腫瘤分子檢測與質(zhì)量控制課件

1、.深圳市人民醫(yī)院病理科分子實(shí)驗(yàn)室 姜陽陽2015-10-27腫瘤分子檢測方法與質(zhì)量控制腫瘤分子檢測方法與質(zhì)量控制.醫(yī)學(xué)發(fā)展歷程的啟示醫(yī)學(xué)發(fā)展歷程的啟示經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)循證醫(yī)學(xué)循證醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷靠治療后期經(jīng)驗(yàn)積累。診斷治療以人群、科學(xué)研究證據(jù)指導(dǎo)臨床實(shí)踐。診斷治療以個(gè)體為基礎(chǔ)，更加提前、具體與精確。分子時(shí)代分子時(shí)代.腺癌腺癌鱗癌鱗癌21%25%36%7.8%3.3%2.6%2.2%0.8%0.7%0.7%0.1%肺腺癌：肺腺癌：EGFRKRASBRAFALK-ROS1RET等檢測已是共識(shí)；等檢測已是共識(shí)；肺鱗癌發(fā)生模式不同，檢測靶標(biāo)以擴(kuò)增為主，同時(shí)肺鱗癌發(fā)生模式不同，檢測靶標(biāo)以擴(kuò)增為主

2、，同時(shí)EGFR、ALKROS1某些病例也有必要檢測某些病例也有必要檢測。.我們可以用的分子生物學(xué)手段：實(shí)時(shí)熒光PCR方法（擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)法（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、PCR-高分辨溶點(diǎn)曲線分析（HRM）、數(shù)字PCR等）PCR-雜交法（膜上、芯片基因芯片 、乳膠顆粒Luminex）PCR-Sanger測序PCR-焦磷酸測序新一代高通量測序新一代高通量測序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH）直接雜交免疫組化免疫組化.分子病理檢測的主要方法分子病理檢測的主要方法基因突變基因突變(SNPs)

3、拷貝數(shù)改變拷貝數(shù)改變(Copy Number Variation, CNV)基因重排基因重排（Gene rearrangement)檢測技術(shù)檢測技術(shù)蛋白蛋白(質(zhì)質(zhì))表達(dá)表達(dá)(Protein expression)免疫組織化學(xué)（免疫組織化學(xué)（IHC）基因表達(dá)基因表達(dá)(mRNA/RNA expression）反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄+熒光定量熒光定量PCR（RT-qPCR)FISHDNA sequencing， ARMS檢測對(duì)象檢測對(duì)象檢測基因檢測基因檢測水平檢測水平EGFR，KRAS，BRAF，BRCA, BCR-ABL，JAK2EML4-ALK，ROS1，HER2，RETBRCA1，TOP2A，TYMSE

4、GFR，EML4-ALK，HER2. 是RT-PCR平臺(tái)上的特異擴(kuò)增技術(shù)（易開展易開展） 共發(fā)表300多篇文獻(xiàn) 著名的大型臨床研究大型臨床研究 - 如IPASS、INFORM等國際肺癌協(xié)會(huì)專家共識(shí)國際肺癌協(xié)會(huì)專家共識(shí)中國基因突變檢測專家共識(shí)中國基因突變檢測專家共識(shí)日本臨床專家共識(shí)日本臨床專家共識(shí)IPASSINFORM大型臨床研究所采用大型臨床研究所采用ARMS技術(shù)技術(shù)被臨床證明的腫瘤基因突變檢測技術(shù)被臨床證明的腫瘤基因突變檢測技術(shù).DNA 基因重排基因重排融合融合mRNA或或5/3 mRNA差異表達(dá)差異表達(dá)嵌合蛋白表達(dá)嵌合蛋白表達(dá)肺癌中肺癌中ALKALK基因變異的表達(dá)調(diào)控基因變異的表達(dá)調(diào)控FI

5、SH/CISH NGSRT-PCR 5/3比較比較qRT-PCRRACE-PCRIHC.熒光原位雜交技術(shù)（熒光原位雜交技術(shù)（FISH）2個(gè)信號(hào)分離直徑的要求，使實(shí)際應(yīng)用中結(jié)果難以判斷個(gè)信號(hào)分離直徑的要求，使實(shí)際應(yīng)用中結(jié)果難以判斷有有5-11%出現(xiàn)假陽性信號(hào)分離出現(xiàn)假陽性信號(hào)分離1，2，3工作強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí)工作強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí)主觀性強(qiáng)，受人為因素影響大主觀性強(qiáng)，受人為因素影響大橫向橫向縱向縱向1. FISH技術(shù)是技術(shù)是美國美國藥物臨床試驗(yàn)中所采用的檢測方法。藥物臨床試驗(yàn)中所采用的檢測方法。2. 采用采用“分離分離”分析，基因倒位和分析，基因倒位和ALK重排后，紅色和綠色探針分開重排后，紅色和綠色探針分

6、開3. 15%的樣本細(xì)胞中呈現(xiàn)分開的紅色和綠色信號(hào)表示陽性結(jié)果的樣本細(xì)胞中呈現(xiàn)分開的紅色和綠色信號(hào)表示陽性結(jié)果1.p 操作簡單，時(shí)間短操作簡單，時(shí)間短p 結(jié)果客觀，易于判讀，減少人為因素的影響結(jié)果客觀，易于判讀，減少人為因素的影響p 除除FFPE樣本外，還適用其他類型樣本組織樣本外，還適用其他類型樣本組織1p 與與EGFR、RET、ROS1等其他檢測不沖突，共用相同組織切片和等其他檢測不沖突，共用相同組織切片和PCR擴(kuò)增程序，擴(kuò)增程序，節(jié)約有限資源和時(shí)間節(jié)約有限資源和時(shí)間p 中國熒光中國熒光PCR儀器普及率更高，更加適合國情儀器普及率更高，更加適合國情NTCPCFusionSample實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)

