保證鱟試驗結(jié)果準(zhǔn)確的探討

1、保證鱟試驗結(jié)果準(zhǔn)確的探討一、試驗誤差分析及改進措施l 鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 l 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價及使用的影響l 實驗器皿的的影響l 樣品成份及理化性質(zhì)的影響l 實驗員的影響 l 環(huán)境的影響 1 鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響鱟試劑的質(zhì)量：抗干擾能力，穩(wěn)定性；鱟試劑靈敏度標(biāo)示值的準(zhǔn)確性 。 鱟試劑靈敏度的誤差 是否用細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定？ 標(biāo)示值是否準(zhǔn)確？2 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品引起的誤差l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差l細(xì)菌內(nèi)毒素單位表示誤差 l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的錯誤使用 1） 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類細(xì)菌內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)菌內(nèi)毒素國

2、家標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 2） 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間的生物效價存在一定的誤差，用不同細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)核同一批鱟試劑靈敏度時可能存在一定的誤差。中國藥典要求“當(dāng)c在0.5-2(包括0.5和2)時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。”試驗結(jié)果只要在這合格范圍內(nèi)表示鱟試劑標(biāo)示靈敏度準(zhǔn)確。3） 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。正確正確（易折點）錯誤（易折點

3、）錯誤注意：只能在安瓿的易折點上部開啟內(nèi)毒素，不能沿易折點開啟，防止振蕩過程中內(nèi)毒素粘在封口膜上。 只能取1ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。 若使用的為細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品，可按其使用說明書中的方法將其稀釋至規(guī)定濃度后分裝保存。若為細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，為一次性使用。 4） 錯誤使用 有部分客戶使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來復(fù)核鱟試劑的靈敏度，這是一種錯誤行為，更有甚者使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來交叉復(fù)核鱟試劑的靈敏度，這是一種嚴(yán)重錯誤行為。 3 實驗器皿的影響l器皿的計量管理（校正）l器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn)l器皿的正確處理1） 器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 鱟試驗對器皿的要求：刻度準(zhǔn)確；內(nèi)表面光滑；易

4、于清理。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實驗不宜選用注射器，最好使用經(jīng)過校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精確，內(nèi)壁磨沙面吸附內(nèi)毒素，而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對試驗結(jié)果的干擾，故不宜選用注射器。 如果用量不大，使用頻率不高，建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無內(nèi)毒素和-葡聚糖污染的產(chǎn)品，其中包括, 無熱原試管、無熱原移液器吸頭。這些產(chǎn)品可以給您的工作帶來很大方便,另外，當(dāng)實驗出現(xiàn)誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。 2） 器皿的正確處理2005年版中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范278頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“實驗準(zhǔn)備”規(guī)定：“將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑

5、和自來水洗凈并烘干水分后，置洗液中浸泡4小時，取出將洗液瀝干，用自來水將殘余的洗液洗凈，再用蒸餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素。”應(yīng)該特別注意，該規(guī)程明確規(guī)定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖洗。”有的客戶使用反滲透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿，結(jié)果試驗中所有的陽性對照都為陰性，復(fù)核鱟試劑靈敏度時試驗結(jié)果誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的質(zhì)量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽離子經(jīng)250高溫干烤不能完全被破壞，這時不同的離子就產(chǎn)生對鱟試劑酶反應(yīng)抑制或增強的反應(yīng)，為了保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢驗報告的權(quán)威性，我們應(yīng)該嚴(yán)格

6、遵守操作規(guī)程，用多效蒸餾水沖洗鱟試驗用玻璃器皿。4 樣品成份及理化性質(zhì)的影響 l-葡聚糖樣物質(zhì)的影響lPH值的影響l金屬離子和弱酸陰離子的影響l藥物濃度的影響 1 1） -葡聚糖樣物質(zhì)的影響常見現(xiàn)象：假陽性。鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準(zhǔn)確測出被測物質(zhì)內(nèi)毒素的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也不能將其它物質(zhì)錯判為內(nèi)毒素。目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和-葡聚糖，而內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過0點的斜線。鱟試劑的特異性差的另一種表現(xiàn)，是將其它物質(zhì)（如-葡聚糖）判定為內(nèi)毒素，錯誤將合格藥品判為不合格，造成制藥廠直接經(jīng)

7、濟損失。鱟試劑反應(yīng)機理圖判斷假陽性的方法：1、特異性鱟試劑法；2、定量反應(yīng)曲線分析法；3、家兔模擬試驗法。2） PH值對反應(yīng)速度的影響常見現(xiàn)象：樣品陽性不成立。鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的最適宜pH在6.5-8.0；pH 3 或10時，酶活性受到抑制。相對活力PH7.0PH對反應(yīng)速度的影響:u影響酶原的激活；u影響酶分子的構(gòu)象，過高過低的PH會改變酶的活性中心的構(gòu)象，或甚至改變整個酶分子的機構(gòu)使其變性失活。 故鱟試驗時，供試品 pH 最好應(yīng)預(yù)調(diào)和6.5-8.0 為好，必要時可用無內(nèi)毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調(diào)節(jié) pH 值。美國、日本藥局方以及中國藥典故2005版規(guī)定檢品必須調(diào)節(jié)PH值6.0-8

