RNA干擾及應(yīng)用

1、RNARNA干擾及其應(yīng)用干擾及其應(yīng)用2010-12-10二二.RNAi.RNAi發(fā)現(xiàn)史發(fā)現(xiàn)史三三.RNAi.RNAi作用機(jī)制作用機(jī)制四四.RNAi.RNAi應(yīng)用應(yīng)用一一. RNA. RNA干擾干擾五五.RNAi.RNAi展望展望一一.RNA.RNA干擾的簡(jiǎn)介干擾的簡(jiǎn)介RNARNA干擾作用干擾作用(RNA interference(RNA interference，RNAiRNAi）雙鏈）雙鏈RNA RNA (double(doublestranded RNAstranded RNA，dsRNA)dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制機(jī)制(post transcriptiona

2、l gene silencing, PTGS)(post transcriptional gene silencing, PTGS)。 20022002ScienceScience雜志評(píng)為雜志評(píng)為“20022002年的重大突破年的重大突破” ” 20062006 Nobel Prize in Nobel Prize in Physiology or Physiology or MedicineMedicine 1990, Jorgensen et al1990, Jorgensen et al 材料：材料：petunias petunias 目的：得到紫色更深的花目的：得到紫色更深的花; ;

3、方法：構(gòu)建強(qiáng)啟動(dòng)子的苯基苯乙烯酮合酶表達(dá)載體，導(dǎo)入方法：構(gòu)建強(qiáng)啟動(dòng)子的苯基苯乙烯酮合酶表達(dá)載體，導(dǎo)入 牽牛花牽?；? ; 結(jié)果：花變得更白結(jié)果：花變得更白; ; 分析：內(nèi)源和外源的苯基苯乙烯酮合酶基因的表分析：內(nèi)源和外源的苯基苯乙烯酮合酶基因的表 達(dá)都被抑制達(dá)都被抑制, ,稱(chēng)之為共抑制稱(chēng)之為共抑制(cosuppression).(cosuppression).二二.RNAi.RNAi發(fā)現(xiàn)史發(fā)現(xiàn)史 1995, Guo Su et al1995, Guo Su et al 材料：材料：c celeganselegans 目的：消除線(xiàn)蟲(chóng)第一次分裂的不對(duì)稱(chēng)性目的：消除線(xiàn)蟲(chóng)第一次分裂的不對(duì)稱(chēng)性 方法：利

4、用反義方法：利用反義RNARNA技術(shù)抑制技術(shù)抑制par-1par-1的表達(dá)。對(duì)照注入的表達(dá)。對(duì)照注入正義正義RNARNA。 結(jié)果：兩種方法都抑制結(jié)果：兩種方法都抑制par-1par-1基因?；颉?分析：無(wú)法解釋。分析：無(wú)法解釋。 19981998，F(xiàn)ire et alFire et al 材料：材料： c celeganselegans 目的：消除線(xiàn)蟲(chóng)第一次分裂的不對(duì)稱(chēng)性目的：消除線(xiàn)蟲(chóng)第一次分裂的不對(duì)稱(chēng)性 方法：注射純化的由方法：注射純化的由T4T4和和T7-RNAT7-RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到的聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到的ss-RNA; ss-RNA; 注射純化的注射純化的ds-RNAds-RNA

5、 結(jié)果：前者只引起微弱的抑制作用；后者卻得到比前者高結(jié)果：前者只引起微弱的抑制作用；后者卻得到比前者高兩個(gè)數(shù)量級(jí)的抑制效果。兩個(gè)數(shù)量級(jí)的抑制效果。 分析：分析：RNA Interference(RNAi), Nature,1998,391:806-RNA Interference(RNAi), Nature,1998,391:806-811 811 Su GuoSu Guo等等 正義正義RNARNA抑制抑制 反義反義RNARNA技術(shù)的阻斷，都是由于體技術(shù)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得外轉(zhuǎn)錄所得RNARNA中污染了微量中污染了微量dsRNAdsRNA而引起。而引起。 該小組把該小組把dsRNAds

