AD自噬改動標(biāo)紅

1、二苯乙烯昔通過抑制的Beclin-1、LC3-H表達改善APP695V717I轉(zhuǎn)基因鼠的行為學(xué)障礙羅紅波，石向群，郭建魁，張志強，汪泳，李蕓，尹榕（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅省蘭州市730050）【摘要】目的探討在APP695V7171轉(zhuǎn)基因鼠模型中，二苯乙烯苜（TSG）對大鼠行為學(xué)的保護作用及其對自噬分子Beclin-1、LC3-H的表達影響。方法選取10月齡APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠40只，隨機數(shù)字表法分為藥物組組、模型組，各20只，藥物組給予TSG灌胃1個月，同背景同月齡C57BL/6J小鼠為正常對照組。行為學(xué)檢測應(yīng)用Morris水迷宮實驗和Y電迷宮實驗。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及

2、免疫印跡法檢測海馬神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-皿的mRNA及蛋白表達變化。結(jié)果在模型組中，大鼠Y電迷宮躲避所需的電刺激次數(shù)增加，Morris水迷宮測試中潛伏期延長，游泳路程增加及穿越平臺次數(shù)減少；Beclin-1和LC3-H的mRNA及蛋白的表達增高，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）;TSG藥物十預(yù)后，大鼠躲避所需的電刺激次數(shù)減少，潛伏期縮短，游泳路程縮短，穿越平臺次數(shù)增加；Beclin-1和LC3-皿的mRNA及蛋白的表達較模型組下降（P0.05）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論二苯乙烯苜可通過下調(diào)自嗜通路中Beclin-1和LC3-H的表達，以抵抗A6的神經(jīng)蠹性作用對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功

3、能的損害，從而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間定向等行為學(xué)表現(xiàn)?！娟P(guān)鍵詞】APP轉(zhuǎn)基因小鼠；自噬；二苯乙烯苜；行為學(xué)阿爾茨海默?。ˋlzheimersdiseaseAD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要的病理學(xué)特征之一是腦組織中出現(xiàn)大量老年斑1。老年斑主要由6-淀粉樣蛋白（6-amyloid,A6）形成,A6是通過淀粉樣樣前體蛋白（APP）的異常剪切、折疊后所形成，在細胞內(nèi)，對這種異常折疊的蛋白質(zhì)，細胞可通過泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasomepathway,UPP）和自噬溶酶體途徑來調(diào)控蛋白、細胞器的降解，從而保證蛋白質(zhì)的正常工作，維持細胞功能的正常運行。有學(xué)者早期研究發(fā)現(xiàn)AD患

4、者在病理上表現(xiàn)為大量囊泡的堆積，但這種表現(xiàn)的機制及其在AD發(fā)病機制中的作用卻沒有得到明確的闡述；2006年，有學(xué)者建立自噬途徑的重要蛋白Apg5/Apg7基因敲除的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)該模型表現(xiàn)出神經(jīng)變性疾病的一些表型，使得自噬途徑在神經(jīng)變性疾病得到了關(guān)注和重視2-3。本實驗采用APP695V717I轉(zhuǎn)基因AD動物模型觀察大鼠海馬神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-II的表達情況并探討其意義。AD患者的學(xué)習(xí)記憶及工作能力的逐漸喪失給家庭及社會帶來沉重的負擔(dān)，但目前其治療尚無十分有效方法與藥物。研究顯示何首烏的主要有效成分之一（2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-0-6-D葡萄糖苜（2,3,5

5、,4-tetrahydroxy-stilbene-2-glycoside,二苯乙烯苜,TSG）能減少6-淀粉樣肽誘導(dǎo)的老年斑沉積，改善癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，降低淀粉樣前體蛋白（APP）的表達水平。我們通過觀察APP695V7171轉(zhuǎn)基因鼠的行為學(xué)表現(xiàn)及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-H在海馬的表達情況并探討其意義，進一步揭示AD新的發(fā)病機制，以及何首烏提取物二苯乙烯苜治療AD的主要作用機制及藥物靶點。材料和方法一、材料1. 實驗動物分組及十預(yù)：10月齡APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠40只，雌雄各半（許可證號01-3001）,及20只年齡匹配的同背景C57BL/6J小鼠，雌雄各半（作

