鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)的研究進展

1、讀書報告鈣蛋白酶抑制蛋白研究進展汪超 鐘正澤 楊飛云 周曉蓉 曹蘭（重慶市畜牧科學院 重慶榮昌 402460）摘要：鈣蛋白酶在宰后肉類成熟過程中通過降解肌肉蛋白質而提高肉嫩度，鈣蛋白酶抑制蛋白是在細胞內廣泛表達的、高效的、專一性抑制鈣蛋白酶活性的蛋白質，因此引起了廣大研究者的廣泛關注。本文闡述了鈣蛋白酶抑制蛋白的結構，生物學作用，營養(yǎng)等因素對鈣蛋白酶抑制蛋白的影響及其活性測定方法。關鍵詞：鈣蛋白酶抑制蛋白 結構 生物學作用 活性測定Research Progress of CalpastatinWang chao, Zhong zhengzhe, Yang feiyun, Zhou xiaor

2、ong ,Cao lan(Chongqing Academy of Animal Science,Rongchong 402460 )Abstact: Calpain make a contribution to Meat Tenderization by degradation of protein in the postmortem meat tenderization process. Calpastatin , a special endogenous inhibitor expressed extensively in cell , has a special inhibition

3、to calpain. Therefore ,This paper review the structure ,biologic function, influenced factors , separation and activity assay of calpastatin.Key words: Calpastatin. Structure , Biologic function, influenced factors , activity assay 鈣蛋白酶(Calpain)是一種鈣激活中性半胱氨酸內肽酶，分布于所有脊椎動物的肌細胞內部。鈣蛋白酶家族包括-鈣蛋白酶,m-鈣蛋白酶和鈣蛋

4、白酶抑制蛋白（Calpastatin）等。鈣蛋白酶在骨骼肌中通過涉及生肌細胞分化、激發(fā)肌原纖維蛋白周轉來調控生長，同時在宰后肉類成熟過程中通過降解肌肉蛋白質而提高肉嫩度。鈣蛋白酶被鈣離子和鈣蛋白酶抑制蛋白調控1。鈣蛋白酶抑制蛋白是一種有著多種功能的內源抑制劑，它通過抑制鈣蛋白酶而發(fā)揮作用。本文綜述了鈣蛋白酶抑制蛋白的結構、生物學作用、營養(yǎng)等因素對鈣蛋白酶抑制蛋白的影響及其分離與活性檢測方法等。1 鈣蛋白酶抑制蛋白的結構肌肉組織中鈣蛋白酶抑制蛋白的分子量為77 KDa，斯托克半徑為6.8nm，含有少量的螺旋，以隨機的卷曲結構存在。 鈣蛋白酶抑制蛋白是由一條多肽鏈組成的蛋白，它含有5個結構域(圖1

5、)，不同哺乳動物鈣蛋白酶抑制蛋白的cDNA序列的保守性較差。第一個結構域即L結構域的功能還不太清楚，此結構域在某些細胞的鈣蛋白酶抑制蛋白中不存在，如紅血球中的鈣蛋白酶抑制蛋白。第二到第五個結構域是四個結構相似的重復單位，每個重復單位的氨基酸殘基具2035同源性。每個重復單位含有三個保守區(qū)，分別為A、B、C。保守區(qū)B約含30個氨基酸，其中由Thr-IlePro-Pro-XTyr-Arg組成的七肽序列十分保守，X代表不同的氨基酸，因此它可能是鈣蛋白酶抑制蛋白起抑制作用的關鍵部位。通過基因重組，使鈣蛋白酶抑制蛋白 cDNA片段在大腸桿菌中表達。發(fā)現(xiàn)含此保守序列的多肽片段，即使少到3070個氨基酸殘基

6、，也能抑制鈣蛋白酶的活性。Maki等發(fā)現(xiàn)人工合成的含TIPPXYR的23個氨基酸殘基或更長的短肽可以抑制鈣蛋白酶活性。保守區(qū)A和C決定著鈣蛋白酶抑制蛋白與鈣蛋白酶中CaM類似結構域的結合。通過定點突變實驗發(fā)現(xiàn)當保守區(qū)A和C中Lea-161和Lea-236被Pro替代時，鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶的親和力將大大降低。如果刪除保守區(qū)B，鈣蛋白酶抑制蛋白雖然失去了抑制活性，但仍可有效地與鈣蛋白酶中CaM類似結構域結合，此實驗有效地證實了重復序列中三個保守區(qū)所行使的功能。另外，鈣蛋白酶抑制蛋白還有多個同功型分布于心肌及其它組織2。圖1 鈣蛋白酶抑制蛋白結構示意圖2.鈣蛋白酶抑制蛋白的生物學作用在宰后肉

