微生物菌種鑒定及保藏

1、1微生物菌種鑒定與保藏微生物菌種鑒定與保藏柳志強(qiáng)柳志強(qiáng)浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所134861184632內(nèi)容1.菌種篩選2.菌種鑒定3.菌種保藏3微生物代謝產(chǎn)物的平板檢測(cè)方法有機(jī)酸有機(jī)酸: 檸檬酸:pH指示劑的顏色變化,或摻入瓊脂平板的碳酸鈣的溶解.胞外酶胞外酶:1.淀粉酶:由碘指示的可溶性淀粉的液化2.蛋白酶:酪蛋白的溶解3.脂酶:乳化的三丁酸甘油酯的消化,清除或向橄欖油瓊脂中添加0.05-0.25%的OsO4溶液4.果膠酶:果膠凝膠的液化(1.5%的聚果膠酸鈉),多糖沉淀劑5.彈性蛋白酶:彈性蛋白的溶解6.核酸酶(DNA,RNA):未水解的核酸的沉淀,酸過(guò)量時(shí)可見(jiàn)

2、混濁.或者氮蒽橙熒光和紫外熒光7.磷酸脂酶C:卵磷脂平板的混濁圈8.磷酸脂酶A:卵磷脂平板的透明圈9.纖維素酶:纖維素平板的透明圈10.酯酶:氯化鈣和Tween20釋放出的月桂酸反應(yīng)生成月桂酸鈣沉淀.或者7-羥-4甲基香豆素?zé)晒夥磻?yīng). DNA酶:亞甲胺藍(lán)的DNA熒光變化 過(guò)氧化酶:噴灑對(duì)-茴香堿-過(guò)氧化氫酶抑制劑酶抑制劑:(用含酶的瓊脂平板上的抑制圈篩選)1.胰蛋白酶抑制劑:2.蛋白酶抑制劑 其他的代謝物其他的代謝物:1.脂類. 酵母的脂類營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生長(zhǎng)譜來(lái)?yè)斐? . N A D : 以 豬 流 感 嗜 血 菌 （haemophilus inflluenzae ）的生長(zhǎng)譜來(lái)?yè)斐?.雌激素:噴

3、灑對(duì)硝基苯重氮鹽 （1%在50%乙酸中）形成紅色撿出4.chlorostatin: Euglena gracilis 褪綠圈 4567影印法8顯微鏡 第一代 第二代 第三代9細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察在顯微鏡下觀察細(xì)菌個(gè)體的形態(tài)細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)生變化。10 細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤(rùn)，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。菌落特征與組成菌落的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀況、排列方式、好氣性和運(yùn)動(dòng)性直接相關(guān)。11 細(xì)菌個(gè)體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡(jiǎn)單染色、鑒別染色、特殊染色。12 放線菌菌落在

4、培養(yǎng)基上著生牢固，與基質(zhì)結(jié)合緊密，難以用接種針挑取。 放線菌細(xì)胞一般呈分枝無(wú)隔的絲狀，菌絲體分為在培養(yǎng)基內(nèi)部的基內(nèi)菌基內(nèi)菌絲絲和伸出培養(yǎng)基表面的氣生菌絲氣生菌絲。氣生菌絲上部分化成孢子絲，呈螺旋狀、波浪狀或分枝狀。菌絲呈各種顏色，有的能分泌水溶性色素到培養(yǎng)基內(nèi)。孢子絲長(zhǎng)出孢子，孢子形狀各異。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉狀。鏈霉菌13 霉菌是由交織在一起的菌絲體構(gòu)成。菌絲呈管狀，有的有橫隔將菌絲分割為多細(xì)胞（如青霉、曲霉），有的菌絲沒(méi)有橫隔（如毛霉、根霉）。菌絲直徑比一般細(xì)菌和放線菌菌絲大幾倍到幾十倍。菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，顏色各異，有絲狀、絨毛狀或蜘蛛網(wǎng)狀的菌絲體。 將菌絲體放在水中易變形

5、，將其置于乳酸石炭酸溶液中，保持菌絲體原形。14幾類酵母的菌落形態(tài)1.釀酒酵母2.產(chǎn)骯假絲酵母3.出芽短梗霉4.多孢絲抱酵母5.莢復(fù)膜孢酵母6.解脂復(fù)膜孢酵母7.季也蒙有孢漢遜酵母8.碎囊漢遜酵母9.卡氏酵母10.魯氏酵母11.深紅酵母12.玫紅法佛酵母13.大型羅倫隱球酵母14.美極梅奇酵母15.淺紅酵母1516一些鑒別培養(yǎng)基17 來(lái)源于不同微生物的抗生素放線菌產(chǎn)生放線菌產(chǎn)生 鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、利福霉素鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、利福霉素 慶大霉素、麥迪霉素、林可霉素等慶大霉素、麥迪霉素、林可霉素等真菌產(chǎn)生真菌產(chǎn)生 青霉素、頭孢菌素青霉素、頭孢菌素C C等等細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌產(chǎn)生 多粘菌素、桿菌

