抗氧化功能評價方法

1、附件1:抗氧化功能評價方法試驗項目、試驗原則及結(jié)果判定Items,PrinciplesandResultAssessmenti試驗項目1.1 動物實驗1.1.1 體重1.1.2 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物：丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)1.1.3 蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物：蛋白質(zhì)厥基1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽過氧化物酶1.1.5 抗氧化物質(zhì)：還原性谷胱甘肽1.2 人體試食試驗1.2.1 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物：丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)1.2.2 超氧化物歧化酶1.2.3 谷胱甘肽過氧化物酶2試驗原則2.1 動物實驗和人體試食試驗所列的指標(biāo)

2、均為必測項目。2.2 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物指標(biāo)中丙二醛和血清8-表氫氧異前列腺素任選其一進行指標(biāo)測定，動物實驗抗氧化酶指標(biāo)中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶任選其一進行指標(biāo)測定。2.3 氧化損傷模型動物和老齡動物任選其一進行生化指標(biāo)測定。2.4 在進行人體試食試驗時，應(yīng)對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。3結(jié)果判定3.1 動物實驗：脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物、抗氧化酶、抗氧化物質(zhì)四項指標(biāo)中三項陽性，可判定該受試樣品抗氧化功能動物實驗結(jié)果陽性。3.2 人體試食試驗：脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶三項指標(biāo)中二項陽性，且對機體健康無影響，可判定該受試樣品具有抗氧化功能的作用?？寡趸?/p>

3、能檢驗方法MethodfortheAssessmentofAntioxidativeFunction也可用氧化損傷模型鼠。單一性別,選用10月齡以上老齡大鼠或8月齡以上老齡小鼠,小鼠每組1015只，大鼠812只。1.2 劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組和一個溶劑對照組，以人體推薦量的為其中的一個劑量組，另設(shè)兩個劑量組，高劑量一般不超過空白對照組。受試樣品給予時間30天，必要時可延長至10倍（小鼠）或5倍（大鼠）30倍，必要時設(shè)陽性對照組、45天。1.3 實驗方法1.3.1 老齡動物選用10月齡以上大鼠或8月齡以上小鼠，按血中MDA水平分組，隨機分為1個溶劑對照組和3個受試樣品劑量組。

4、3個劑量組給予不同濃度受試樣品，對照組給予同體積溶劑，實驗結(jié)束時處死動物測脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)厥基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.2 D半乳糖氧化損傷模型1.3.2.1 原理D-半乳糖供給過量，超常產(chǎn)生活性氧，打破了受控于遺傳模式的活性氧產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)，引起過氧化效應(yīng)。1.3.2.2 造模方法選25-30g健康成年小鼠，除空白對口組外，其余動物用D-半乳糖40mg-1.2g/kgBW頸背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量為0.1mL/10g,每日1次，連續(xù)造模6周，取血測MDA,按MDA水平分組。隨機分為1個模型對照組和3個受試樣品劑量組，3個劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試

5、樣品，模型對照組給予同體積溶劑，在給受試樣品的同時，模型對照組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量D-半乳糖頸背部皮下或腹腔注射，實驗結(jié)束處死動物測脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)厥基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.3 乙醇氧化損傷模型1.3.3.1 原理乙醇大量攝入，激活氧分子產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞過氧化效應(yīng)及體內(nèi)還原性谷胱甘肽的耗竭。1.3.3.2 造模方法選2530g健康成年小鼠（180220g大鼠），隨機分為4個組，1個模型對照組和3個受試樣品劑量組，必要時可增設(shè)1個空白對照組。3個劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃30天，末次灌胃后，模型組對照組和3個劑量

6、組禁食16小時（過夜），然后1次性灌胃給予50%乙醇12ml/kgBW,6小時后取材（空白對照組不作處理，不禁食取材），測血清或肝組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)厥基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.4 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物測定1.3.4.1 血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量測定血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量可采用熒光法和比色法測定，方法任選其一。1.3.4.1.1 熒光法1.3.4.1.1.1 熒光法原理MDA（malondiadehycle）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，測其含量可間接估計脂質(zhì)過氧化的程度。1個丙二醛（MDA）分子與2個硫代巴比妥酸（TBA）分子在

7、酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。以波長536nm為激發(fā)光，在550nm有最強熒光強度?？捎脽晒夥ㄟM行微量測定。1.3.4.1.1.2 儀器與試劑儀器：熒光分光光度計、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管試齊I：10mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，棕色瓶4c保存12個月），臨用前用純水稀釋成1nmol/mL29mmol/L硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸0.209gEDTA.2H2025mg谷胱甘肽（還原型）1mg用0.02mol/LNaOH50mL溶解（微溫助溶，棕色瓶4c保存2周）酸水解液0.1mol/LH2SO4125mL0.1mol/LNa2SO4125mL加水150