6、RNA對(duì)內(nèi)源基因的抑制作用稱(chēng)為對(duì)內(nèi)源基因的抑制作用稱(chēng)為RNAiRNAi。 真核生物：真菌、果蠅、真核生物：真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲(chóng)、水螅、渦擬南芥、錐蟲(chóng)、水螅、渦蟲(chóng)、斑馬魚(yú)等。蟲(chóng)、斑馬魚(yú)等。 RNAiRNAi在不同物種的表現(xiàn)形在不同物種的表現(xiàn)形式：植物中的轉(zhuǎn)錄后基因式：植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默、共抑制及沉默、共抑制及RNARNA介導(dǎo)介導(dǎo)的病毒抗性、真菌的抑制的病毒抗性、真菌的抑制現(xiàn)象?，F(xiàn)象。三三.RNAi.RNAi作用機(jī)制作用機(jī)制起始階段起始階段效應(yīng)階段效應(yīng)階段擴(kuò)增擴(kuò)散階段擴(kuò)增擴(kuò)散階段起始階段起始階段 長(zhǎng)長(zhǎng)dsRNAsiRNA 21-23ntdsRNAsiRNA 21-23nt ATP, RNa

7、seATP, RNase特異核酸酶特異核酸酶(Dicer,(Dicer,果蠅果蠅) ) 33端均有端均有2 23 3個(gè)突出的核個(gè)突出的核苷酸苷酸 RISCRISC效應(yīng)階段效應(yīng)階段RISC binding RISC binding targeted RNAtargeted RNA siRNARISC (RNAinduced silencing complex) siRNARISC (RNAinduced silencing complex) ATPATP 活化的活化的RISCRISC在單鏈在單鏈siRNAsiRNA引導(dǎo)下識(shí)別互補(bǔ)的引導(dǎo)下識(shí)別互補(bǔ)的mRNAmRNA，并在，并在RISCRISC中的核

8、酸內(nèi)切酶作用下從中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNAsiRNA引導(dǎo)鏈中心所對(duì)應(yīng)的引導(dǎo)鏈中心所對(duì)應(yīng)的靶基因位置切割靶靶基因位置切割靶mRNAmRNA，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。步降解，從而干擾基因表達(dá)。 模板：靶模板：靶mRNAmRNA切割片段切割片段 引物：引物：siRNAsiRNA 產(chǎn)物：長(zhǎng)鏈產(chǎn)物：長(zhǎng)鏈dsRNAdsRNA 依次循環(huán)：依次循環(huán)： 新合成的長(zhǎng)鏈新合成的長(zhǎng)鏈dsRNAdsRNA同樣可被同樣可被DicerDicer切割、降解生切割、降解生成大量的次級(jí)成大量的次級(jí)siRNAsiRNA。次級(jí)。次級(jí)siRNAsiRNA又可進(jìn)入合成一切割又

9、可進(jìn)入合成一切割的循環(huán)過(guò)程，進(jìn)一步放大的循環(huán)過(guò)程，進(jìn)一步放大RNAiRNAi作用。作用。擴(kuò)增擴(kuò)散階段擴(kuò)增擴(kuò)散階段重要特征：重要特征： 只對(duì)只對(duì)exonexon有效，對(duì)有效，對(duì)intronintron和和promoterpromoter無(wú)效，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)無(wú)效，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)染色體染色體DNADNA有影響有影響 RNAiRNAi具有很高的特異性具有很高的特異性 放大性放大性 RNAiRNAi的效應(yīng)可以穿過(guò)細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳的效應(yīng)可以穿過(guò)細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持遞和維持四四.RNAi.RNAi應(yīng)用應(yīng)用 對(duì)抗由轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列引起的不穩(wěn)定性對(duì)抗由轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列引起的不穩(wěn)定性 對(duì)抗