6、肽等多粘菌素、桿菌肽等 目前已篩選出抗生素達(dá)目前已篩選出抗生素達(dá)90009000種以上，每年還種以上，每年還新增百余種。投入生產(chǎn)的僅百余種。新增百余種。投入生產(chǎn)的僅百余種。菌種菌種發(fā)酵工業(yè)的核心發(fā)酵工業(yè)的核心18Current Methods of Identification19BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)20檢測(cè)原理 BIOLOG以檢測(cè)微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶與四唑類物質(zhì)（如TTC、TV）發(fā)生顏色反應(yīng)和濁度差異為基礎(chǔ)，運(yùn)用獨(dú)有的顯型排列技術(shù)檢測(cè)出每種微生物的特征指紋圖譜，在大量試驗(yàn)和數(shù)學(xué)模型基礎(chǔ)上，建立起指紋圖譜與微生物種類相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)。檢測(cè)時(shí)通過(guò)智能軟件將待鑒

7、定微生物的圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)參比，即可得出鑒定結(jié)果。21鑒定步驟分離純化分離純化平板擴(kuò)大培養(yǎng)平板擴(kuò)大培養(yǎng)制備菌懸液制備菌懸液調(diào)整濁度調(diào)整濁度接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)獲取結(jié)果獲取結(jié)果22The Bacterial Identification ProcessStep 1Step 2Step 3Step 4Step 5Isolate a pure culture on Biolog mediaDo a Gram stain and determine testingprotocolPrepare inoculum at specified cell densityInoculate and incubate M

8、icroPlateRead MicroPlate and determine ID23The Fungi Identification ProcessStep 1 Step 2 Step 3 Step 4 Step 5 Isolate a pure culture on Biolog media Harvest spores from the Fungi Prepare inoculum at specified cell density Inoculate and incubate MicroPlate Read MicroPlate every 24 hours and determine

9、 Identification 24Pure Cultures are ImportantKrieg, Bergeys Manual, 198625用木制接種棒挑用木制接種棒挑取分離良好的單取分離良好的單菌落菌落 26BIOLOG常用消耗品Microlog1Microlog2Microlog3(Microstation)培養(yǎng)基培養(yǎng)基BUG，BUABUG，BUABUG，BUA，BUY鑒定板鑒定板GN2,GP2,ANGN2,GP2,ANGN2,GP2,AN,YT,FF接種液接種液GN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IF,FF-IF其它通用消耗品其它通用消耗品疏

10、基乙酸鈉，水楊酸鈉，試管架，吸嘴，加樣槽，一次性疏基乙酸鈉，水楊酸鈉，試管架，吸嘴，加樣槽，一次性移液管，長(zhǎng)棉簽，木制接種棒。移液管，長(zhǎng)棉簽，木制接種棒。27微生物鑒定（95種碳源）微生物研究GN2鑒定革蘭氏陰性好氧菌GP2鑒定革蘭氏陽(yáng)性好氧菌AN 鑒定厭氧菌YT 鑒定酵母菌FF 鑒定絲狀真菌SFN2用于革蘭氏陰性放線菌和真菌代謝研究SFP2用于革蘭氏陽(yáng)性放線菌和真菌代謝研究ECO用于微生物特性和群落分析研究（31）MT2用于微生物代謝研究（不含碳源）ES 用于埃希氏大腸桿菌沙門氏菌的研究 （95種碳源）鑒定板種類282930Electron micrograph of strain ZJB-

11、05174 cells 31分子遺傳學(xué)鑒定分子遺傳學(xué)鑒定 32Genomic DNA extraction 33Primers design 16S/18S rDNA sequence amplification34Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)35DNA sequencing machines use fluorescent dideoxynucleotides363738394041 1001009093505924440.01 Bacillus aquimaris AY505499 Bacillus methanolicus

12、AB112729 Bacillus firmus EF032672 Bacillus oleronius AY988598 Bacillus subtilis ZJB-063 DQ474759 Bacillus subtilis AB232386 Bacillus atrophaeus isolate SCH0408 AY881241 Bacillus carboniphilus AB021182 Bacillus pseudomycoides AF013121 Bacillus indicus AJ583158 Sporolactobacillus inulinus SPO16SRR23 4