8、mL用H2so4調(diào)pH1.5,加水稀釋至500mL正丁醇以上所用玻璃器皿均需經(jīng)50%硝酸浸泡24h后，再經(jīng)蒸儲水、雙蒸水淋洗干燥，試劑（選AR級）最好用雙蒸水配制。1.3.4.1.1.3 實驗步驟1.3.4.1.1.3.1 樣品制備全血上清液：取血506加入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心10min,取上清液待測。血清樣品：取血0.5mL室溫靜置10min,2000r/min離心10min,取上清液待測。1.3.4.1.1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將10nmol/mL四乙氧基丙烷，用雙蒸水稀釋成0.0>0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分別取0.1mL

9、加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL一混勻，避光、沸水浴60min一流水冷卻至室溫一3mL正丁醇振蕩抽提1min3000r/min離心5min一取上清液（正丁醇層）測熒光強度（入射狹縫1.5nm,出射狹縫5nm,激發(fā)波長536nm,發(fā)射波長550nm）以四乙氧基丙烷濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)作圖。1.3.4.1.1.3.3 樣品測定試齊空白管樣本管標(biāo)準(zhǔn)管10mL具塞離心管0.1mL蒸儲水0.1mL血清*0.1mL標(biāo)準(zhǔn)#酸水解液2mL2mL2mLTBA工作液0.5mL0.5mL0.5mL混勻，避光沸水浴60min,流水冷卻止醇3mL3mL3mL振蕩抽提1min,3000r/min離心5

10、min*全血上1#液0.5mL（空白管加蒸儲水0.5mL,標(biāo)準(zhǔn)管加標(biāo)準(zhǔn)0.1mL、蒸儲水0.4mL）#1nmol/mL四乙氧基丙烷（標(biāo)準(zhǔn)）血清0.1mL（或全血上清液0.5mL）一加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL一混勻，避光、沸水浴60min一流水冷卻至室溫一3mL正丁醇振蕩抽提1min3000r/min離心5min一取上清液（正丁醇層）測熒光強度（入射狹縫1.5nm,出射狹縫5nm,激發(fā)波長536nm,發(fā)射波長550nm）1.3.4.1.1.3.4計算公式：B-AB-A過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mL血清）=xCxK=x1X1F-AF-AB-AB-A1過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mL血

11、液）=xCxK=x1-F-AF-A0.05A:空白管熒光度B:樣品熒光度F:四乙氧基丙烷熒光度C:四乙氧基丙烷濃度（1nmol/mL）K:稀釋倍數(shù)1.3.4.1.2比色法1.3.4.1.2.1比色法原理MDA（malondiadehycle）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，測其含量可間接估計脂質(zhì)過氧化的程度。1個丙二醛（MDA）分子與2個硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。該物質(zhì)在波長532nm有極大吸收峰?？捎梅止夤夥ㄟM行測定。1.3.4.1.2.2儀器與試劑儀器：可見光分光光度計、酶標(biāo)儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管。試齊J:0.2M乙酸

12、鹽緩沖液pH3.50.2M乙酸溶液185mL0.2M乙酸鈉溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，4c保存3個月），臨用前用水稀釋成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸鈉SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸鹽緩沖液pH7.40.2M磷酸氫二鈉1920mL0.2M磷酸二氫鉀480mL1.3.4.1.2.3實驗步驟1.3.4.1.2.3.1 樣品制備溶血液樣品：取血20dL加入0.98mL蒸儲水制成2%溶血液。1.3.4.1.2.3.2 樣品測定樣品管標(biāo)準(zhǔn)管2%溶血液*0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖

13、液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.6mL0.6mL混勻，避光沸水浴60min,流水冷卻，于532nm比色注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。*若用血清，樣品管0.15mL,標(biāo)準(zhǔn)管0.15mL。1.3.4.1.2.3.3計算B-AB-A過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mL2%溶血液）=xCxK=X40X1F-AF-AB-AB-A過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mL血清）=xCXK=x40X1A:空白管吸光度B:樣品吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)1.3.4.2組織中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(

14、MDA)含量測定1.3.4.2.1 原理見1.3.4.1.2.11.3.4.2.2 儀器與試劑儀器：可見光分光光度計、酶標(biāo)儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器試齊I：見1.3.4.1.2.21.3.4.2.3 實驗步驟1.3.4.2.3.1 樣品制備組織勻漿樣品：取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s,間歇30s,反復(fù)進行3次，制成10%組織勻漿(W/V),3000r/min離心5-10min,取上清液待測。1.3.4.2.3.2 樣品測定10%組織勻漿0.2mL40nmol/