7、類成熟過程中，-鈣蛋白酶通過降解-肌動素，Z-nin蛋白 , m-鈣蛋白酶通過在宰后降解肌間線蛋白，聯(lián)結蛋白，半肌動蛋白，肌鈣蛋白T和I，原肌球蛋白， C-蛋白和M-蛋白來弱化肌纖維結構，從而提高肌肉嫩度。通常蛋白酶如果過度激活的話，其在生物學體系中將是一種潛在而劇烈的破壞物。因此它們通常由特異性和非特異性抑制劑嚴格控制。而鈣蛋白酶的活性也同樣被其抑制劑鈣蛋白酶抑制蛋白調控。鈣蛋白酶抑制蛋白是在細胞內廣泛表達的、高效的、專一性抑制鈣蛋白酶活性的蛋白質。當鈣蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有鈣蛋白酶抑制蛋白存在，它可以識別鈣蛋白酶與鈣結合引起的構象變化并與之特異結合3, 從而保證鈣蛋白酶對底物只

8、進行局部的特定位點的水解。由于鈣蛋白酶在自溶后才表現(xiàn)活性，因此鈣蛋白酶抑制蛋白被認為是岳陽家政通過抑制鈣蛋白酶的自溶作用而發(fā)揮作用的，且這種抑制作用并不受pH的影響。鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶的結合需要Ca2+，并且這種結合是可逆的，即在無Ca2+時重新分離。在大多數(shù)組織中，其鈣蛋白酶抑制蛋白濃度足以抑制鈣蛋白酶活性4。另外，降解后的鈣蛋白酶抑制蛋白同樣具有抑制鈣蛋白酶活性的作用56。鈣蛋白酶抑制蛋白的第到第V結構域中的A和C保守區(qū)，與鈣蛋白酶的 和結構域緊密結合，然后B保守區(qū)鈣蛋白酶的結構域結合而發(fā)揮抑制鈣蛋白酶的作用7。因為鈣蛋白酶在宰后肉類嫩化過程中起基礎作用，因此鈣蛋白酶抑制蛋白與肉的

9、嫩度也有著密切關系。當活體肌肉中蛋白質降解減弱時，鈣蛋白酶抑制蛋白活性增加89。鈣蛋白酶抑制蛋白活性同肉的宰后嫩化成反比，它在能引起牛肉的嫩度變化（40%）的措施中起著比其他單一措施更重要的作用1011。在轉基因鼠上的研究表明，高水平有活性的鈣蛋白酶抑制蛋白表達將直接導致宰后蛋白質溶解下降, 但這種活性僅在宰后對細胞關鍵骨架蛋白質的降解起作用12。宰后鈣蛋白酶抑制蛋白活性與牛羊肉嫩度有著密切關系，其相關系數(shù)分別為0.66和0.64，因為高鈣蛋白酶抑制蛋白活性可抑制鈣蛋白酶活性，因而降低了肉的嫩度13。，另有研究表明，在鈣蛋白酶系統(tǒng)中與嫩度最高度相關的就是鈣蛋白酶抑制蛋白與 -鈣蛋白酶的活性的比

10、值14。Delgado等（2001）研究表明，牛羊宰后嫩化同宰后鈣蛋白酶抑制蛋白降解率有關6。3營養(yǎng)及其他因素對鈣蛋白酶抑制蛋白的影響 研究表明，毛孔大怎么辦營養(yǎng)及其它因素可以調控鈣蛋白酶抑制蛋白的量及其活性。Du（2004）等通過對懷孕30天的母牛及其牛犢研究發(fā)現(xiàn),在維持凈能為對照組的68.1%,維生素和礦物質為需要量一半的的情況下,對照組母牛比實驗組母牛肌肉中有更高含量的鈣蛋白酶抑制蛋白(P0.05)。而與之相反, 對照組母牛所產(chǎn)牛犢肌肉中的鈣蛋白酶抑制蛋白含量較實驗組牛犢低(P0.05)15。 Helman(2003)研究表明，飼喂高雞蛋白（28%）日糧的狗比飼喂低谷蛋白（12%）的狗肌