6、為正常對照），均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究中心。轉(zhuǎn)基因小鼠隨機數(shù)字表法分為TSG組、模型組，各20只。藥物組給予TSG灌胃1個月，每天1次，灌胃量按5ml/kg計算。正常對照組給予生理鹽水灌胃。2. 主要試劑和藥物：Beclin-1和LC3-皿一抗購于Stressge公司；引物自行設(shè)計，由上海華大基因有限公司合成；Trizol、TacB、逆轉(zhuǎn)錄酶購自MBI公司。二苯乙烯苜為從何首烏中提取分離的干粉，含量為68%(湖南中醫(yī)藥研究所提供)，實驗時用水溶解為100mg/kg的濃縮液。二、方法刪掉“大鼠模型的建立、取材及干預(yù)”行為學(xué)檢測：(1)Y電迷宮電擊實驗：電擊次數(shù)表示其學(xué)習(xí)記憶的獲得能力，記

7、錄每只大鼠學(xué)會逃避電刺激次數(shù)，以30次為最大值計數(shù)。(2)Morris水迷宮定位航行實驗(PNT):每天08:00-11:00之間對每只大鼠進行訓(xùn)練，不選平臺所在象限作為入水點，按順時針方向把大鼠面向池壁放入水中，檢測大鼠隱匿平臺潛伏期。如果在規(guī)定的最長時間120s內(nèi)未到達平臺，則由實驗者將其引至平臺，逃避潛伏期記為120s,大鼠在平臺休息20s后進行下一次測試。觀察并記錄動物找到并爬上平臺的潛伏期、游泳路程及游泳軌跡。3d訓(xùn)練結(jié)束后將大鼠按組別進行造模。丁制模后21dH行PNT。(3)Morris水迷宮空間探索試驗(SPT):各組大鼠最后一次PNT后撤除平臺，將大鼠從最后1次入水點面向池壁放

8、入水中，使大鼠在水迷宮中連續(xù)游泳，記錄大鼠120s內(nèi)穿越原平臺平面的次數(shù)。1. 超微結(jié)構(gòu)檢測：分離海馬組織后，磷酸鹽緩沖夜(PBS)洗滌2次，4%戊二醛固定，冷卻后切塊，2%餓酸固定，梯度丙酮脫水，浸泡，包埋，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測mRNA表達：依據(jù)Medline基因文庫自行設(shè)計引物，目的基因Beclin-1(162bp),上游弓I物：5-CCCTACAGGATGGATGTGGAGAAAG-3，下游弓I物：5-ATTGTGAGGACACCCAAGCAAGACC-3;目的基因LC3-U(136bp),上游弓I物：5-ACCAAGCCTTC

9、TTCCTCC-3，下游引物:5-TGTCCCGAATGTCTCCTG3-3;內(nèi)參照6-actin(100bp),上游引物：5-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCTA-3下游引物：5-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于紫夕卜投射燈下觀察結(jié)果并拍照。2. 免疫印跡法(Westernblot)測蛋白表達：密度梯度離心法提取蛋白，將海馬組織轉(zhuǎn)移到勻漿器中，加裂解液勻漿，離心10min(2400r/min,半徑13.5cm)，取上活，繼續(xù)離心15min(轉(zhuǎn)速12000r/min,半徑13.5cm),取上札再離心30min(15000r/min,半