15、mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.7mL0.7mL混勻，避光沸水浴60min,流水冷卻，于532nm比色注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行1.3.4.2.3.3計算B-AB-A1過氧化月旨質(zhì)含量=xCxK=X40X(nmol/mg組織)F-AF-A0.2x10%x1000A:空白管吸光度B:樣品管吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)1.3.4.3血清中8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprost

16、ane)測定1.3.4.3.1 原理8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)是體內(nèi)脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)穩(wěn)定而具有特異性的標(biāo)志物，其含量能間接反應(yīng)因機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生而導(dǎo)致組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度。1.3.4.3.2 儀器與試劑儀器：酶標(biāo)儀、生化培養(yǎng)箱、微量振蕩器、微量加樣器、洗板機試齊J:8-IsoprostaneKIAKit(酶聯(lián)免疫試劑盒)8-IsoprostaneEIA抗體血清、8-IsoprostaneAChE示蹤物、8-IsoprostaneEIA標(biāo)準(zhǔn)品、EIA緩沖液、洗滌緩沖液、吐溫20、鼠抗-兔IgG抗體、EIA示蹤染色劑、EIA抗體血清染色劑、曰lman's試劑

17、1.3.4.3.3 實驗步驟1.3.4.3.3.1樣品制備小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血，3000r/min離心10min。取上清液，用EIA緩沖液稀釋15倍備用。1.3.4.3.3.2樣品測定按試劑盒說明操作。8-表氫氧異前列腺素標(biāo)準(zhǔn)孔濃度分別為：500pg/mL、200pg/mL、80pg/mL、32pg/mL、12.8pg/mL、5.1pg/mL、2.0pg/mL、0.8pg/mL步驟試齊空白TANSBBo標(biāo)準(zhǔn)/樣品1.加試劑EIA緩沖液-100科L50dL-標(biāo)7B/樣品-50dLAChE示蹤物-50dL50dL50dL抗體血清-50dL50dL2.iO用封板膜蓋好酶標(biāo)板，并在4c避光條件下培養(yǎng)1

18、8小時3.清洗清洗所有反應(yīng)孔五次4.加試劑AChE示蹤物-5dL-Ellman's200科L200科L200科L200dL200科L5.屆用封板膜蓋好酶標(biāo)板，并在常溫避光條件下培養(yǎng)45-90分鐘6.讀數(shù)在波長412nm處測量各孔吸光度(Bo在0.3-1.0A.U范圍)標(biāo)準(zhǔn)或樣品孔吸光度一NSB孔吸光度%B/Bo=X100Bo孔吸光度一NSB孔吸光度以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度的對數(shù)(log)為橫坐標(biāo)，B/Bo為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，亦可將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成logit(B/B°)或lnB/Bo/(1-B/Bo)做為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。將樣品的3七。值，代入方程式，計算出樣品的濃度，再乘以

19、稀釋倍數(shù)，即為樣品中的8-表氫氧異前列腺素濃度。1.3.5蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物測定H2O2或。2一自由基對蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化可導(dǎo)致厥基產(chǎn)物的積累。羥自由基也可直接作用于肽鏈，使肽鏈斷裂，引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破壞，在斷裂處產(chǎn)生默基。厥基化蛋白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)厥基含量可直接反映蛋白質(zhì)損傷的程度。蛋白質(zhì)厥基形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志，它隨著年齡的增長而增加。1.3.5.1 血清中蛋白質(zhì)厥基測定1.3.5.1.1 原理被氧化后的蛋白質(zhì)厥基含量增多，默基可與2,4-二硝基苯腫反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腺，2,4.二硝基苯腺為紅棕色的沉淀

20、，將沉淀用鹽酸月瓜溶解后即可在分光光度計上讀取370nm下的吸光度值，從而測定蛋白質(zhì)的厥基含量。1.3.5.1.2 儀器與試劑儀器：紫外分光光度計、酶標(biāo)儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、低溫高速離心機、混旋器、2ml離心管。試齊J:10mmol/L2,4-二硝基苯腫（DNPH）99毫克2,4-二硝基苯腫用50ml2mol/LHCL溶解，4c避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸（TCA）6mol/L鹽酸月瓜無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3.5.1.3 操作步驟試齊測定管對照管血清（血漿）0.1ml0.1ml10

21、mmol/L2,4-二硝基苯腫0.4ml2mol/LHCL0.4ml渦旋混勻1分鐘，37c準(zhǔn)確避光反應(yīng)30分鐘200g/L三氯乙酸0.5ml0.5ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0ml1.0ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0ml1.0ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0ml1.0ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀

22、無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0ml1.0ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀6mol/L鹽酸月瓜1.25ml1.25ml混勻后，37c準(zhǔn)確水浴15分鐘渦旋混勻，將全部沉淀溶解，以12000r/min離心15min,取上清液在370nm處比色，6mol/L鹽酸月瓜試劑調(diào)零，測定OD值。用雙縮月尿法測定血清（或血漿）蛋白質(zhì)含量。注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.5.1.4 計算公式測定管OD-對照管OD蛋白質(zhì)厥基含量=X125X105（nmol/mgprot）22x比色光徑（cm）x樣本蛋白濃度（mg/L）1.3.5.2組織中蛋白質(zhì)厥

23、基測定1.3.5.2.1 原理見1.3.5.1.11.3.5.2.2 儀器與試劑儀器：紫外分光光度計、酶標(biāo)儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、天平、勻漿器、低溫高速離心機、混旋器、2ml離心管。試齊I：10mmol/LHEPES緩沖液pH7.42.38克N-2-羥乙基哌嗪-2'-乙磺酸（HEPES）溶入1000ml雙蒸儲水，用lNNaOH調(diào)pH至7.4,4c保存。100g/L硫酸鏈霉素1g硫酸鏈霉素，溶入10ml雙蒸儲水，4c避光保存。10mmol/L2,4-二硝基苯腫（DNPH）99毫克2,4-二硝基苯腫用50ml2mol/LHCL溶解，4c避光保存。2mol/LHCL200g/

24、L三氯乙酸（TCA）6mol/L鹽酸月瓜無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3.5.2.3實驗步驟1.3.5.2.3.1 樣品處理取0.1g組織，在冰的生理鹽水中漂洗，以去掉表面的血跡。加人0.9ml的冰的10mmol/LHEPES緩沖液（pH7.4）,制成10%的勻漿。將勻漿液以3000r/min的轉(zhuǎn)速，離心10min,保留上清。取100g/L的硫酸鏈霉素溶液503，加入上清液450/（v/v,1:9）,室溫放置10min后，以11000r/min的轉(zhuǎn)速，離心10min,取上清液待測。1.3.5.2.3.2操作步驟試齊測定管對照管

25、組織勻漿上清液0.1ml0.1ml10mmol/L2,4-二硝基苯腫0.4ml2mol/LHCL0.4ml渦旋混勻1分鐘，37c準(zhǔn)確避光反應(yīng)30分鐘200g/L三氯乙酸0.5ml0.5ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0ml1.0ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0ml1.0ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0ml1.0ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r

26、/min離心10min,棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液1.0ml1.0ml渦旋混勻1分鐘，以4c下，以12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀6mol/L鹽酸月瓜1.25ml1.25ml混勻后，37c準(zhǔn)確水浴15分鐘渦旋混勻，將全部沉淀溶解，以12000r/min離心15min,取上清液在370nm處比色，6mol/L鹽酸月瓜試劑調(diào)零，測定OD值。用雙縮月尿法測定勻漿上清液蛋白質(zhì)含量。注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.5.2.3.3 計算公式測定管OD-對照管OD蛋白質(zhì)厥基含量=X125X105（nmol/mgprot）22x比色光徑（cm）x樣本蛋白濃度（

27、mg/L）1.3.5.3注意事項1.3.5.3.1 加入硫酸鏈霉素：在勻漿上清液中加人硫酸鏈霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些堿基如鳥喋吟、胞喀咤、尿喀咤和胸腺喀咤等也含有厥基，如不去除核酸，這些堿基就會與DNPHg合，并反應(yīng)生成有色物質(zhì)，這些物質(zhì)會增加最后溶液的吸光度，使結(jié)果偏大。1.3.5.3.2 DHPH勺溶解：DNPHF溶于水，只能溶于稀酸和稀堿等溶液，因此，用2mol/LHC1來溶解DNPH設(shè)對照管是為了避免HCK反應(yīng)液中一些物質(zhì)反應(yīng)生成對比色有影響的物質(zhì)。1.3.5.3.3 反應(yīng)體系應(yīng)避光：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液中加人DNP進行反應(yīng)時，反應(yīng)體系需置于黑暗中，因為DNPK穩(wěn)定，見光會分解。

28、如果反應(yīng)體系遇到光，DNP分解，體系中會有剩余的沒有變成蛋白質(zhì)腺衍生物，對反應(yīng)比色有影響。1.3.5.3.4 去除未與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNPH由于DNPK370nm左右有強烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反復(fù)洗滌沉淀，去掉未與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNPH否則，會增加吸光值。1.3.6抗氧化酶活力測定SOD催化超氧陰離子自由基（。2一）生成H2O2,再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）和過氧化氫酶作用生成水，這樣可以清除。2一對細(xì)胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在動物某些器官和人體血紅細(xì)胞中的含量均有明顯的增齡變化，酶活性與生物年齡的增長成反比。消除自由基的能力與酶活性成正比。1.3

