ELISA試劑選用和質(zhì)檢

1、ELISA試劑的選用和質(zhì)檢 衛(wèi)生部臨床檢驗中心影響試劑盒質(zhì)量的因素試劑盒的選用試劑盒的質(zhì)檢方法目前試劑盒存在的問題影響試劑盒質(zhì)量的因素1原材料(1)固相材料 商品ELISA試劑盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板，其對ELISA試劑盒的影響在于孔間的顯色差異。(2)抗原 -自然抗原、合成抗原和基因重組抗原。純 度：純度不高可致試劑盒的特異性不強。立體結(jié)構(gòu)：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完整抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)決定簇，用于相應的抗HCV和抗HIV抗體的檢測有可能導致結(jié)合上述決定簇的抗體漏檢。影響試劑盒質(zhì)量的因素(3)抗體 多克隆抗體(多抗)：制備簡單，含針對抗原的多種決定簇，但抗體的親和力和特異性相

2、對要低于單抗，且每次制備的抗體在其親和力和特異性上均有區(qū)別。單克隆抗體(單抗)：可無限大量的得到針對單一決定簇的抗體，缺點是結(jié)合的單一性。當建立雙抗夾心ELISA測定方法時，如包被和指示抗體使用同一單抗，則由于結(jié)合位點的缺乏，很容易造成假陰性結(jié)果，尤其是在使用一步法時“鉤狀”效應(Hookeffect)的出現(xiàn)。因此，在使用單抗建立雙抗夾心ELISA方法時，包被和指示抗體常使用針對抗原的不同決定簇的單抗，包被抗體可為混合單抗，從而使得固相抗體在免疫測定中能更為完全地結(jié)合待測物中的特異抗原。影響試劑盒質(zhì)量的因素(4)酶結(jié)合物 ELISA試劑盒的核心部分，通常ELISA試劑盒的有效使用期限即是根據(jù)酶

3、結(jié)合物的穩(wěn)定性而定的。辣根過氧化物酶(HRP)：易于提取，價格相對低廉；性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱及有機溶劑的作用，與抗原或抗體偶聯(lián)后，活性很少受損失。堿性磷酸酶(ALP)：堿性磷酸酶用于ELISA必須注意的是含磷酸鹽的緩沖液對其酶活性的抑制作用F半乳糖甘酶影響試劑盒質(zhì)量的因素(5)色原底物：HRP最常用的色原底物有鄰苯二胺(OPD)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 。鄰苯二胺(OPD)：OPD被認為是HRP最為敏感的色原底物之一，當pH值降為1.0時，最大吸收波長為492nm，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。OPD的缺點是其對機體具有致突變作用。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm

4、處有最大消光系數(shù)。試劑盒中常為已配好的A、B兩種液態(tài)試劑，即一定濃度雙氧水溶液和TMB。它們在溶液中相對不穩(wěn)定，因此在使用ELISA試劑盒時，如底物A或和B出現(xiàn)顏色，或各取一滴混合后顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染，必須廢棄。 影響試劑盒質(zhì)量的因素2試劑盒的方法學設(shè)計雙抗原夾心法測抗體(抗HIV、Tp) 洗板待測抗體底物溫育顯色酶標抗原EE洗板固相抗原EEEEEEE影響試劑盒質(zhì)量的因素間接法測抗體（抗HCV、Tp) 洗板待測抗體底物溫育顯色E酶標抗體EE洗板EEEEEE固相抗原影響試劑盒質(zhì)量的因素雙抗體夾心法測抗原-兩步法固相抗體溫育待測抗原底物溫育顯色E酶標抗體EEEEEEEE影

5、響試劑盒質(zhì)量的因素雙抗體夾心法測抗原-一步法待測抗原底物溫育顯色固相抗體E酶標抗體EEEEE洗板EEEEEEE影響試劑盒質(zhì)量的因素3試劑盒的運輸和貯存ELISA試劑盒的效期一般為6個月，這是指在貯存溫度為28C的情況下，但一個試劑盒從出廠至用戶手中，均要經(jīng)歷運輸(如送檢、檢定、發(fā)貨等)及運輸中的貯存，某一環(huán)節(jié)的不當，均會影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量。試劑盒的選用1根據(jù)可能影響試劑盒質(zhì)量的因素，從以下幾個方面來判斷該試劑盒是否符合我們的要求 效期 固相材料的來源 包被抗體或抗原的性質(zhì)(單抗、多抗或合成多肽或重組多肽) 顯色底物(是TMB還是OPD) 測定模式(一步法或二步法)試劑盒的選用2同行對有關(guān)

