熒光分析法實驗版

1、熒光分析法第一節(jié) 概 述 當紫外線照射到某些物質(zhì)的時候，這些物質(zhì)會發(fā)射出各種顏色和不同強度的可見光，而當紫外線停止照射時，所發(fā)射的光線也隨之很快地消失，這種光線被稱為熒光(fluorescence)。 由于不同的物質(zhì)其組成與結(jié)構(gòu)不同，所吸收光由于不同的物質(zhì)其組成與結(jié)構(gòu)不同，所吸收光的波長和發(fā)射光的波長也不同，利用這個特性可以進的波長和發(fā)射光的波長也不同，利用這個特性可以進行物質(zhì)的定性鑒別。如果該物質(zhì)的濃度不同，它所發(fā)行物質(zhì)的定性鑒別。如果該物質(zhì)的濃度不同，它所發(fā)射的熒光強度就不同，測量物質(zhì)的熒光強度可對其進射的熒光強度就不同，測量物質(zhì)的熒光強度可對其進行定量測定。行定量測定。 熒光分析法（熒光

2、分析法（fluorescence analysis）就是利）就是利用物質(zhì)的熒光特征和強度，對物質(zhì)進行定性和定量分用物質(zhì)的熒光特征和強度，對物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。析的方法。 熒光分析法具有靈敏度高，比分光光度法高103104倍。線性范圍寬，方法簡便快速且選擇性較好等多優(yōu)點。近20年來，各式各樣新型熒光分析儀不斷問世，熒光分析法發(fā)展迅速，應(yīng)用面日益拓寬，尤其是在生物試樣的分析及生命科學(xué)研究方面（如DNA序列分析等）展現(xiàn)出廣闊的前景。一、熒光的產(chǎn)生一、熒光的產(chǎn)生物質(zhì)分子的能級包括一系列電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級。物質(zhì)分子的能級包括一系列電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級。分子吸收能量后，從基態(tài)最

3、低振動能級躍遷到第一電子激發(fā)分子吸收能量后，從基態(tài)最低振動能級躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)的不同振動能級（這一過程速度很快，態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)的不同振動能級（這一過程速度很快，大約大約1010-15 -15 s s），成為激發(fā)單重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，），成為激發(fā)單重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以通過以下幾種途徑釋放能量返回基態(tài)?？梢酝ㄟ^以下幾種途徑釋放能量返回基態(tài)。1. 1. 振動馳豫振動馳豫2. 2. 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換3. 3. 熒光熒光4. 4. 系間竄躍系間竄躍5. 5. 磷光磷光（一）熒光的檢測 光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分出不同波長的激發(fā)光，照射到樣品溶液上，激發(fā)樣

4、品產(chǎn)生熒光。樣品發(fā)出的熒光為寬帶光譜，需通過發(fā)射單色器分光后再進入檢測器，檢測不同發(fā)射波長下的熒光強度F。由于激發(fā)光不可能完全被吸收，可透過溶液，為了防止透射光對熒光測定的干擾，常在與激發(fā)光垂直的方向檢測熒光（因熒光是向各個方向發(fā)射的）。 （二）激發(fā)光譜與熒光光譜的形成 任何熒光物質(zhì)，都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜(excitation spectrum)和熒光發(fā)射光譜(fluorescence emission spectrum)。 1. 激發(fā)光譜 保持熒光發(fā)射波長不變（即固定發(fā)射單色器），依次改變激發(fā)光波長（即調(diào)節(jié)激發(fā)單色器），測定不同波長的激發(fā)光激發(fā)下得到的熒光強度F（即激發(fā)光波長掃描）

5、。然后以激發(fā)光波長為橫坐標，以熒光強度F為縱坐標作圖，就可得到該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。 激發(fā)光譜上熒光強度最大值所對應(yīng)的波長就是最大激發(fā)波長，是激發(fā)熒光最靈敏的波長。物質(zhì)的激發(fā)光譜與它的吸收光譜相似，所不同的是縱坐標。2. 熒光光譜 熒光光譜，又稱發(fā)射光譜。保持激發(fā)光波長不變（即固定激發(fā)單色器），依次改變熒光發(fā)射波長，測定樣品在不同波長處發(fā)射的熒光強度F。以發(fā)射波長為橫坐標，以熒光強度F為縱坐標作圖，得到熒光發(fā)射光譜。熒光發(fā)射光譜上熒光強度最大值所對應(yīng)的波長就是最大發(fā)射波長。 三、影響熒光產(chǎn)生及熒光強度的因素影響熒光產(chǎn)生及熒光強度的因素（一）物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件（一）物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件 一