29、.6.1 血或組織中超氧化物歧化酶（SOD）活力測定1.3.6.1.1 原理O2一氧化羥胺的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽，后者在對氨基苯磺酸及甲泰胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，在波長530nm處有極大吸收峰，可用分光光度法進行測定，當(dāng)SOD消除。2一后形成的亞硝酸鹽減少。1.3.6.1.2 儀器與試劑儀器可見光分光光度計、酶標(biāo)儀、離心機、恒溫水浴、勻漿器試劑65mM磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.810mmol/L鹽酸羥胺鹽酸羥胺6.95mg,力口PBS至10mL7.5mmol/L黃喋吟黃喋吟11.41mg,力口0.1MNaOH2.5mL溶解，力口PBS至10mL0.2g/L黃喋吟氧化酶取10g/L黃喋吟氧化酶0.

30、2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL0.1%甲秦胺取0.2g“-甲蔡胺溶于40mL沸蒸儲水，涼至室溫加50mL冰醋酸，再加110mL涼蒸儲水至200mL0.33%對氨基苯磺酸取0.66g對氨基苯磺酸溶于150mL溫蒸儲水，加50mL冰醋酸至200mLSOD標(biāo)準(zhǔn)品三氯甲烷95%乙醇（v/v）0.9%生理鹽水1.3.6.1.3 實驗步驟紅細(xì)胞抽提液制備：10（1隆血沖入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心3min,棄上清，力口冰冷的雙蒸水0.2mL混勻，加入95%乙醇0.1mL,振蕩30s,加入三氯甲烷0.1mL,置快速混合器抽提1min,4000r/min離心3min,分層，上層為SOD

31、抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，記錄上清液體積待測。組織勻漿的制備：剪取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s,間歇30s,反復(fù)進行三次，制成1%組織勻漿，（最好用超聲波發(fā)生器處理30s）,使線粒體振破，以中性紅-詹鈉氏綠B染色證明線粒體已振碎。以4000r/min離心5min,取上清液201待測。SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線將SOD標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸鹽緩沖液配制成750U/mL的溶液，再稀釋到50倍，即SOD量為15U/mL（1.5g/mL,用本法測定不同量的SOD標(biāo)準(zhǔn)液的百分抑制率，以百分抑制率為縱坐標(biāo)，以SOD活力單位U

32、/mL為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對照管OD測定管ODSOD百分抑制率=X100%對照管OD計算每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個單位。（對照管OD-測定管OD）X對照管ODSOD活力（U/mL）=50%也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從100%反應(yīng)液總量（6mL）XX樣品稀釋倍數(shù)取液量SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的SODU/mL,乘以稀釋倍數(shù)（1mL/取樣量）。若樣品為組織勻漿液，根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量，將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細(xì)胞抽提液，根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/gHbo樣品測定步驟:測定管1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8(mL)

33、1.01.0樣品*A10mmol/L鹽酸羥胺(mL)0.10.17.5mmol/L黃喋吟(mL)0.20.20.2mg/mL黃喋吟氧化酶（mL）0.20.2雙蒸水（mL）0.490.49混勻，37c恒溫水浴30min0.33%對氨基苯磺酸（mL）2.02.00.1%甲蔡胺(mL)2.02.0混勻15min后，倒入1cm光徑比色杯，以莫好留水調(diào)零，530nm處比色測定OD值。*A所用樣品的量紅細(xì)胞抽提液10Vl血清（或血漿）20-30（溶血樣品剔除）1%組織勻漿10-40g1注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.6.2 血或組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活力測定1.3.6.2

34、.1 原理谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度，及單位時間內(nèi)GSH減少的量來表示，GSH和5,5'-二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長有最大吸收峰，測定該離子濃度，即可計算出GSH減少的量，由于GSH能進行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計算酶活力時，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。1.3.6.2.2 試劑和儀器儀器：可見光分光光度計、酶標(biāo)儀、低溫高速離心機、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑

35、：疊氮鈉磷酸緩沖液NaN3pH7.016.25mg終濃度2.5mmol/LEDTA-Na27.44mg終濃度0.2mmol/LNa2HPO41.732g終濃度0.2mol/LNaH2PO41.076g終濃度0.2mol/L加蒸儲水至100mL,用少量HCL、NaOH調(diào)pH7.0,4c保存。1mmol/L谷胱甘肽（還原型GSH）溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL,臨用前配制，冰凍保存12日。1.251.5mmol/LH2O2溶液取30%H2O20.15-0.17mL,用雙蒸水稀釋至100mL,作為貯備液，4c避光保存，臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液HPO31