13、2 10a 1001001001007610010096100100687210056100721000.05 Cryptococcus adeliensis strain LEVX01 (DQ269445) Cryptococcus adeliensis strain RKI 456/93 (AY733078) Cryptococcus albidus var. ovalis strain CBS5810 (AF145329) Cryptococcus antarcticus strain CBS7687 (AF145326) Cryptococcus magnus (AY188384) C

14、ryptococcus vishniacii (AB032689) Rhodotorula mucilaginosa (DQ402533) Rhodosporidium kratochvilovae (DQ402534) Rhodotorula glutinis (AM160642) Itersonilia perplexans isolate AFTOL-ID 1896 (DQ667163) Xanthophyllomyces dendrorhous strain ATCC 24261 (DQ661025) Xanthophyllomyces dendrorhous strain KBP 2

15、604 (DQ661026) Xanthophyllomyces dendrorhous strain ATCC 24229 (DQ661023) Phaffia rhodozyma strain ZJB 00010 (DQ999084) Phaffia rhodozyma strain CBS 5905 (AF139629) Tricholoma aurantium isolate OUC99349 (DQ367919) Tricholoma saponaceum var. saponaceum isolate OUC99343 (DQ370440) Cyphellostereum laev

16、e isolate AFTOL-ID 982 (DQ486699) Phellinus linteus strain SFC 20001106-7 (AF534070) Phellinus baumii strain SFC 960405-4 (AF534068) 43微生物菌種保藏及其專利申請(qǐng) 按照1977年4月28日各國(guó)于布達(dá)佩斯簽訂于1980年9月26日修正的國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的解釋， “微生物菌種保藏”的概念是：“向接收與受理微生物的國(guó)際保存單位送交微生物或由國(guó)際保存單位貯存此種微生物，或兼有上述送交與貯存兩種行為”。 如果發(fā)明涉及新的微生物、微生物學(xué)方法或者

17、其產(chǎn)品，而且使用的微生物是公眾不能得到的，在申請(qǐng)專利前或最遲在申請(qǐng)日，必須按各國(guó)的專利法的有關(guān)規(guī)定對(duì)微生物進(jìn)行保藏，申請(qǐng)專利時(shí)還需提供相應(yīng)的申請(qǐng)文件。 44國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約 1.締約國(guó)允許或要求保存用于專利程序的微生物的, 應(yīng)承認(rèn)為此種目的而在任一國(guó)際保存單位所做的微生物保存。這種承認(rèn)應(yīng)包括承認(rèn)由該國(guó)際保藏單位說(shuō)明的保存事實(shí)和交存日期，以及承認(rèn)作為樣品提供的是所保藏的微生物樣品。 2.任一締約國(guó)均可索取由國(guó)際保藏單位發(fā)出的 (1) 項(xiàng)所述保藏的藏單副本。 45我國(guó)專利法還應(yīng)辦理下列手續(xù)1.在申請(qǐng)日前或者最遲在申請(qǐng)日，將該微生物菌種提交專利局指定的微生物菌種保藏單位保

18、藏，并在申請(qǐng)時(shí)或者最遲自申請(qǐng)日起三個(gè)月內(nèi)提交保藏單位出具的保藏證明和存活證明；期滿未提交證明的，該菌種被視為未提交保藏；2.在申請(qǐng)文件中，提供有關(guān)微生物特征的資料；3.涉及微生物菌種保藏的專利申請(qǐng)應(yīng)當(dāng)在請(qǐng)求書各說(shuō)明書中寫明該微生物的分類命名（注明拉丁文名稱）、保藏該微生物菌種的單位名稱、地址、保藏日期和保藏編號(hào)；申請(qǐng)時(shí)未寫明的，應(yīng)當(dāng)自申請(qǐng)日起三個(gè)月內(nèi)補(bǔ)正；期滿未補(bǔ)正的，該菌種被視為未提交保藏。 4647對(duì)基因的占有方式是“基因?qū)＠?基因?qū)＠ＷC了專利擁有者對(duì)基因應(yīng)用領(lǐng)域的高度壟斷，其潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值和高額回報(bào)使得各國(guó)的研究機(jī)構(gòu)和大小公司紛紛投入巨額資金。難以想象，如果沒(méi)有專利的保護(hù)，制藥公司還會(huì)