10、病毒等對(duì)抗病毒等外源外源性物質(zhì)的侵入性物質(zhì)的侵入 內(nèi)源內(nèi)源基因調(diào)控基因調(diào)控: :探索基因功能和傳染性疾病及惡探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療性腫瘤的基因治療 由于由于RNAiRNAi能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，因而能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，因而RNAiRNAi成為研成為研究基因功能的很好的工具。究基因功能的很好的工具。1.1.研究基因功能研究基因功能 人們已經(jīng)開(kāi)始利用人們已經(jīng)開(kāi)始利用RNAiRNAi技術(shù)從基因組水平分技術(shù)從基因組水平分析哺乳動(dòng)物體內(nèi)基因的功能，可以更迅速地析哺乳動(dòng)物體內(nèi)基因的功能，可以更迅速地鑒定出許多與疾病相關(guān)的基因。鑒定出許多與疾病相關(guān)的基因。 黃國(guó)忠等黃國(guó)忠

11、等 RKN (RKN (根節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)根節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)) )分泌肽編分泌肽編碼基因碼基因16D1016D10證實(shí)這種寄生基因在根證實(shí)這種寄生基因在根節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的植物寄生過(guò)程中起到關(guān)鍵作節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的植物寄生過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。用。 ZimmermannZimmermann等人對(duì)為獼猴的阿樸脂蛋等人對(duì)為獼猴的阿樸脂蛋白白B (ApoB)B (ApoB)編碼的基因施用編碼的基因施用siRNAsiRNA，成功降低成功降低ApoBApoB蛋白、血清膽固醇和低蛋白、血清膽固醇和低密度脂蛋白的水平。密度脂蛋白的水平。 這是首次在非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中有關(guān)這是首次在非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中有關(guān)RNAiRNAi的全身用藥，是的全身用藥，是RN

12、AiRNAi在藥物治療在藥物治療方法上的重要進(jìn)展。方法上的重要進(jìn)展。2.2.基因治療基因治療 RNAiRNAi可以特異性的抑制基因表達(dá)，所以可用于可以特異性的抑制基因表達(dá)，所以可用于基因病、病基因病、病毒感染、癌癥毒感染、癌癥的治療。的治療。 同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列，設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的守序列，設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dsRNAdsRNA分子引發(fā)分子引發(fā)RNAiRNAi，那么只注射一種那么只注射一種dsRNAdsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)，也可以同時(shí)注射多種現(xiàn)，也可以同時(shí)注射多種d

13、sRNAdsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除，為單個(gè)或多個(gè)基因相互作用導(dǎo)致的疾病提因同時(shí)剔除，為單個(gè)或多個(gè)基因相互作用導(dǎo)致的疾病提供新的治療前景。供新的治療前景。 RNAiRNAi是機(jī)體中古老而天然的抗病毒機(jī)制。目前利用是機(jī)體中古老而天然的抗病毒機(jī)制。目前利用RNAiRNAi抗病毒感染的研究已經(jīng)展開(kāi)，主要集中在肝炎抗病毒感染的研究已經(jīng)展開(kāi)，主要集中在肝炎病毒、病毒、HIVHIV病毒。病毒。 JacqueJacque等針對(duì)等針對(duì)HIV.1HIV.1基因組的基因組的LTR(Longterminal repeateLTR(Longterminal repeate，LTR)

14、LTR)、vifvif和和nefnef設(shè)計(jì)了設(shè)計(jì)了siRNAsiRNA，將將siRNAsiRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)轉(zhuǎn)染進(jìn)HIVHIV后，這些基后，這些基因的水平降低了因的水平降低了9595。 RNAiRNAi轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小鼠, ,運(yùn)用運(yùn)用RNAiRNAi技術(shù)，技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)設(shè)計(jì)針對(duì)c-mycc-myc基因的基因的siRNAsiRNA可以可以有效地干擾有效地干擾K562K562細(xì)胞中細(xì)胞中c-mycc-myc的表的表達(dá)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 。 利用利用RNARNA干擾成功構(gòu)建針對(duì)突變干擾成功構(gòu)建針對(duì)突變p53p53的的RNARNA干擾載體，此干擾載體干擾載體，此干擾載體可以有效