36、6.7g（先用蒸儲水溶解）EDTA0.5gNaCl280g加蒸儲水至1000mL,用普通濾紙過濾，室溫保存。0.32mol/LNa2HPO4溶液：Na2HPO422.7g加蒸儲水至500mL,室溫保存。DTNB顯色液DTNB40mg檸檬酸三鈉1.0g加蒸儲水至100mL,4C避光保存1個月。0.2M磷酸緩沖液pH7.40.9%生理鹽水1.3.6.2.3實驗步驟1.3.6.2.3.1樣品制備溶血液：取鼠血10科加入到1mL雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血1:100待測，4h內(nèi)測定酶活力。若當(dāng)天來不及測定，將肝素抗凝全血置-20C凍存，3d內(nèi)測定，若4c存放，28h內(nèi)必須測完。測前取出樣品室溫自然

37、解凍。組織上清液：動物禁食過夜，處死后，立即取出所需臟器，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸干后，在冰浴上剪成碎塊，稱取適量組織，加冷0.2M磷酸緩沖液，以20000r/min勻漿10s,間歇30s,反復(fù)3次制成5%組織勻漿，操作在冰浴中進行，勻漿以12500Xg離心10min（低溫高速離心機），以沉淀為破碎的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、核及線粒體，上清液用以測胞液中的酶活力，最好當(dāng)天測，否則加20%（v/v）甘油分裝于塑料管，放置-20-80C,可保存數(shù)周，而酶活力不減。1.3.6.2.3.2 GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取1.0mmol/LGSH溶?夜0、0.2、0.4、0.6、0.8、1

38、.0mL,分別置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀劑8mL,用雙蒸水稀釋至10mL刻度，即得到濃度為0、20、40、60、80、100科mol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液。取上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液各2mL,放入試管中，加入0.32mol/LNa2HPO42.5mL,比色前加入DTNB顯色液0.5mL用光徑1cm杯，5min內(nèi)在可見光423nm波長測OD值，以雙蒸水調(diào)零點。以GSH含量（mol/D為橫坐標(biāo)，OD423值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.6.2.3.3 測定步驟:試齊U樣品管（mL）非酶管（mL）空白管（mL）1.0mmol/LGSH0.40.4樣品*0.4雙蒸水*0.437c水浴預(yù)溫5min

39、H2O2（37C預(yù)熱）0.20.237c水浴準(zhǔn)確反應(yīng)3min（嚴(yán)格控制時間）偏磷酸沉淀液443000r/min離心10min22雙蒸水0.4偏磷酸沉淀液1.60.32mol/LNa2HPO42.52.52.5DTNB顯色液0.50.50.5顯色反應(yīng)1min后于423nm波長（1cm光徑），讀OD值，5min之內(nèi)讀數(shù)準(zhǔn)確。*樣品為組織上清液時，非酶管改為加熱使酶失活的組織上清液。*溶血液0.10.4mL組織上清?11:20稀釋，取稀釋液0.4mL注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.6.2.3.4計算鼠全血GSH-Px活力單位規(guī)定每1mL全血，每分鐘，扣除非酶反應(yīng)的10gGSH降低后

40、，使logGSH降低1為一個酶活力單位。非酶管10gGSH-樣品管logGSH鼠全血GSH-Px活力單位（U/mL全血）=3minx0.004mL10g非酶管OD空白管ODHog樣品管OD-空白管OD=3minx0.004mL組織GSH-Px比活力單位規(guī)定每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘，扣除非酶反應(yīng)，使GSH濃度降低1mol/L為一個酶活力單位。（非酶管OD樣品管OD）XA*X5組織GSH-Px比活力單位（U/mg蛋白）=.一*3minx樣品蛋白質(zhì)的mg數(shù)1 Folin法或雙縮月尿法測樣品蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)GSH濃度（gmol/L）2 *A=即標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。標(biāo)準(zhǔn)GSH光密度（OD）1.3.6.2.4注意事項

41、1.3.6.2.4.1 由于H2O2易分解導(dǎo)致濃度改變，臨用時取貯備液用分光光度計測其濃度，取貯備液3mL,測定1cm光徑的240nm處OD值。OD濃度（mmol/L）=0.036（消光系數(shù)）若OD值為0.45,則表明H2O2濃度為12.5mmol/L。1.3.6.2.4.2 5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子的顯色不僅與整個反應(yīng)體系中氫離子濃度有關(guān)，還受反應(yīng)時間限制。加入顯色劑后，反應(yīng)體系pH為6.5時，11min開始顯色，此時比色5min內(nèi)讀數(shù)準(zhǔn)確。1.3.7抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽（GSH）測定谷胱甘肽是一種低分子清除劑，它可清除。2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組