8、.0。3） 金屬離子和弱酸陰離子 離子對細(xì)菌內(nèi)毒素測定結(jié)果影響較大，一方面陽離子如Fe3+、Al3+強度較大會引起內(nèi)毒素的聚集造成內(nèi)毒素局部濃度過高，同時還必須注意高價陽離子（如Fe3+）的氧化性對鱟試劑酶反應(yīng)具有強抑制作用；重金屬離子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白質(zhì)變性而使酶失活；另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應(yīng)。許多藥物因PH值10時，其中的陰離子會吸收鱟試劑中的Ca2+、Mg2+離子，使實驗呈假陰性。4） 藥物濃度1、10%葡萄糖注射液2、白蛋白、小牛血清3、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉4、中藥類注射液 5 實驗員的影響操作時嚴(yán)格按操作規(guī)程進行，安

9、瓿開啟前應(yīng)先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加樣時，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確。如果一人獨立完成試驗，可先稀釋配制好內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，然后開啟復(fù)溶鱟試劑，最后加樣，盡可能縮短鱟試劑溶液暴露在空氣中的時間（最好控制在15分鐘內(nèi)）。6、環(huán)境的影響l保溫時間l保溫溫度1）保溫溫度 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2，進行鱟試驗，然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保溫。實驗中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達49保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。 從實驗可以看出，溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大，保

10、溫溫度在2541之間，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度也升高，41尚未達到反應(yīng)速度峰值，25 時反應(yīng)速度已相當(dāng)快；在4146之間，溫度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響；達到49或更高溫度時，隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應(yīng)速度反而降低。 2）保溫時間 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2，進行鱟試驗，37保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠的形成狀態(tài)隨著時間的延長而堅固。 因此夏天室溫較高，如果試驗操作時間太長，細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑混合液不等進入反應(yīng)儀器反應(yīng)已開始，實際反應(yīng)時間超過1小時。由于室溫不同，冬夏季節(jié)、南北地區(qū)之間的操作誤差將會很大。即

11、使在25準(zhǔn)室溫下操作，操作時間拖得過長，細(xì)菌內(nèi)毒素含量較高時，測定誤差也不會小。二、鱟試劑項目介紹1、鱟試劑立項 1988年，本廠是廣東省第一家，全國首批獲準(zhǔn)衛(wèi)生部（88）衛(wèi)藥準(zhǔn)字SJ-04號，并同時獲得藥品生產(chǎn)企業(yè)許可證。2、國家火炬計劃 1989年，本廠鱟試劑項目被列入國家級火炬計劃。 鱟試劑活性定向生產(chǎn)工藝，于1991年通過廣東省科委組織的科技成果鑒定。(3)、鱟試劑活性定向生產(chǎn)工藝專利證書1995年，申報國家發(fā)明專利，專利號：ZL95105652.2三、企業(yè)開展的部分工作三、企業(yè)開展的部分工作1、提供本行業(yè)最新的研究動態(tài)及相關(guān)資料 2、提供咨詢服務(wù) 3、提供全面技術(shù)培訓(xùn) 4、提供具體品

12、種的檢查方法 5、提供全面的質(zhì)量保證 1 1、 提供本行業(yè)最新的研究動態(tài)及相關(guān)資料提供本行業(yè)最新的研究動態(tài)及相關(guān)資料 我們?nèi)孀粉檱鴥?nèi)外細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究動態(tài)及相關(guān)成果，并結(jié)合本公司的應(yīng)用研究成果，定期編寫最具實際意義的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用與論壇，贈送給讀者；或發(fā)布于企業(yè)專業(yè)網(wǎng)站以供參閱；同時編寫成講課材料在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法學(xué)習(xí)班上交流討論。 2、提供咨詢服務(wù) 您在鱟試驗時有什么疑點？在應(yīng)用過程中遇到什么困難？我們將向您提供優(yōu)質(zhì)的售前、售中及售后服務(wù)，只要您撥通以下電話都能得到滿意答復(fù)。專家熱線：莫水晶質(zhì)檢咨詢：603 董光宴銷售專線

13、：2732299 聯(lián) 系 人： 李慧菊 陳超群3、提供全面技術(shù)培訓(xùn) 我們每年將在全國各地巡回舉辦細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法培訓(xùn)班，內(nèi)容包括：鱟試劑研究動態(tài)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作規(guī)程、新品種的干擾試驗以及具體品種的檢查方法、實驗中可能遇到的問題及分析解決方案、定量法研究成果及其動態(tài)。內(nèi)容豐富全面，是您了解細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法、豐富理論知識和提高職業(yè)技能的最佳選擇，最后還有專家現(xiàn)場解答您的疑問。 4、 提供具體品種的檢查方法 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在快速發(fā)展，常規(guī)品種不斷增加，新報批注射劑品種全要求用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，您想了解每一個品種的操作方法嗎？我們可依據(jù)中國藥典、中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范和藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范為您制訂具體品種的SOP供您參考。 我們的服務(wù)：u提供具體品種的細(xì)菌內(nèi)