7、錄法（實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄法（Real Time-PCR）.CFDA批準(zhǔn)的基因檢測產(chǎn)品批準(zhǔn)的基因檢測產(chǎn)品項(xiàng)目項(xiàng)目EGFRALKROS1ALK/ROS1IHCFISHReal Time-PCR基于基于Real Time-PCR方法檢測驅(qū)動(dòng)基因的分子診斷產(chǎn)品方法檢測驅(qū)動(dòng)基因的分子診斷產(chǎn)品獲得獲得CFDA批準(zhǔn)最多批準(zhǔn)最多.p2-3 片片F(xiàn)FPE樣品樣品p同時(shí)將同時(shí)將DNA和和RNA分離出來分離出來p同時(shí)獲得同時(shí)獲得EGFR、ALK和和ROS1檢測結(jié)果檢測結(jié)果節(jié)約樣本、節(jié)約時(shí)間、節(jié)約成本DNA/RNAEGFR突變型ALK陽性或ROS1陽性EGFR野生型ALK陰性ROS1陰性吉非替尼厄洛替尼?？颂婺岚⒎ㄌ婺峥诉蛱?/p>

8、尼色瑞替尼其他治療方式DNA/RNA共分離劑盒共分離劑盒EGFR/ALK+ROS12.5小時(shí)小時(shí)PCR4.5小時(shí)小時(shí)FFPE切片1-3片片或活檢小標(biāo)本活檢小標(biāo)本.2015 NSCLC NCCN指南指南對(duì)于NSCLC患者建議檢測EGFR和ALK基因狀態(tài)；對(duì)于ROS1/MET/RET/BRAF/ HER2等嶄露頭角的靶基因也給予關(guān)注.1.室內(nèi)質(zhì)量控制2.室間質(zhì)量評(píng)價(jià)分子病理實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制分子病理實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制.1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室2.具備資質(zhì)且相對(duì)固定的人員3.性能穩(wěn)定的試劑4.持續(xù)不斷的學(xué)習(xí)和開展質(zhì)控.醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)

9、政發(fā)2010194號(hào)）號(hào)）醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)展檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)展檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號(hào)）號(hào)）.試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向空氣流向標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)空氣流向空氣流向擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)空氣流向空氣流向產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間 工作走向工作走向 .FISHFISH實(shí)驗(yàn)區(qū)實(shí)驗(yàn)區(qū).臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作文件（sop）1.寫你所做2.做你所寫3.實(shí)驗(yàn)室的精髓可操作性的可操作性的sopsop文件文件.人員資質(zhì)人員資質(zhì).理想的試劑理想的試劑l試劑方法的性能驗(yàn)證及每批試劑的質(zhì)檢l性能指標(biāo)： 重

10、復(fù)性（精密度）重復(fù)性（精密度） 準(zhǔn)確性（定量：回收率、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等；定性：方法學(xué)比較等） 線性范圍（定量） 分析特異性 測定下限測定下限 抗干擾能力抗干擾能力. 資質(zhì)認(rèn)證資質(zhì)認(rèn)證 試劑質(zhì)量試劑質(zhì)量試劑反應(yīng)性能前后批號(hào)結(jié)果一致性測定下限批內(nèi)變異（10%)和批間變異（15-25%).你其實(shí)做了這些，但是你有記錄么？1.日常維護(hù)2.定期保養(yǎng)3.維修記錄實(shí)驗(yàn)室最忠實(shí)的員工-儀器.全流程：標(biāo)本接收全流程：標(biāo)本接收- -石蠟切片石蠟切片- -核酸提純核酸提純- -實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量熒光定量PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增- -結(jié)果分析結(jié)果分析分析前：標(biāo)本接收、制片、填寫檢測申請(qǐng)單分析前：標(biāo)本接收、制片、填寫檢測申請(qǐng)單分析

11、中：核酸提取、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、檢測分析中：核酸提取、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、檢測有效性判斷有效性判斷分析后：結(jié)果分析、報(bào)告審核、結(jié)果解釋分析后：結(jié)果分析、報(bào)告審核、結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)：重復(fù)，可控，規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)：重復(fù)，可控，規(guī)范全流程室內(nèi)質(zhì)控. 組織蠟塊 切片 病理學(xué)評(píng)估病理學(xué)評(píng)估 核酸純化 實(shí)驗(yàn)/數(shù)據(jù)DNA模板質(zhì)量質(zhì)量更重要，建議對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行質(zhì)量檢測： OD260/OD280=1.80.2， OD260/OD2301.7全流程室內(nèi)質(zhì)控.檢查設(shè)定參數(shù)檢查設(shè)定參數(shù)平臺(tái)期平臺(tái)期背景熒光背景熒光閾值線閾值線設(shè)定閾值設(shè)定閾值檢查對(duì)照組及內(nèi)外控曲線情況檢查對(duì)照組及內(nèi)外控曲線情況陽性質(zhì)控品陽性質(zhì)控品突變樣本突變樣本突變分析突變分析.RNARNA制備制備 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 選用選用CFDA認(rèn)證認(rèn)證的檢測試劑的檢測試劑認(rèn)證的核酸認(rèn)證的核酸抽提試劑抽提試劑病理小樣本病理小樣本中性福爾馬林中性福爾馬林組織保護(hù)液組織保護(hù)液快速低溫放置快速低溫放置微量紫外分光微量紫外分光光度計(jì)