6、試劑盒的使用效果 個別的使用效果個別的使用效果 在實際工作中，其它實驗室對某種試劑盒的實際使用效果，往往具有很強的說服力。 綜合的使用評價綜合的使用評價對一種試劑盒的綜合使用評價，是指多個實驗室對這種試盒實際應用效果的綜合分析。ELISA試劑盒的質(zhì)檢 1.包裝、儲存狀態(tài) 內(nèi)外包裝、效期、試劑瓶是否漏液，真空包裝是否破損，試劑是否齊全等等 2.采用血清盤(panel)質(zhì)檢 血清盤由一定數(shù)量的陰、陽性樣本組成，可用來判斷試劑盒的靈敏度、特異性和符合率，如HBsAg、抗HCV和抗HIV等血清盤。ELISA試劑盒的質(zhì)檢使用待檢試劑盒測定血清盤中的各份樣本，以血清盤的結(jié)果為相對標準，依照表 2 的 公式

7、，計算被檢試劑盒的靈敏度、特異性和符合率。 表 2 試劑盒評價四格表 血清盤結(jié)果 + 合 計 待檢試劑盒 + a b a+b 結(jié) 果 c d c+d 合 計 a+c b+d a+b+c+d 表中 a 為真陽性，b 為假陽性，c 為假陰性，d 為真陰性。于是，被評價試劑盒的各項 指標以下列公式計算： 靈敏度()caa100 特異性()= dbd100 符合率()= dcbada100 一般認為，符合率大于 90為有高度相關(guān)性試劑。 ELISA試劑盒的質(zhì)檢-HBsAg樣本編號 結(jié)果 大約含量 (ng/ml) 樣本編號 結(jié)果 大約含量 (ng/ml) 1 + 8 16 + 約 0.5 2 + 500

8、 17 3 + 0.2 18 + 約 0.7 4 19 5 20 + 100,000 6 21 + 200,000 7 + 15 22 + 20-30 8 + 約 0.5 23 + 2 9 24 + 2,000 10 + 12 25 + 50 11 26 + 10,000 12 27 + 200 13 28 + 10 14 29 15 30 + 12 ELISA試劑盒的質(zhì)檢-抗HCV 確認結(jié)果 確認結(jié)果 編號 結(jié)果 NS4 NS3 C NS5 編號 結(jié)果 NS4 NS3 C NS5 17 + + 30 + + + + + 18 + + 31 + +/- + 19 + + + + + 32 +

9、+ + + + 20 + + + + + 33 + + + 21 + +/- + 34 + + + + 22 + + + + + 35 + +/- + 23 + + + + + 36 + + + +/- 24 + + + + + 37 + + 25 + + + + + 38 + + + + + 26 + + + + + 39 + + + + + 27 + + 40 + + + + + 28 + + + + + 29 + + + + + ELISA試劑盒的質(zhì)檢-TP樣 本 編 號 初 篩 (R PR /T R U S T ) 確 認 (E IA /T PP A ) 樣 本 編 號 初 篩 (R

10、PR /T R U S T ) 確 認 (E IA /T PP A ) 17 + + 29 +* + 18 + 30 +* + 19 + 31 + + 20 + + 32 + + 21 + 33 +* + 22 + + 34 + + 23 + 35 + + 24 +* 36 +* +* 25 + 37 + 26 + + 38 + 27 +* + 39 + + 28 + 40 +* + ELISA試劑盒的質(zhì)檢3.采用弱陽性定值質(zhì)控血清進行質(zhì)檢對不同廠家或同一廠家不同批號試劑盒采用同一弱陽性定值質(zhì)控血清檢測，可比較出不同廠家或不同批號試劑盒的檢測靈敏度(測定下限)的差異，對判斷試劑盒的質(zhì)量及其穩(wěn)定

11、性具有重要的參考價值。檢驗結(jié)果的正確與否，是試劑盒質(zhì)量、人員素質(zhì)、儀器設(shè)備狀態(tài)和室內(nèi)質(zhì)控措施等的綜合反應，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都會導致檢測的失敗。 目前試劑盒存在的問題-抗HCV表15-1. 三代抗HCV ELISA測定試劑的比較 試試 劑劑 包被抗原 窗口期 敏感性 特異性 第一代 C1003 34個月 8090 假陽性較高 第二代 C223、C33C和C1003 812周 90以上 特異 第三代 C223、C33C和NS5 610周 95 特異性更好 目前試劑盒存在的問題-抗HCV試劑的不足之處 1.主要是在低危人群中仍發(fā)現(xiàn)大量的不確定和假陽性結(jié)果，再則仍有較長的“窗口期”。 2.核心區(qū)

