細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)介紹

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)介紹水水的制備：水的制備： 細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。子和其他的雜質(zhì)。 需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水 細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇 選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點建議可供參考：選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點建議可供參考： (1 (1 ）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時咨詢。咨詢。 (2) (2) 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基

2、不妨一試，許多培養(yǎng)基可其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。以適合多種細(xì)胞。 (3) (3) 根據(jù)細(xì)胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如根據(jù)細(xì)胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640 RPMI1640 。 (4) (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。 制備1000mlRPMI1640

3、培養(yǎng)基RPMI1640干粉培養(yǎng)基（1包）蒸餾水400ml磁力攪拌至完全溶解加三蒸餾水定容至1000ml在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成200ml/瓶，-20保存?zhèn)溆?。用前取一瓶溶解，?00ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。-細(xì)胞培養(yǎng)液 一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性無毒性 主要作用主要作用: :防止培養(yǎng)基防止培養(yǎng)基pHpH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫

4、離了5%CO25%CO2的環(huán)境，的環(huán)境，CO2CO2氣體氣體迅速逸出，迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此時可以維持，此時可以維持左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPESHEPESmmol/Lmmol/L使用時可向使用時可向100ml100ml培養(yǎng)液中加入培養(yǎng)液中加入2ml 2ml 濃縮液，終濃度為濃縮液，終濃度為20mmol/L 20mmol/L 谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺補(bǔ)充液 谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容基中都要添

5、加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，易降解，44下放置下放置7 7天即可分解約天即可分解約50%50%，所以都是，所以都是在使用前添加在使用前添加 配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi) 使用終濃度為使用終濃度為1-4mmol/L1-4mmol/L 一般配制為一般配制為100100倍濃縮液，即濃度為倍濃縮液，即濃度為200mmol/L200mmol/L（），（），配制方法為配制方法為 ： 谷

6、氨酰胺溶于三蒸水加至谷氨酰胺溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mmol/L200mmol/L的的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫3030），過濾除菌，），過濾除菌，分裝小瓶，分裝小瓶，-20-20保存，使用時可向保存，使用時可向100ml100ml培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺濃縮液，終濃度為加入谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mmol/L 1-4mmol/L 細(xì)胞計數(shù)及活力測定實驗原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。 具體操作： 1.蓋好蓋玻片：取血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋

7、在血球計數(shù)槽上。 2.制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：細(xì)胞懸液到一離心管中，加入臺盼藍(lán)染液（）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。 3.將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 4.統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，分別數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。 5.計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計算細(xì)胞密度： （細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml （ 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)

8、 2104 說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中乘以2因為細(xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。 公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： （長）（寬）（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3 欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為300 xg (300 xg (約約1,000rpm)1,000rpm)，5 - 10 5 - 10 分鐘，分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速，過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡將造成細(xì)胞死亡 細(xì)胞欲冷凍保存時，細(xì)胞冷凍管細(xì)胞欲冷凍保存時，細(xì)

9、胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x101x106 6 cells/ml vialcells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以，融合瘤細(xì)胞則以5x105x106 6 cells/ml vial cells/ml vial 為宜為宜 冷凍管應(yīng)如何解凍？冷凍管應(yīng)如何解凍？ 取出冷凍管后，須立即放入取出冷凍管后，須立即放入37 37 C C 水槽水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 1 分鐘分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污

10、染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂全，預(yù)防冷凍管之爆裂 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否是否應(yīng)馬上去除應(yīng)馬上去除DMSODMSO？ 除少數(shù)特別注明對除少數(shù)特別注明對DMSO DMSO 敏感之細(xì)胞外，敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml10-15ml新新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO DMSO 即可，如此可避即可，如此可避

11、免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題問題培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5 % 5 % 或或10% CO210% CO2？或根本沒有影響？或根本沒有影響？ 一般培養(yǎng)基中大都使用一般培養(yǎng)基中大都使用HCOHCO3 3- -/CO/CO3 32-2-/H/H+ + 作作為為pH pH 的緩沖系統(tǒng)，的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中而培養(yǎng)基中NaHCONaHCO3 3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的COCO2 2 濃度濃度 當(dāng)培養(yǎng)基中當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCONaHCO3 3 含量為每公升含量為每公升3.7 g 3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用時，細(xì)

12、胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO10 % CO2 2；當(dāng)培；當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)基中NaHCONaHCO3 3 為每公升為每公升1.5 g 1.5 g 時，時， 則則應(yīng)使用應(yīng)使用5 % CO5 % CO2 2 培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？ 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