10、徑13.5cm)，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，用二奎琳甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度；樣品與等體積的上樣緩沖液混勻，煮沸變性，用10%十二烷基硫酸鈉聚-丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，與一抗孵育，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育，ECL試劑盒進行化學(xué)發(fā)光檢測，JS-300凝膠圖像儀掃描分析處理。三、統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)用SPSS12.瞅件處理。計量資料用又s表示，兩組問比較用t檢驗，多組獨立樣本比較用方差分析。結(jié)果刪掉“模型組大鼠腦組織切片染色結(jié)果”一、Y電迷宮檢測與對照組比較，模型組躲避電刺激數(shù)明顯增加(t=10.0884,P0.01),

11、藥物組躲避電刺激數(shù)增加(t=2.7781,P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，經(jīng)TSG干預(yù)，藥物組學(xué)會躲避所需的電刺激顯著減少(t=11.1755,P0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。二、Morris水迷宮檢測與對照組相比，模型組和藥物組小鼠的Morris水迷宮測試游泳潛伏期(t=14.4648,P0.01)及路程均增加(t=5.6550,P0.01)，穿越平臺次數(shù)下降明顯(t=15.5895,P0.01),差別隨時間的延長而加大；與模型組比較，藥物組的潛伏期縮短(t=5.5023,P0.01)，游泳路程縮短(t=2.2341,P0.05)，穿越程臺次數(shù)增加(t=4.8163,P

12、0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1表1大鼠水迷宮行為學(xué)比較比較(xS)n()()()對照組2017.03+1.233.96+1.0518.13+4.15模型組2032.15+4.51a8.30+3.02a3.09+1.18a藥物組2025.26+3.76ab6.08+3.26ac4.82+1.09ac注：與對照組比較：aPV0.05；與模型組比較：cPV0.05三、大鼠海馬CA1區(qū)電鏡下自噬現(xiàn)象對照組：神經(jīng)細胞胞膜完整，胞漿基質(zhì)電子密度均勻，胞漿內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)活晰可見，細胞質(zhì)內(nèi)線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，結(jié)構(gòu)大致正常，線粒體峪活楚、完整，核圓、核膜完整活晰，高爾基體無改變。模型組：胞漿內(nèi)線粒體結(jié)

13、構(gòu)欠活楚，峪消失，少數(shù)呈空泡樣變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)欠活晰，部分擴張，核膜較模糊不活，高爾基體大致正常，見圖2;胞內(nèi)可見大量自嗜泡形成,見圖3藥物組：胞漿內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)尚活楚，少數(shù)可見峪消失，空泡樣變很少見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚活晰，少數(shù)見輕度擴張，偶見個別胞漿水腫，核膜尚完整，高爾基體正常，見圖4。圖2電鏡X6000倍圖3電鏡X6000倍圖4電鏡X6000倍四、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-皿的mRNA及蛋白表達如圖5/6/7所示，將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并采用蛋白質(zhì)印跡方法分析，可見模型組的Beclin-1、LC3-UmRNA與其蛋白的表達趨勢一致，與對照組比較，差異有統(tǒng)

14、計學(xué)意義(P=0.000.05);TSG組在Beclin-1、LC3-U蛋白表達明顯降低，與模型組比較有顯著性差異(P=0.000.05),排除手術(shù)因素干擾。見圖8。表2大鼠Beclin-1、LC3-n的mRNA及蛋白相對表達(Xs,%)組別例數(shù)mRNA的相對表達%Beclin-1LC3-nBeclin-1LC3-對照組200.25+0.010.23+0.030.20+0.010.26+0.02模型組20a0.58士0.01a0.42士0.01a0.63士0.01a0.52+0.01藥物組20,ab0.41+0.02,ab0.34+0.01,ab0.49+0.02,ab0.36+0.02注：與

