽的材料有專用的帶狀金屬箔，現(xiàn)在多數(shù)是用醫(yī)用膠布條，做好水槽后用牙科蠟封固膠布與玻璃刀之間的縫隙。在做水槽的過程中不能用手觸摸膠布帶，以防有污物粘在上面爾后污染了切片。 4 4、超薄切片：、超薄切片：以上的工作準(zhǔn)備好后就可以進行切片了。 （1 1）、超薄切片機的種類）、超薄切片機的種類 ： 超薄切片用的設(shè)備叫超薄切片機，它主要是由樣品推進裝置；切片刀座；立體觀察鏡；照明裝置；切片厚度選擇裝置和機座組成。根據(jù)對樣品的推進原理不同，超薄切片機可分為兩種：一種是機械推進式。一種是機械推進式。它對樣品的推進是靠機械作用實現(xiàn)的，這種超薄切片機如奧地利衛(wèi)永 公司生

33、產(chǎn)的ULTRACUT E型。 另一種是熱膨脹式超薄切片機另一種是熱膨脹式超薄切片機。這種切片機對樣品的推進原理是：在樣品臂上饒有導(dǎo)電線圈，通電后產(chǎn)生熱量使樣品臂受熱膨脹，向前推進樣品；斷電后樣品臂不受熱保持原位，這樣循環(huán)往復(fù)，就可根據(jù)所選切片厚度切出所需要的超薄切片。 （2）、超薄切片的步驟）、超薄切片的步驟 A、將修好的包埋塊安裝到超薄切片機的樣品夾持器上，并用固定旋鈕加緊。 B、將帶有水槽的切片刀安裝到刀座上 ， 奧地利衛(wèi)永公司的 ULTRACUT-E型超薄切片機 用固定旋鈕緊固好，并將水槽內(nèi)加適量的雙蒸水（既不能太少也不能太滿）。 C、調(diào)節(jié)樣品的前面（即切面）與刀刃的關(guān)系。 D、在切片厚

34、度控制器上調(diào)節(jié)切片的厚度，一般開始使用半薄切片的厚度進行預(yù)切（目的是將前端的包埋劑和最表面的樣品切掉），然后再選擇到所要的厚度進行超薄切片。 C、將超薄切片機從手動調(diào)到自動，開始切片。 超薄切片切出的片子都漂浮在水槽內(nèi)，我們雖然在切片前已經(jīng)在厚度調(diào)節(jié)器上選擇了所要的厚度。但因包埋塊的切削性能、環(huán)境因素的影響，所切出的片子并不是每片都合格。這就需要在立體放大鏡的幫助下，跟據(jù)切片的干涉顏色來挑選合格的切片。 （3）、合格切片的選擇：）、合格切片的選擇：透射電鏡所觀察的切片的最佳厚度是5070nm，此厚度的片子在水面上的顏色是銀灰色。當(dāng)水槽的水面上布滿切片后，用眉筆將其它顏色的切片挑出，把銀灰色的切

35、片集中到水槽的一個區(qū)域，即可進行撈片。 干涉色與切片厚度的關(guān)系干涉色與切片厚度的關(guān)系 切片的顏色 切片的厚度(nm) 暗灰色 40以下 灰色 4050 銀灰色 5070 金黃色 7090 紫色 90以上 六、撈片六、撈片 把厚度合格的切片貼附到帶有支持膜的載網(wǎng)上的過程叫撈片。具體操作是：具體操作是：把厚度合格的切片集中到水槽的一個部位，用鑷子夾一小塊濾紙沾少許二甲苯逐漸靠近水面上的切片，在二甲苯蒸氣的作用下，切片在水面上展得很平。這時用尖頭鑷子夾一帶有支持膜的銅網(wǎng)，使有膜的一面對準(zhǔn)切片并逐漸接近切片，切片就被吸附到銅網(wǎng)上，用濾紙小心的吸去銅網(wǎng)上的水分（不要損傷了切片），放入專用的切片盒內(nèi)備用（

36、注意：要始終記住有切片的面）。 七、超薄切片的染色（電子染色）七、超薄切片的染色（電子染色） 1 1、染色的目的：、染色的目的：由于生物組織是由低原子序數(shù)的物質(zhì)組成，超薄切片在染色之前反差是很弱的，不能直接在透射電鏡下觀察。因此必須進行增強反差處理，也就是樣品要經(jīng)過電子染色后才能觀察。超薄切片的染色劑多數(shù)是重金屬鹽類化合物，如鈾、鉛、鋨、鎢等。重金屬鹽具有很強的電子散射能力，生物切片經(jīng)過它們浸染后，不同的結(jié)構(gòu)成分吸附有不同數(shù)量或不同種類的重金屬離子，結(jié)合重金屬離子多的區(qū)域，對電子的散射能力強，在電鏡下觀察呈現(xiàn)電子致密的黑色。反之，對電子的散射能力弱，圖像顏色較淡；沒有結(jié)合重金屬離子的區(qū)域為電子透明區(qū)?？傊?，樣品經(jīng)電子染色處理，不僅能增強電子反差，也能增加圖像的清晰度，使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)充分的顯示出來。 2 2、染色劑的種類及其配制：、染色劑的種類及其配制：生物樣品超薄切片的染色，常用的染色劑有醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛兩種。前者主要是能增強細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)和結(jié)締組織的電子襯度；后者則主要是可以提高細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、