6、種物質(zhì)能否發(fā)熒光以及熒光強度的高低，與它的分子結(jié)構(gòu)及所處的環(huán)境密切相關(guān)。能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)都應(yīng)同時具備兩個條件： 1. 物質(zhì)分子必須有強的紫外吸收（有*躍遷）； 2. 物質(zhì)具有較高的熒光效率（fluorescence efficiency）。熒光效率也稱熒光量子產(chǎn)率，用f 表示。 可見，凡是使 kF 增加，使其它去活化常數(shù)降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn)率。通常，kF 由分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因），而其它參數(shù)則由化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。PECISCICVRFFfkkkkkkk吸收的光量子數(shù)發(fā)射的熒光量子數(shù)（二）影響熒光及其強度的因素。（二）影響熒光及其強度的因素。躍遷類型：如上所述，物質(zhì)必須在紫外可見區(qū)

7、有強吸收和高熒光躍遷類型：如上所述，物質(zhì)必須在紫外可見區(qū)有強吸收和高熒光效率才能產(chǎn)生熒光。具有效率才能產(chǎn)生熒光。具有 * * 躍遷的分子才有強吸收。躍遷的分子才有強吸收。 * * 躍遷的躍遷的 大。大。共軛效應(yīng)：大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，共軛效應(yīng)：大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，具有共軛的具有共軛的 * 躍遷。其共軛程度愈大，熒光效率也愈躍遷。其共軛程度愈大，熒光效率也愈大，且最大激發(fā)和發(fā)射波長都向長波長方向移動，如苯、大，且最大激發(fā)和發(fā)射波長都向長波長方向移動，如苯、萘、蒽三種物質(zhì)。萘、蒽三種物質(zhì)。剛性平面結(jié)構(gòu)：剛性平面結(jié)構(gòu)：當熒光分子共軛程度相同時，分子的當熒光分

8、子共軛程度相同時，分子的剛性和共平面性越大，熒光效率越大。剛性和共平面性越大，熒光效率越大。 COOOCOO熒光物質(zhì)（熒光素）COOCOO菲熒光物質(zhì)（酚酞）取代基團取代基團溫度溫度溶劑溶劑pH值值熒光熄滅熒光熄滅 由于熒光物質(zhì)分子間或與其它物質(zhì)相互作用，引起熒光強度顯著下降的由于熒光物質(zhì)分子間或與其它物質(zhì)相互作用，引起熒光強度顯著下降的現(xiàn)象叫做熒光熄滅（現(xiàn)象叫做熒光熄滅（quenchingquenching）或猝滅。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅或猝滅。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物

9、、重氮化合物和羧基化合物等。合物等。 造成熒光熄滅的原因有多種：造成熒光熄滅的原因有多種：（1 1）激發(fā)態(tài)熒光分子和熄滅劑分子碰撞，將能量轉(zhuǎn)移到熄滅劑而使熒光熄滅；）激發(fā)態(tài)熒光分子和熄滅劑分子碰撞，將能量轉(zhuǎn)移到熄滅劑而使熒光熄滅；（2 2）熒光分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配合物；）熒光分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配合物；（3 3）熒光物質(zhì)分子中引入重原子后，易發(fā)生系間竄越而轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài)；）熒光物質(zhì)分子中引入重原子后，易發(fā)生系間竄越而轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài)；（4）當熒光物質(zhì)濃度較大時，激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生熒光自）當熒光物質(zhì)濃度較大時，激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生熒光

10、自熄滅現(xiàn)象。溶液濃度越高，自熄滅現(xiàn)象越嚴重；熄滅現(xiàn)象。溶液濃度越高，自熄滅現(xiàn)象越嚴重；（5）溶液中溶解的氧分子能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄）溶液中溶解的氧分子能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅。滅。 熒光熄滅是熒光分析的不利因素。但是如果一個熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強度的減小和熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，則可以利用這一性質(zhì)建立熄滅劑的熒光分析法，稱為熒光熄滅法。熒光熄滅法比直接熒光法更靈敏、更有選擇性。例如鋁-桑色素配合物的熒光強度因微量氟離子的存在而引起熒光熄滅，利用這種性質(zhì)可測定樣品中微量氟離子的含量，這時溶液的熒光強度和氟離子濃度成反比。 第二節(jié)第二節(jié) 定

11、性定量分析定性定量分析一、熒光強度與溶液濃度的關(guān)系一、熒光強度與溶液濃度的關(guān)系 分光光度法是測定物質(zhì)對光的吸收程度；熒光分光光度法是測定物質(zhì)對光的吸收程度；熒光分析法是測定物質(zhì)吸收了一定頻率的光之后，物質(zhì)分析法是測定物質(zhì)吸收了一定頻率的光之后，物質(zhì)本身所發(fā)射的熒光強度。當溶液中的熒光物質(zhì)被入本身所發(fā)射的熒光強度。當溶液中的熒光物質(zhì)被入射光激發(fā)后，可以在各個方向觀察到熒光，由于激射光激發(fā)后，可以在各個方向觀察到熒光，由于激發(fā)光一部分可透過溶液，所以在透射光方向觀察熒發(fā)光一部分可透過溶液，所以在透射光方向觀察熒光是不適宜的，一般是在與透射光垂直的方向觀察光是不適宜的，一般是在與透射光垂直的方向觀察