15、對照組比較：aPv0.05;與模型組比較：bPv0.05;Beclin-1actinABCD圖5:Beclin-1/6-actin的mRNA表達圖A:對照組B:藥物組C:模型組LC3-n3-actinABCD6:LC3-n/6-actin的mRNA表達A:對照組B:藥物組C:模型組圖7:Beclin-1、LC3-n/6-actin的蛋白表達A:對照組B:藥物組C:模型組老年斑是阿爾茨海默病(Alzheimers,AD)的主要組織病理變化，而6-淀粉樣肽(6-amyloid,A6)是老年斑的主要成分，因此，A6的神經(jīng)蠹性是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。A6由3943個氨基酸組成，來源丁淀粉樣前體蛋白

16、(Amyloidprecursorprotein,APP),如果各種危險因素導(dǎo)致APP的異常剪切,A6的空間構(gòu)象發(fā)生改變，就會導(dǎo)致A6異常聚集而產(chǎn)生神經(jīng)蠹性作用4。正常情況TAP的空間二級結(jié)構(gòu)以a螺旋為主，聚集性較弱，可被蛋白酶水解；如果A6構(gòu)象發(fā)生錯誤折疊，轉(zhuǎn)變?yōu)?折疊時，聚集性較弱，不易被蛋白酶水解，進而形成組織沉淀并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。因此，在分子水平上，AD勺疾病本質(zhì)是一種神經(jīng)變性構(gòu)象病，一種蛋白錯誤折疊并聚集的“蛋白構(gòu)象病”。蛋白構(gòu)象病的相同點是異常蛋白在細胞內(nèi)蓄積，而這些蛋白主要是依賴自噬途徑被降解，提示自噬障礙可能參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病。自噬溶酶體途徑可能通過活除細胞內(nèi)產(chǎn)生的細胞

17、蠹性物質(zhì)、失活的細胞器，再循環(huán)利用細胞中的氨基酸、核普酸等成分，減少對細胞的損害，從而有利丁挽救瀕臨死亡的細胞。LC3和Beclin-1是參與自噬體形成的特異性的重要基因5。LC3-U定位丁前自噬體和自噬體，使之成為自噬體的標(biāo)志分子。一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的LC3-U即被溶酶體中的水解酶降解。LC3-U含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比，可通過檢測細胞內(nèi)LC3-皿的含量變化，來判斷細胞狀態(tài)，判斷其自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制6。而Beclin-1還是參與自噬調(diào)控的重要基因，它可以通過提高細胞自噬來抑制腫瘤的生長，是候選的腫瘤抑制基因，其不僅與自噬調(diào)控通路有關(guān)，而且涉及細胞凋亡的調(diào)控，可能同

18、時參與兩種程序性細胞死亡過程7。因此，本研究用LC3-H和Beclin-1作為細胞發(fā)生自吞噬的標(biāo)志分子。在實驗中，WesterrftRT-PCR的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠的模型組海馬部位LC3、Beclin-1的mRNA及蛋白表達均明顯增高，說明APP轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的A6啟動自噬通路；推測A0在形成纖維化的過程中產(chǎn)生的神經(jīng)蠹性可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，細胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，促進細胞內(nèi)自噬來平衡應(yīng)激狀態(tài)A6,其前體6CTF、APP,及丫分泌酶。用丫分泌酶能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)移至自噬體中，而也有觀點認為自噬溶酶體途徑是產(chǎn)生蠹性A6的一個重要過程。在體內(nèi)和體外試驗中，Yu等8和LeBlanc等9發(fā)現(xiàn)在自噬

19、體內(nèi)存在rapamycin或去血活等方法來增強自噬功能后，A6的產(chǎn)生也大大增加。Haass等10研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)A6對細胞的損傷遠遠大于細胞外A6的作用。此外，通過自噬溶酶體途徑產(chǎn)生的A6,可以通過溶酶體降解，也可以被分泌到細胞外形成不可溶的異常聚集體。這些提示自噬溶酶體途徑障礙可能導(dǎo)致蠹性A6的產(chǎn)生增多，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和細胞外老年斑的形成。在前期的實驗中我們發(fā)現(xiàn)A6誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)的凋亡通路參與A6神經(jīng)蠹性對腦的神經(jīng)元損傷機理11。而目前的研究也發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時PERK信號通路促使某些蛋白質(zhì)如多聚谷氨酰胺polyQ72在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量堆積，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解系統(tǒng)；同時磷酸化eIF2a,上