19、不會(huì)對(duì)基因開發(fā)下這么大的賭注，還會(huì)不會(huì)有基因相關(guān)產(chǎn)品走向市場(chǎng)。正是因?yàn)榛驅(qū)＠x予的高度壟斷，生物技術(shù)領(lǐng)域每一項(xiàng)重要產(chǎn)品的問(wèn)世幾乎都會(huì)引來(lái)激烈的專利之爭(zhēng)。 48基因?qū)＠纳虡I(yè)價(jià)值 基因?qū)＠茄兄崎_發(fā)相關(guān)產(chǎn)品的基礎(chǔ)，基因?qū)＠臋?quán)利人不僅可以通過(guò)專利合作或轉(zhuǎn)讓獲得收益，而且還可以從基于該基因?qū)＠幕虍a(chǎn)物以及其他衍生產(chǎn)品后期銷售收入中按一定比例提成。一個(gè)具有重要功能的疾病或產(chǎn)物相關(guān)基因的專利，轉(zhuǎn)讓價(jià)值一般以千萬(wàn)美元計(jì)，而以此開發(fā)的基因藥物年銷售額可高達(dá)幾億至幾十億美元。 49基因藥靶的價(jià)值 1998年9月，Millennium公司與Bayer公司簽訂了五年的基因藥物合作協(xié)議，Bayer公司將向M

20、illennium支付總計(jì)4.65億美元(包括14%的股權(quán)投資)費(fèi)用，委托Millennium公司開發(fā)225種基因藥靶，平均每個(gè)基因藥靶的價(jià)值為207萬(wàn)美元。 促紅細(xì)胞生成素EPO：美國(guó)Amgen公司依賴EPO基因?qū)＠拈_發(fā)應(yīng)用，從一個(gè)瀕臨破產(chǎn)的企業(yè)成為美國(guó)生物工程醫(yī)藥領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊，其EPO1998年的銷售收入達(dá)到13.6億美元，而EPO的全球市場(chǎng)現(xiàn)已達(dá)到34億美元的銷售額。 50基因?qū)＠姆尚Я?基因?qū)＠芊傻谋Ｗo(hù)，專利侵權(quán)將要受到法律的制裁。而且，專利授予與否的問(wèn)題也要服從于法律。 HIV受體專利基因?qū)＠膲艛嘈栽疝Z動(dòng)，2000年2月16日美國(guó)主要從事人類基因測(cè)序和商業(yè)化開發(fā)的人類

21、基因組科技股份有限公司(HGS)宣布：她向美國(guó)專利和商標(biāo)局(PTO)成功申請(qǐng)了一個(gè)在HIV(艾滋病病毒)感染中起關(guān)鍵作用的基因的專利，該基因編碼一個(gè)稱作CCR5的細(xì)胞表面受體蛋白，該蛋白是HIV病毒侵入人體細(xì)胞所必需結(jié)合的位點(diǎn)。HGS指出：“該專利覆蓋了艾滋病治療的關(guān)鍵點(diǎn)” ，HGS已授權(quán)其制藥業(yè)的合作伙伴開發(fā)艾滋病治療類藥物，HGS本身也試著進(jìn)行一些對(duì)付HIV感染的有關(guān)抗體的研究。HGS預(yù)計(jì)：“以CCR5為藥靶開發(fā)的新藥，包括艾滋病治療類藥物以及抗?jié)兒涂惯^(guò)敏類藥物，每年的銷售額能達(dá)到400億美元。”消息公布后，HGS股價(jià)當(dāng)天創(chuàng)出新高，達(dá)到188美元/股，一天內(nèi)漲幅高達(dá)21%。 51HGS僅

22、僅因?yàn)閷?duì)CCR5基因測(cè)了序，就獲得了基于CCR5的有關(guān)專利權(quán)，而1996年那些首先發(fā)現(xiàn)“HIV通過(guò)與CCR5受體結(jié)合而侵染人體免疫細(xì)胞”的科學(xué)家以及那些在愛(ài)滋病研究領(lǐng)域做出了巨大貢獻(xiàn)的科學(xué)家，卻因在專利申請(qǐng)上比HGS晚了一步而無(wú)法享用基于CCR5基因的有關(guān)專利?？茖W(xué)家們認(rèn)為“專利局把CCR5基因的潛在商業(yè)價(jià)值優(yōu)先給予了一個(gè)只是做些基因測(cè)序等輔助工作的公司，而不授予為識(shí)別該受體、研究其功能做了大量科研工作的科學(xué)家，實(shí)在不太公平?！睂＠值膽B(tài)度是，他們?nèi)匀豢梢允芾砥渌膶＠?。但專利之間的相互交叉和覆蓋勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生碰撞，難免帶來(lái)嚴(yán)重的法律問(wèn)題。 然而，HGS并不認(rèn)為她僅僅是通過(guò)基因測(cè)序而獲得了CCR5