42、成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的疏基化合物，是GSH-PX和GST兩種酶類的底物，為這兩種酶分解氫過氧化物所必需，它能穩(wěn)定含疏基的酶，和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷，缺乏或耗竭GSH會促使許多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素產(chǎn)生中毒作用，GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。1.3.7.1 血或組織中還原型谷胱甘肽（GSH）測定方法1.3.7.1.1 原理GSH-和5,5'-二硫?qū)ο趸姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基甲酸陰離子，于420nm波長有最吸收峰，測定該離子濃度，即可計算GSH的含量。1.3.7.1.2 儀器和試齊I儀器：可見光分

43、光光度計、酶標(biāo)儀、低溫高速離心機、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試齊J:0.9%生理鹽水4%磺基水楊酸溶液0.1mol/LPBS溶液（pH=8.0）:稱取Na2HPO413.452g,KH2PO40.722g,加蒸儲水至1000mL。0.004%DTNB溶液：稱取DTNB40mg溶于1000mL的0.1mol/LPBS溶液（pH=8.0）中。疊氮納緩沖液：NaN316.25mgEDTA-Na27.44mgNa2HPO41.732gNaH2PO41.076g加蒸儲水至1000mL,用少量HCl、NaOH調(diào)pH7.0,4c保存。標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取還原型GSH15.4mg,加疊氮納緩沖液至50mL,終濃

44、度為1mmol/L,臨用前配制。1.3.7.1.3實驗步驟1.3.7.1.3.1樣品制備：溶血液上清液：取0.1mL抗凝全血加雙蒸水0.9mL（1：9溶血液），充分混勻，直至透亮為止。取溶血液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。血清上清液：取0.1mL血清加4%磺基水楊酸0.1mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。組織上清液：取組織0.5g加生理鹽水4.5mL充分研磨成細(xì)漿（10%肝勻漿），混勻后取漿液0.5mL力口4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。1.3.7.1.3.2樣品測

45、定：溶血液或組織樣品測定:測定管空白管上清液0.5mL一4%磺基水楊酸一0.5mLDTNB4.5mL4.5mL混勻，室溫放置10分鐘后，血清樣品測定：420nm處測定吸光度?？瞻坠苌锨逡?.1mL4%磺基水楊酸0.1mLDTNB0.9mL0.9mL10420nm注：該指標(biāo)檢測，需新鮮樣品取材后當(dāng)天完成。用雙縮月尿法測定血清（或溶血液）、組織勻漿蛋白質(zhì)含量。如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.7.1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線取1mmol/LGSH標(biāo)準(zhǔn)溶液0、10、20、50、100、150、200山,分別加入生理鹽水至0.5mL,即得到0、20、40、100、200、300、400gol/L的G

46、SH標(biāo)準(zhǔn)液系列，各管加入DTNB4.5mL）混勻，室溫放置10分鐘后，空白管調(diào)零，420nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。12345671mmol/LGSH(mL)00.010.020.050.100.150.20生理鹽水（mL）0.500.490.480.450.400.350.30DTNB(mL)4.504.504.504.504.504.504.50GSH量(Rmol/L)020401002003004001.3.7.1.3.4計算樣品GSH含量=對應(yīng)曲線濃度值（M-mol/L)X溶血液稀釋倍數(shù)X上清液稀釋倍數(shù)(Nmol/L全血)=對應(yīng)曲線濃度值（Mmol/L

47、)X10X2樣品GSH含量=對應(yīng)曲線濃度值（M-mol/L)X上清液稀釋倍數(shù)(Nmol/L血清)=對應(yīng)曲線濃度值（Mmol/L)X2樣品GSH含量=對應(yīng)曲線濃度值(Nmol/L)X上清液稀釋倍數(shù)一上清液組織含量（Mmol/g組織）：=對應(yīng)曲線濃度值（'mol/L)X2+100g組織/L樣品GSH含量=對應(yīng)曲線濃度值(mol/L)X上清液稀釋倍數(shù)+上清液蛋白含量(Nmol/gprot)=對應(yīng)曲線濃度值（Mmol/L)X2+勻漿gprot/L1.4數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定1.4.1 數(shù)據(jù)處理一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值,F值F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)