20、調(diào)Atg12(autophagyprotein12形成Atg5-Atg12-Atg16復(fù)合物，引起LC3蛋白質(zhì)的膜轉(zhuǎn)位誘發(fā)自噬12。結(jié)合本實驗結(jié)果并回顧文獻，我們認為在AD的發(fā)病中，當(dāng)A6被細胞分泌至細胞外，形成纖維化的過程中，所表現(xiàn)的神經(jīng)蠹性開始起作用，A6可破壞細胞膜誘發(fā)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激乂會破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在短時間內(nèi)通過啟動未折疊蛋白保護通路如PERK等來保護對大腦造成的損傷，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激也使細胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊的幾率增加，導(dǎo)致了錯誤蛋白的異常剪切和積聚，這些異常剪切的蛋白可啟動細胞的LC3、Beclin-1自噬通路，但當(dāng)自噬無法降解過多的蛋白質(zhì)時，這部

21、分細胞可能因為這種過度的應(yīng)激導(dǎo)致通過特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Caspase1況亡途徑發(fā)生死亡。因此可見，分泌至細胞外的A6可誘導(dǎo)細胞內(nèi)產(chǎn)生更多的異常剪切和積聚的蛋白，這些錯誤折疊的蛋白即可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡，也可以通過自噬途徑使細胞程序性死亡，出現(xiàn)AD的病理學(xué)改變及進行性加重的行為學(xué)障礙。對中藥何首烏的相關(guān)研究表明，何首烏能改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，對膽堿能神經(jīng)投射纖維有保護作用，可提高乙酰膽堿酯酶活性，可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2通路抑制細胞凋亡13-16。因此，對何首烏的主要有效成分二苯乙烯苜進行研究，進一步揭示其治療AD的主要作用機理及藥物靶點。在Morris水迷宮實驗中，PNT

22、主要考察大鼠的空間分辨學(xué)習(xí)能力，SPT主要測量大鼠的工作記憶能力，通過本實驗可以看出，在A6蠹性作用下，轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間定向、工作記憶能力明顯下降，表現(xiàn)為Y電迷宮躲避所需的電刺激次數(shù)增加，Morris水迷宮測試中潛伏期延長，游泳路程增加及穿越平臺次數(shù)減少；從時間上來看，這種損害隨著A6暴露時間的延長而加重，說明A6對小鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間記憶及工作記憶的損害呈逐漸增強的累加效應(yīng)；經(jīng)TSG十預(yù)后，小鼠躲潛伏期縮短，游泳路程縮短，穿越平臺次數(shù)增加，說明TSG可改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶、空間定向、工作學(xué)習(xí)能力，具有腦保護作用。Western和RT-PCR的結(jié)果顯示，藥物組經(jīng)TSG十預(yù)后，海馬部位L

23、C3、Beclin-1的mRNA及蛋白表達均降低。有研究提示TSG可以下調(diào)APP的表達，我們的前期實驗證實TSG可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78的表達和Caspase12誘導(dǎo)的凋亡11。因此，中藥何首烏提取物TSG可以明顯改善AD鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間定向等行為學(xué)功能，其作用機制可能通過抑制淀粉樣前體蛋白的表達，減輕A6的神經(jīng)蠹性對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損害，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度，從而使自嗜通路中Beclin-1、LC3-U的表達下調(diào)，細胞的自嗜和凋亡等減少，從而起到改善AD鼠行為學(xué)障礙的腦保護作用。參考文獻1 QuerfurthHW，LaFerlaFM.Alzheimersdisea

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