11、肉中的鈣蛋白酶抑制蛋白的表達量要高許多(P0.05)，同時發(fā)現(xiàn)飼喂高雞蛋白的狗比飼喂低谷蛋白的狗在調節(jié)由鈣蛋白酶所介導的蛋白質降解方面有更大的潛力16。Kendall(1993)研究認為,在體外隨著離子強度的增大,鈣蛋白酶抑制蛋白的活性有所下降,但在有肌纖維存在的情況下,宰后肌肉中典型的離子強度并不影響鈣蛋白酶抑制蛋白的活性17。 Kretchmar (1990)研究發(fā)現(xiàn),在育肥羊上飼喂 4 ppm 的 -興奮劑L-644, 969將大幅提高鈣蛋白酶抑制蛋白的活性18。 Duckett (2000)報道, callipyge 型羊肌肉中的鈣蛋白酶抑制蛋白的活性高于正常羊19。 4 鈣蛋白酶抑制

12、蛋白活性檢測4.1 鈣蛋白酶抑制蛋白的分離6鈣蛋白酶抑制蛋白(20-105mM NaCl)肌肉勻漿離心取上清液DEAE-Sephacel 柱層析透 析 圖2 鈣蛋白酶抑制蛋白的分離的技術路線 取25g肌肉，怎么減肚子剔除脂肪和結締組織，切成小塊，放入組織搗碎機中，加入3體積的抽提液（100ml Tris-HCl,pH=8.3; 10mM EDTA；10 mM 2-巰基乙醇及6 mg亮肽素(Leupeptin)/L，100mg 卵類粘蛋白(Ovomucoid)/L,和2 mM苯甲磺酰氟）搗碎勻漿。每勻漿30秒鐘后，冷卻30秒再進行下次勻漿。共3次。勻漿液在37500gmax條件下離心120分鐘，

13、取上清液并記錄其體積。將上清液置于25倍體積的透析液（40mM Tris-HCl; pH=7.35; 5mM EDTA;10 mM MCE）中透析過夜，然后進行離子交換層析。層析柱規(guī)格為1.620cm DEAE-Sephacel柱,流速為30ml/h。先用約5倍柱體積平衡緩沖液（50 mM Tris-HCl; pH7.5；0.5mM EDTA；10 mM MCE；4C）洗脫至A278（278nm波長下的吸光度值）達到基線，再用25到105 mM梯度NaCl緩沖液（50 mM Tris-HCl; pH7.5；0.5mM EDTA；10 mM MCE；4C）洗脫，收集分樣即為鈣蛋白酶抑制蛋白。4.

14、2 鈣蛋白酶抑制蛋白的活性測定201單位鈣蛋白酶抑制蛋白活性被定義為抑制1單位的m 鈣蛋白酶活性所需的鈣蛋白酶抑制蛋白的量痔瘡偏方。因此，測定鈣蛋白酶抑制蛋白活性需要部分純化的m 鈣蛋白酶。但測定鈣蛋白酶抑制蛋白活性宜用新鮮樣品（宰后45分鐘內），不宜用冷凍肉樣。鈣蛋白酶抑制蛋白活性測定需要做以下3管活性。a管只含m-鈣蛋白酶，b管含m-鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白收集液。C管含鈣蛋白酶抑制蛋白收集液，但其反應混合液不含CaCl2。具體方法是：取適當體積的各組分收集液在 4C溫育1min后，加入1.5ml含反應混合液（100ml Tris-HCl,10 mM MCE，5mg/ml酪蛋白和5 mM

15、 CaCl2，用1N的乙酸調節(jié)到PH為7.5）中，在25C條件下反應60分鐘。用濃度為5%的三氯乙酸終止反應和沉淀未降解的酪蛋白。將反應混合液在2000gmax離心30分鐘，取上清液在波長為278nm下測定并記錄其吸光度。鈣蛋白酶抑制蛋白活性根據(jù)下列公式計算：鈣蛋白酶抑制蛋白活性=a-(b-c) 稀釋倍數(shù)。5. 小結鈣蛋白酶抑制蛋白在肉品嫩化過程中的生物學作用已為廣大學者關注，且被認為涉及活體組織蛋白質降解，排毒養(yǎng)顏膠囊但對其作用機制研究尚不夠深入。通過營養(yǎng)方式和分子生物學技術可以調控鈣蛋白酶抑制蛋白活性，從而使其更好的為動物生產(chǎn)服務。另外，鈣蛋白酶抑制蛋白基因作為提高肉嫩度的侯選基因，通過輔