15、降低可以有效降低p53p53蛋白表達(dá)水平，蛋白表達(dá)水平，導(dǎo)致突變導(dǎo)致突變p53p53基因沉默，進(jìn)而延緩基因沉默，進(jìn)而延緩PLCPLCPRFPRF5 5細(xì)胞生長(zhǎng)速度，阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)速度，阻滯腫瘤細(xì)胞停滯于腫瘤細(xì)胞停滯于G1G1期。期。 RNAiRNAi可用來(lái)研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞生長(zhǎng)分化過(guò)程?？捎脕?lái)研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞生長(zhǎng)分化過(guò)程。 ClemensClemens等應(yīng)用等應(yīng)用RNAiRNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，證明導(dǎo)通路，證明RNAiRNAi技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白

16、特異性聚集和轉(zhuǎn)重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)。染效率不高的缺點(diǎn)。 20042004年，年，JinJin等人利用果蠅作為模式生物發(fā)現(xiàn)在等人利用果蠅作為模式生物發(fā)現(xiàn)在FMRPFMRP參與參與神經(jīng)元發(fā)育和突觸生長(zhǎng)的過(guò)程中，神經(jīng)元發(fā)育和突觸生長(zhǎng)的過(guò)程中，argonau-1argonau-1起了重要作起了重要作用，證明用，證明FMRPFMRP能夠調(diào)節(jié)能夠調(diào)節(jié)miRNAmiRNA信號(hào)通路。信號(hào)通路。3.3.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 人們對(duì)人們對(duì)RNAiRNAi的研究只有短短的幾年時(shí)間，但進(jìn)展卻極的研究只有短短的幾年時(shí)間，但進(jìn)展卻極為迅速。可以認(rèn)為為迅速?？梢哉J(rèn)為RNAiRNAi是

17、一個(gè)以小分子是一個(gè)以小分子RNARNA為中心的真核為中心的真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，它可以在多個(gè)層面調(diào)節(jié)基因表達(dá)細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，它可以在多個(gè)層面調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞的增殖分化，通過(guò)對(duì)和細(xì)胞的增殖分化，通過(guò)對(duì)RNAiRNAi的研究將會(huì)使人們對(duì)生命的研究將會(huì)使人們對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)更加深入?，F(xiàn)象的認(rèn)識(shí)更加深入。 隨著后基因組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，隨著后基因組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，RNAiRNAi作為有效、經(jīng)濟(jì)的作為有效、經(jīng)濟(jì)的分析基因功能的技術(shù)，已逐漸成為分析包括原生動(dòng)物在內(nèi)分析基因功能的技術(shù)，已逐漸成為分析包括原生動(dòng)物在內(nèi)的所有生物基因功能的有力工具。的所有生物基因功能的有力工具。五五.RNAi.RNAi展望

18、展望 RNAiRNAi文庫(kù)的建立可以便利地開(kāi)展更多的遺傳學(xué)研究，文庫(kù)的建立可以便利地開(kāi)展更多的遺傳學(xué)研究，這就意味著將有越來(lái)越多基因的功能被揭示，可望進(jìn)行這就意味著將有越來(lái)越多基因的功能被揭示，可望進(jìn)行高通量的基因功能分析。而且它還為人們預(yù)防和治療癌高通量的基因功能分析。而且它還為人們預(yù)防和治療癌癥和病毒疾病提供了新的思路，給寄生原蟲(chóng)病的基因治癥和病毒疾病提供了新的思路，給寄生原蟲(chóng)病的基因治療、新藥開(kāi)發(fā)和生物醫(yī)學(xué)等應(yīng)用研究領(lǐng)域帶來(lái)新的變革。療、新藥開(kāi)發(fā)和生物醫(yī)學(xué)等應(yīng)用研究領(lǐng)域帶來(lái)新的變革。 由于對(duì)由于對(duì)RNAiRNAi分子機(jī)制的了解尚不十分明確，分子機(jī)制的了解尚不十分明確，目前對(duì)目前對(duì)dsRNAdsRNA和和siRNAsiRNA的設(shè)計(jì)還屬于經(jīng)驗(yàn)性過(guò)程，的設(shè)計(jì)還屬于經(jīng)驗(yàn)性過(guò)程，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)尚需進(jìn)一步完善。現(xiàn)有的研究主要集中實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)尚需進(jìn)一步完善?，F(xiàn)有的研究主要集中在模式生物中，是否所有