23、的優(yōu)先權(quán)，她是以測(cè)序結(jié)果為切入點(diǎn)，通過(guò)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)分析推測(cè)基因的功能，然后再通過(guò)生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行基因功能的研究和相關(guān)藥物的開發(fā)的。不過(guò)，HGS承認(rèn)她在提交CCR5專利申請(qǐng)的時(shí)候并不知道CCR5與艾滋病之間的關(guān)系。HGS認(rèn)為發(fā)現(xiàn)CCR5生物學(xué)功能的科學(xué)家們應(yīng)該得到認(rèn)可，HGS將在科研方面與科學(xué)家們共享CCR5的有關(guān)數(shù)據(jù)和試劑，但在相關(guān)藥物開發(fā)方面，HGS是要嚴(yán)格執(zhí)行其專利權(quán)利的。 由此可見(jiàn)，誰(shuí)擁有了基因?qū)＠?，誰(shuí)就擁有了該基因所有用途的獨(dú)占性開發(fā)權(quán)，實(shí)現(xiàn)的將是對(duì)整個(gè)產(chǎn)業(yè)的壟斷。 52生物技術(shù)專利戰(zhàn)略 當(dāng)今全球性經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)是一種以科技競(jìng)爭(zhēng)為中心的角逐，而最先進(jìn)的科技發(fā)明信息有 90被收集在專利文獻(xiàn)

24、中，專利保護(hù)對(duì)鼓勵(lì)工業(yè)領(lǐng)域的創(chuàng)造和促進(jìn)產(chǎn)品的開發(fā)和銷售起著重要作用。因?yàn)閯?chuàng)造性受到專利法的保護(hù)，所以，企業(yè)就愿意投資研究新技術(shù)，開發(fā)新產(chǎn)品。 近年來(lái)，各國(guó)科學(xué)家們也深切地體會(huì)到，傳統(tǒng)的科學(xué)宗旨已讓位于自我利益，擁有專利和對(duì)專利的追求將激發(fā)新的發(fā)明創(chuàng)造，從發(fā)明創(chuàng)造中獲得公共的關(guān)注和經(jīng)濟(jì)資助變成了科學(xué)研究的原動(dòng)力。西方大公司是世界上發(fā)明專利的主要申請(qǐng)者和利用者，其專利戰(zhàn)略就是如何有目的、有效地利用這一制度。 5354定義定義 菌種保藏菌種保藏是指在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌是指在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株的基礎(chǔ)上，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、株的基礎(chǔ)上，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、

25、不衰、不污染以便于研究、交換和使用的目的。不污染以便于研究、交換和使用的目的。 第二節(jié)第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的保藏工業(yè)微生物菌種的保藏55 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量降低生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異減少其變異。一般可通過(guò)保持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低水平，缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于水平，缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“休眠休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力狀態(tài)，抑制其繁殖能力。 一種好的保藏方法，首先應(yīng)能長(zhǎng)期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變。 菌種保藏的原菌種保藏的原理理56 菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：

26、菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：A 斜面冰箱保藏法斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一種短期、過(guò)渡的保藏方法斜面保藏是一種短期、過(guò)渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長(zhǎng)豐滿后，放在4冰箱保存。一般保存期為三個(gè)月到六個(gè)月冰箱保存。一般保存期為三個(gè)月到六個(gè)月。57B 沙土管保藏法沙土管保藏法 這是國(guó)內(nèi)常采用的一種方法。適合于產(chǎn)孢子或芽孢產(chǎn)孢子或芽孢的微生物。制備方法制備方法：首先，將沙與土洗凈烘干過(guò)篩洗凈烘干過(guò)篩后，按沙與土的比例為按沙與土的比例為l 2 l混合均勻混合均勻，分裝于小試管中，裝料高度約為1厘米厘米左右左右，121C間歇滅菌三次間歇滅菌三次，滅菌試驗(yàn)合格后烘干備用。一般沙用沙用80目過(guò)篩目過(guò)篩，土用土用30100目過(guò)篩目過(guò)篩。其次，將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或?qū)⑿泵骀咦庸蜗轮苯优c沙土混合直接與沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱內(nèi)保存。一般保存期為保存期為1年左右年左右。 58C、石蠟油封存法、石蠟油封存法 向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過(guò)菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細(xì)菌、霉菌、通用于不能利用石蠟油作碳源的細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物的保存酵母等微生物的保存。 保存期約一年左右。保存期約一年左右。59D、真空冷凍干燥保減法、真空