48、間差異無顯著性；F值Fo.05,PW0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。1.4.2 指標(biāo)判定1.4.2.1 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物受試樣品組與模型（或老齡）對照組比較，過氧化脂質(zhì)（丙二醛或8-表氫氧異前列腺素）含量降低有統(tǒng)計學(xué)意義，判定該受試樣品有降低脂質(zhì)過氧化作用，該項指標(biāo)結(jié)果陽性。1.4.2.2 蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物受試樣品組與模型（或老齡）對照組比較，蛋白質(zhì)厥基含量降低有統(tǒng)計學(xué)意義，判定該受試樣品有降低蛋白質(zhì)過氧化作用，該

49、項指標(biāo)結(jié)果陽性。1.4.2.3 抗氧化酶活力受試樣品組與模型（或老齡）對照組比較，抗氧化酶（SOD或GSH-PX）活力升高有統(tǒng)計學(xué)意義，判定該受試樣品有升高抗氧化酶活力作用，該項指標(biāo)結(jié)果陽性。1.4.2.4 抗氧化物質(zhì)GSH受試樣品組與模型（或老齡）對照組比較，GSH含量升高有統(tǒng)計學(xué)意義，判定該受試樣品有升高抗氧化物質(zhì)GSH作用，該項指標(biāo)結(jié)果陽性。1.4.3 結(jié)果判定過氧化脂質(zhì)含量、蛋白質(zhì)厥基、抗氧化酶活性、還原性谷胱甘肽四項指標(biāo)中三項指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品抗氧化動物實驗結(jié)果陽性。2人體試食試驗2.1 受試者納入標(biāo)準(zhǔn)選年齡在1865歲，身體健康狀況良好，無明顯腦、心、肝、肺、腎、血液疾患，

50、無長期服藥史，志愿受試保證配合的人群。2.2 排除受試者標(biāo)準(zhǔn)2.2.1 妊娠或哺乳期婦女，對保健食品過敏者。2.2.2 合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病患者。2.2.3 短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品，影響到對結(jié)果的判斷者。2.2.4 不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定食用受試樣品，無法判定功效或資料不全影響功效或安全性判斷者。2.3 受試者分組對受試者按MDA、SOD、GSH-Px水平隨機分為試食組和對照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如年齡、性別、生活飲食習(xí)慣等，進行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.4 試驗方法采用自身和組間兩種對照設(shè)計。試驗組按推薦服用方法、服用量每

51、日服用受試產(chǎn)品，對照組可服用安慰劑或采用陰性對照。受試樣品給予時間3個月，必要時可延長至6個月。試驗期間對照組和試食組原生活、飲食不變。2.5 觀察指標(biāo)各項指標(biāo)在試驗開始及結(jié)束時各檢測1次。2.5.1 安全性指標(biāo)2.5.1.1 一般狀況包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等2.5.1.2 血、尿、便常規(guī)檢查2.5.1.3 肝、腎功能檢查2.5.1.4 胸透、心電圖、腹部B超檢查2.5.2 功效指標(biāo)2.5.2.1 過氧化脂質(zhì)含量觀察試驗前后MDA的變化及MDA下降百分率。（測定方法見1.3.3.1）試驗前MDA一試驗后MDAMDA下降百分率=<100%試驗前MDA觀察試驗前后8-Isopro

52、stane的變化及8-Isoprostane下降百分率。（測定方法見2.8）試驗前8-Isoprostane一試驗后8-Isoprostane8-Isoprostane下降百分率=父100%試驗前8-Isoprostane2.5.2.2超氧化物歧化酶觀察試驗前后SOD的變化及SOD升高百分率。（測定方法見1.3.4.1）試驗前SOD一試驗后SODSOD升高百分率=父100%試驗前SOD2.5.2.3谷胱甘肽過氧化物酶觀察試驗前后GSHPX的變化及GSHPX升高百分率。（測定方法見2.7）試驗前GSHPX試驗后GSHPXGSHPX升高百分率=X100%試驗前GSH-PX2.6 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定

53、凡自身對照資料可以采用配對t檢驗，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗，后者需進行方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進行t檢驗；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t檢驗或秩和檢驗；但變異系數(shù)太大（如CV>50%）的資料應(yīng)用秩和檢驗。在試驗前組間比較差異無顯著性的前提下，可進行試驗后組間比較。各功效觀察指標(biāo)試驗前后自身比較和試食后組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，方可判定該指標(biāo)陽性。過氧化脂質(zhì)含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶三項實驗中任二項實驗結(jié)果陽性，可判定該受試樣品具有抗氧化功能作用。2.7 血中谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活力

54、測定2.7.1 原理谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度，及單位時間內(nèi)GSH減少的量來表示，GSH和5,5'-二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長有最大吸收峰，測定該離子濃度，即可計算出GSH減少的量，由于GSH能進行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計算酶活力時，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。2.7.2 試劑和儀器儀器：可見光分光光度計、酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、微量加樣器、離心機試劑：疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN316.25