12、抗原的減少程度把握不好的話，有可能會導致漏檢的發(fā)生。 3.由于這些試劑所使用HCV抗原只是病毒的部份重組多蛋白或合成肽抗原，加之，固相對這些蛋白或多肽的吸附能力的局限性，使得固相上能捕獲抗體的抗原決定基的數(shù)量有限，從而影響測定的敏感性。 目前試劑盒存在的問題-抗HCV兩家試劑檢測結(jié)果不一致 1.不同試劑廠家的ELISA試劑盒所用包被抗原的差異：目前抗HCV檢測ELISA試劑盒均采用HCV的基因工程或合成多肽抗原（核心區(qū)、NS3、NS4和NS5等）包被固相，以間接法進行測定，由于上述HCV抗原的組合、來源及用量等方面的差異。 2.所用包被抗原成份相互之間抗原決定簇的覆蓋，這種覆蓋將嚴重影響ELI

13、SA測定的敏感性。 表 1. 22 份 HCV RNA 陽性血清抗-HCV ELISA 檢測及 RIBA 確認結(jié)果 ORTHO RIBA 結(jié)果 樣本 編號 NS3 NS4 NS5 C A (S/CO) B (S/CO) C (S/CO) D (S/CO) E (S/CO) F (S/CO) G (S/CO) 1 + +3.3 +1.4 +1.2 +4.6 2 + +1.1 0.8 +2.0 +1.9 3 + +1.6 +1.9 +1.9 +2.8 +2.4 +1.3 +1.3 4 + +2.8 5 + +2.1 +2.5 +3.5 +2.9 6 + +5.0 +2.4 +3.6 +2.0 +2

14、.3 7 + +2.5 0.8 0.7 +1.3 +1.1 8 + +2.4 +1.0 0.8 +2.3 9 + +2.2 +3.3 +2.0 +2.1 +4.9 +3.2 +4.7 10 + +7.1 +1.3 +3.6 +7.6 +2.0 +2.0 +1.1 11 + +2.7 +1.9 0.7 +1.5 +2.9 12 + + +6.8 +6.9 +5.0 +6.8 +3.0 +1.3 +2.1 13 + + +3.2 +2.3 +4.7 +3.6 +2.2 +2.0 +1.0 14 + + + +4.3 +10.5 +1.4 +3.2 +2.0 +1.9 +1.6 15 + + + +

15、1.8 +2.5 0.8 +1.8 +2.7 +1.1 1.3 16 + + +3.0 +1.1 17 + + 0.8 0.9 18 * * +2.6 +1.0 +1.3 +5.4 +3.0 +1.2 +1.2 19 +2.1 +1.37 +4.7 +2.3 +1.6 +1.6 20 +2.0 +1.2 +1.0 +4.6 +2.4 +1.7 +1.6 21 * * +3.0 +1.2 +1.2 +3.0 +2.4 +1.7 +3.0 22 * * +2.6 +1.0 +1.3 +5.4 +3.0 +1.2 +1.2 表 2.53 份樣本 RIBA 確認、抗-HCV ELISA 檢測及 HCV

16、 RNA 檢測結(jié)果 ORTHO RIBA 結(jié)果 樣本數(shù) 國產(chǎn) ELISA 進口 ELISA HCV RNA NS3 NS4 NS5 C 試劑檢出率 試劑檢出數(shù) 陽性結(jié)果數(shù) + 2 70.0% 33.3% 1/2 + 10 50.0% 53.3% 4/10 + 2 30.0% 33.3% 0/2 + 3 33.3% 33.3% 0/3 + 3 46.7% 33.3% 0/3 + 1 60.0% 100.0% 1/1 + 3 93.3% 77.8% 2/3 + 4 85.0% 75% 2/4 + + 1 100.0% 100.0% 1/1 + + 3 73.3 88.9% 2/3 + + 2 20

17、.0% 16.7% 0/2 + + + 3 100.0% 88.9% 2/3 + + + 2 100.0% 100.0% 0/2 14 57.1% 50.0% 8/14 目前試劑盒存在的問題-抗HCV對策-通常的做法是：初檢陰性的血袋再用與不同廠家的國產(chǎn)試劑復檢，如仍為陰性，血即為合格?；虺鯔z使用國產(chǎn)ELISA試劑，復檢采用進口試劑。對策-應采取的辦法：在血站篩檢獻血員血時，初檢陰性尤其是S/CO值較高的血液，最好使用不同ELISA試劑盒復檢，這樣才能最大程度的減少經(jīng)輸血HCV感染的發(fā)生。 目前試劑盒存在的問題-抗HCV抗HCV ELISA出現(xiàn)假陽性的主要原因有：1.類風濕因子（RF）的干擾2

