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文檔簡介
1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)介紹水水的制備:水的制備: 細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈,不含有離細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈,不含有離子和其他的雜質(zhì)。子和其他的雜質(zhì)。 需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水 細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇 選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn),有幾點建議可供參考:選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn),有幾點建議可供參考: (1 (1 )建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞)建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn),或在購買細(xì)胞株時首選的培養(yǎng)基??梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn),或在購買細(xì)胞株時咨詢。咨詢。 (2) (2) 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基
2、不妨一試,許多培養(yǎng)基可其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試,許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。以適合多種細(xì)胞。 (3) (3) 根據(jù)細(xì)胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如根據(jù)細(xì)胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640 RPMI1640 。 (4) (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞,觀察其生長狀態(tài),可用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞,觀察其生長狀態(tài),可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷,根據(jù)實驗結(jié)果以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷,根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基,這是最客觀的方法,但比較繁瑣。選擇最佳培養(yǎng)基,這是最客觀的方法,但比較繁瑣。 制備1000mlRPMI1640
3、培養(yǎng)基RPMI1640干粉培養(yǎng)基(1包)蒸餾水400ml磁力攪拌至完全溶解加三蒸餾水定容至1000ml在超凈臺內(nèi)無菌條件下,用滅菌后的并置有孔徑濾膜的過濾器除菌,并分裝成200ml/瓶,-20保存?zhèn)溆?。用前取一瓶溶解,?00ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%,即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。-細(xì)胞培養(yǎng)液 一種弱酸,中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸,對細(xì)胞一種弱酸,中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸,對細(xì)胞無毒性無毒性 主要作用主要作用: :防止培養(yǎng)基防止培養(yǎng)基pHpH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下,觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了下,觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫
4、離了5%CO25%CO2的環(huán)境,的環(huán)境,CO2CO2氣體氣體迅速逸出,迅速逸出,pHpH迅速升高,若加了迅速升高,若加了HEPESHEPES,此時可以維持,此時可以維持左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPESHEPESmmol/Lmmol/L使用時可向使用時可向100ml100ml培養(yǎng)液中加入培養(yǎng)液中加入2ml 2ml 濃縮液,終濃度為濃縮液,終濃度為20mmol/L 20mmol/L 谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺補(bǔ)充液 谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用,合成培養(yǎng)谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用,合成培養(yǎng)基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容基中都要添
5、加,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解,易降解,44下放置下放置7 7天即可分解約天即可分解約50%50%,所以都是,所以都是在使用前添加在使用前添加 配制好的培養(yǎng)液(含谷氨酰胺)在配制好的培養(yǎng)液(含谷氨酰胺)在44放置放置2 2周以上周以上時,要重新加入原來量的谷氨酰胺,故需單獨配制時,要重新加入原來量的谷氨酰胺,故需單獨配制谷氨酰胺,以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)谷氨酰胺,以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi) 使用終濃度為使用終濃度為1-4mmol/L1-4mmol/L 一般配制為一般配制為100100倍濃縮液,即濃度為倍濃縮液,即濃度為200mmol/L200mmol/L(),(),配制方法為配制方法為 : 谷
6、氨酰胺溶于三蒸水加至谷氨酰胺溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mmol/L200mmol/L的的溶液,充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫溶液,充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫3030),過濾除菌,),過濾除菌,分裝小瓶,分裝小瓶,-20-20保存,使用時可向保存,使用時可向100ml100ml培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺濃縮液,終濃度為加入谷氨酰胺濃縮液,終濃度為1-4mmol/L 1-4mmol/L 細(xì)胞計數(shù)及活力測定實驗原理:當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目,即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。 具體操作: 1.蓋好蓋玻片:取血球計數(shù)板,將特制的蓋玻片蓋
7、在血球計數(shù)槽上。 2.制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液:細(xì)胞懸液到一離心管中,加入臺盼藍(lán)染液()或苯胺黑,活細(xì)胞不會被染色,加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。 3.將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板:將待測細(xì)胞懸液吹均勻,然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。 4.統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù):將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動計數(shù)板,當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后,分別數(shù)出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。 5.計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計算細(xì)胞密度: (細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml ( 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)
8、 2104 說明:公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中乘以2因為細(xì)胞懸液于染液是1:1稀釋。 公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為: (長)(寬)(高)0.1mm3 而 1ml1000mm3 欲將一般動物細(xì)胞離心下來,其欲將一般動物細(xì)胞離心下來,其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速? 欲回收動物細(xì)胞,其離心速率一般為欲回收動物細(xì)胞,其離心速率一般為300 xg (300 xg (約約1,000rpm)1,000rpm),5 - 10 5 - 10 分鐘,分鐘, 過高之轉(zhuǎn)速,過高之轉(zhuǎn)速, 將造成細(xì)胞死亡將造成細(xì)胞死亡 細(xì)胞欲冷凍保存時,細(xì)胞冷凍管細(xì)胞欲冷凍保存時,細(xì)
9、胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度? 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x101x106 6 cells/ml vialcells/ml vial,融合瘤細(xì)胞則以,融合瘤細(xì)胞則以5x105x106 6 cells/ml vial cells/ml vial 為宜為宜 冷凍管應(yīng)如何解凍?冷凍管應(yīng)如何解凍? 取出冷凍管后,須立即放入取出冷凍管后,須立即放入37 37 C C 水槽水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1 1 分鐘分鐘內(nèi)全部融化,并注意水面不可超過冷凍內(nèi)全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污
10、染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預(yù)防冷凍管之爆裂全,預(yù)防冷凍管之爆裂 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時, 是否是否應(yīng)馬上去除應(yīng)馬上去除DMSODMSO? 除少數(shù)特別注明對除少數(shù)特別注明對DMSO DMSO 敏感之細(xì)胞外,敏感之細(xì)胞外, 絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),在解凍之后,應(yīng)直接放入含有在解凍之后,應(yīng)直接放入含有10-15ml10-15ml新新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO DMSO 即可,如此可避即可,如此可避
11、免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題問題培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5 % 5 % 或或10% CO210% CO2?或根本沒有影響?或根本沒有影響? 一般培養(yǎng)基中大都使用一般培養(yǎng)基中大都使用HCOHCO3 3- -/CO/CO3 32-2-/H/H+ + 作作為為pH pH 的緩沖系統(tǒng),的緩沖系統(tǒng), 而培養(yǎng)基中而培養(yǎng)基中NaHCONaHCO3 3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的COCO2 2 濃度濃度 當(dāng)培養(yǎng)基中當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCONaHCO3 3 含量為每公升含量為每公升3.7 g 3.7 g 時,細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用時,細(xì)
12、胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO10 % CO2 2;當(dāng)培;當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)基中NaHCONaHCO3 3 為每公升為每公升1.5 g 1.5 g 時,時, 則則應(yīng)使用應(yīng)使用5 % CO5 % CO2 2 培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理? 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,稀釋細(xì)胞濃度即可,若培養(yǎng)液角瓶中,稀釋細(xì)胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時,可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,太多時,可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶, 加入新鮮
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