16、助標記選擇育種等技術的運用，將有利于高度嫩度的動物品種的培育。參考文獻1. Goll, D. E., V. F. Thompson, H. Li, W. Wei, and J. Cong. The calpain system. Physiol. Rev. 2003，83:731801.2. Melloni, E., R. deTullio, M. Averna, J. Tedesco, F. Salamino, B. Sparatore, and S. Pontromoli. Properties of calpastatin forms in rat brain. FEBS Lett. 1

17、998, 431 : 5558.3. Koohmaraie M., S. C. Seidemann, J. E. Schollmeyer, T. R. Dutson and J. D. Crouse. Effect of post-mortem storage on Ca+-dependent proteases, their inhibitor and myofibril fragmentation Meat Science. 1987, 19(3): 187-196 4. Kumamoto T，Kleese W C, Cong J et alLocalization of the Ca2+

18、dependent proteinases and their inhibitor in normal ,fasting,and denervated rat skeletal muscle. Anat Rec,1992，232 (1)：60775. Huang J，Nei E FRole of calpain in skeletal muscle protein degradation . J.Proc Natl Acad Sci USA. 1998.,95：1210012105.6. Delgado E. F., G. H. Geesink, J. A. Marchello, D. E.

19、Goll, and M. Koohmaraie. The calpain system in three muscles of normal and callipyge sheep. J. Anim Sci. 2001, 79: 398-412.7. Bice T，D Wight M，Champion C S. A structural model for the inhibition of calpain bycalpastatin：crystal structures of the native domain VI of calpain and its complexes withcalp

20、astatin peptide and a small molecule inhibitor .J. Mol Biol.2003.,328：131146.8. Wheeler, T. L., and M. Koohmaraie. Effects of the &adrenergic agonist L644,969 on muscle protein turnover, endogenous pro-teinase activities and meat tenderness in steers. J. Anim. Sci. 1992, 70:3035.9. Morgan, J . B., T

21、. L. Wheeler, M. Koohmaraie, J. W. Savell, and J. D. Crouse. Meat tenderness and the proteolytic system in the longissimus muscle of young bulls and steers. J. Anim. Sci. 1993, 71:1471.10. Whipple, G., M. Koohmaraie, M. E. Dikeman, and J. D. Crouse. Predicting beef-longissimus tenderness from variou

22、s biochemical and histological muscle traits. J Anim. Sci. 1990, 68:4193.11. Shackelford, S. D., M. Koohmaraie, L. V. Cundiff, K. E. Gregory, G. A. Rohrer, and J. Savell W. Heritabilities and phenotypicand genetic correlations for bovine postrigorcalpastatin activity,intramuscular fat content, Warne

23、r-Bratzler shear force,retail product yield, and growth rate. J. Anim. Sci. 1994, 72:857. pp 115-127. CRC Press, Boca Raton, FL.12. Kent M. P., M. J. Spencer, and M. Koohmaraie. Postmortem proteolysis is reduced in transgenic mice overexpressingcalpastatin. J. Anim Sci. 2004, 82: 794-801.13. Koohmar

24、aie, M., J. Killefer, M. D. Bishop, S. D. Shackelford, T. L. Wheeler, and J. R. Arbona. 1995. Calpastatin-based methods for predicting meat tenderness. In A. Ouali, D. I. DeMeyer, and F.J.M. Smulders (Ed.) Expression of Tissue Proteinases and Regulation of Protein Degradation.14. Pringle T. D., J. M

25、. Harrelson, R. L. West, S. E. Williams, and D. D. JohnsonCalcium activatedtenderization of strip loin，top sirtoin，and top sirloin，andtop round steaks in diverse genotypes of cattleJ Anim Sci，1999.77：3230-323715. Du, M.,M. J. Zhu, W. J. Means, B. W. Hess, and S. P. Ford . Effect of nutrient restriction on calpain andcalpastatin content of skeletal muscle from cows and fetuses . J. Anim Sci. 2004, 82: 2541-2547.16. Helman E. E., E. Huff-Lonergan, G. M. Davenport, and S. M. Lonergan. Effec