18、.高免疫球蛋白血癥3.標本中超氧化物歧化酶（SOD）的干擾4.用于固相包被的HCV基因工程抗原不純目前試劑盒存在的問題-抗HIV采用雙抗原夾心一步法檢測抗HIV -“鉤狀效應”所致的假陰性問題。 1.原因：HIV感染者中有些抗體滴度很高，采用可出現(xiàn)雙抗原夾心一步法檢測，可出現(xiàn)類似雙抗體夾心一步法檢測抗原的“鉤狀效應”現(xiàn)象。 2.措施：在血站篩檢獻血員時，應使用二步法試劑盒進行檢測，或是對標本進行雙份同時檢測，一份原標本，一份1:10或1:100稀釋標本，從而避免漏檢。目前試劑盒存在的問題-抗HIVELISA測定結(jié)果的解釋1.一般來說，一個感染HIV的患者，使用商品ELISA試劑盒測定，結(jié)果應為

19、陽性，因為在這些試劑盒中所用的包被抗原主要為gag編碼蛋白和病毒包膜蛋白，針對這些蛋白的抗體在HIV感染的機體免疫應答中出現(xiàn)最早，而ELISA的測定敏感性足以將其早期測出，因此如果懷疑有可能的HIV感染，但ELISA測定結(jié)果為陰性，則HIV感染的可能性很小。2.實驗操作或試劑有問題或不能確定可能出現(xiàn)感染的確切日期，如果HIV抗體ELISA測定為陰性，就不必立即重復檢測。3.對于處于陽性判斷值（Cut-off）邊緣即稍低于Cut-off的樣本，難于判斷是否為感染早期，或?qū)嶋H為非感染者的樣本，此時,可以再次取血測定和/或用另一種ELISA試劑盒檢測，從而明確測定結(jié)果。這種情況下，如果測定結(jié)果仍處于

20、Cut-off邊緣，則建議數(shù)月后再次測定,如仍無改變,則說明無HIV感染.其它如免疫印跡,PCR測定HIV RNA也為此種情況下的HIV感染驗證實驗.目前試劑盒存在的問題-梅毒螺旋體抗體梅毒螺旋體抗體 檢測方法1.檢測非特異性抗體-使用類脂質(zhì)抗原的血清學試驗 ：RPR、TRUST2.檢測特異性抗體-使用密螺旋體抗原的血清學試驗：FTA-ABS、TPHA、TPPA 、ELISA 、WB樣 本編號 ELISA 檢測結(jié)果 IgG IgM 1 2 3 Western Blot 檢測結(jié)果 Tp14 Tp17 Tp22 Tp25 Tp45 Tp47 X403 96.7 0.76 9.2 5.8 6.6 +

21、 + + + X404 56.0 0.38 6.4 3.0 4.5 + + + + X405 142.6 0.54 5.2 9.3 8.4 + + + + X406 91.8 0.44 4.6 9.1 4.6 + + + + + X407 137.9 0.37 2.8 3.7 8.1 + + + + + X408 26.8 0.47 8.3 7.1 6.5 + * * * * X409 147.7 1.28 9.3 1.9 5.6 + + + + X410 161.0 0.82 6.6 5.0 4.3 + + + + + X411 62.8 0.60 4.3 9.8 8.2 + + + + *

22、 X528 165.3 0.30 12.3 8.8 11.8 LN59 85.4 0.22 9.6 12.0 9.48 LN60 8.48 0.18 4.1 - 2.83 - - - - - - LN61 200 1.92 2.56 12.7 13.2 + + * LN62 - 0.24 1.21 0.96 1.34 - - - - - - LN63 102.9 0.1 9.48 11.1 8.97 + + + + + LN64 200 0.51 2.63 14.7 12.8 LN65 18.8 0.2 5.68 2.06 4.71 + + + + LN66 41.0 0.3 4.43 12.

23、2 5.81 LN67 168.4 0.2 9.70 14.2 11.8 LN68 - 0.1 4.56 4.84 3.51 + + + + 目前試劑盒存在的問題-HBsAg檢測靈敏度 據(jù)文獻報道，到目前為止在獻血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg 攜帶者最低含量為0.2 ng/ml。病毒變異 個別關(guān)鍵的氨基酸的替代變異，足以改變HBsAg 的構(gòu)型，從而改變其抗原特性 不同亞型試劑盒臨床試用評價NoImage試劑盒臨床試用評價項 目 試 劑 編 碼 陽 性 符 合 率 % 陰 性 符 合 率 % 總 符 合 率 % 使 用 單 位 數(shù) 得 分 均 值 P T 評 價 2 3 0 0 1 9 9 .3 9 9 9 .1 8 7 9 9 .2 6 8 8 2 0 .9 9 3 9 9 2 3 0 0 2 1 0 0 1 0 0 1 0 0 7 1 1 0 0 2 3 0 0 3 1 0 0 9 8 .5 1 5 9 9 .1 1 1 3 5 0 .9 9 1 9 9 2 3 0 1 5 1 0 0 1 0 0 1 0 0 5 1 1 0 0 2 3 0 1 6 1 0 0 9 3 .3 3 3 9 6 5 0 .9 6 9 6 2 3 0 1 8 1 0 0 9 8 .4 1 3 9