12、熒光。熒光。 測定熒光強度時，要選擇兩個不同的波長：一測定熒光強度時，要選擇兩個不同的波長：一個是物質(zhì)吸收的光，即激發(fā)光的波長；另一個是被個是物質(zhì)吸收的光，即激發(fā)光的波長；另一個是被激發(fā)物質(zhì)發(fā)射的光，即熒光的波長。激發(fā)物質(zhì)發(fā)射的光，即熒光的波長。在稀溶液中，熒光強度在稀溶液中，熒光強度I If f與入射光的強度與入射光的強度IoIo、熒光量子效率、熒光量子效率f f 以及熒以及熒光物質(zhì)的濃度光物質(zhì)的濃度c c等有關(guān)，可表示為等有關(guān)，可表示為I If f=K=Kf fIobcIobc。 （式中（式中K K為比例常數(shù)，為比例常數(shù)，與儀器性能有關(guān)，與儀器性能有關(guān)，為摩爾吸光系數(shù)，為摩爾吸光系數(shù)，b

13、b為液層厚度）。由此可見，當儀為液層厚度）。由此可見，當儀器的參數(shù)固定后，以最大激發(fā)波長的光為入射光，測定最大發(fā)射波長光器的參數(shù)固定后，以最大激發(fā)波長的光為入射光，測定最大發(fā)射波長光的強度時，熒光強度的強度時，熒光強度 I If f與熒光物質(zhì)的濃度與熒光物質(zhì)的濃度c c成正比。（對于某種熒光物成正比。（對于某種熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定的頻率及強度的激發(fā)光照射下，當溶液的濃度足夠質(zhì)的稀溶液，在一定的頻率及強度的激發(fā)光照射下，當溶液的濃度足夠小使得對激發(fā)光的吸光度很低時，所測溶液的熒光強度才與該熒光物質(zhì)小使得對激發(fā)光的吸光度很低時，所測溶液的熒光強度才與該熒光物質(zhì)的濃度成正比。）的濃度成正比。）當

14、當abc0.05（即溶液很稀）時，（即溶液很稀）時，! 2)3 . 2(3 . 2 20abcabcIKFabcIKF0 3 . 2對于一定的熒光物質(zhì)，當測定條件固定時，對于一定的熒光物質(zhì)，當測定條件固定時，cKF即對一定的熒光物質(zhì)的稀溶液（即對一定的熒光物質(zhì)的稀溶液（abc0.05），），在一定的溫度下，當激發(fā)光的波長、強度和液在一定的溫度下，當激發(fā)光的波長、強度和液層厚度都固定后，其熒光強度與該溶液的濃度層厚度都固定后，其熒光強度與該溶液的濃度成正比。這是熒光分析定量的基礎(chǔ)。成正比。這是熒光分析定量的基礎(chǔ)。第三節(jié) 儀器一、儀器的構(gòu)造及原理儀器類型很多，基本結(jié)構(gòu)相似，一般包括五部分：激儀器類

15、型很多，基本結(jié)構(gòu)相似，一般包括五部分：激發(fā)光源、單色器、樣品池、檢測器和記錄顯示部分。發(fā)光源、單色器、樣品池、檢測器和記錄顯示部分。1. 光源 能發(fā)射紫外到可見區(qū)波長的光、強度大、穩(wěn)定。常用的有溴鎢燈、高壓汞燈、氙燈。二、儀器類型二、儀器類型 1. 1. 光電熒光計光電熒光計 用濾光片作單色器（激發(fā)濾用濾光片作單色器（激發(fā)濾光片和熒光濾光片），溴鎢燈或高壓汞燈作光光片和熒光濾光片），溴鎢燈或高壓汞燈作光源，光電管為檢測器。源，光電管為檢測器。2. 2. 熒光分光光度計熒光分光光度計 用氙燈作光源、光柵作用氙燈作光源、光柵作單色器，光電倍增管為檢測器?？蛇B續(xù)掃描激單色器，光電倍增管為檢測器?？蛇B

16、續(xù)掃描激發(fā)光譜和熒光光譜。發(fā)光譜和熒光光譜。 WGY-10型熒光分光光度計具有雙單色器，可以記錄物質(zhì)型熒光分光光度計具有雙單色器，可以記錄物質(zhì)的激光光譜和熒光光譜。采用計算機完成儀器的系統(tǒng)控制和數(shù)的激光光譜和熒光光譜。采用計算機完成儀器的系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。其工作原理如下：據(jù)采集。其工作原理如下： 由光源發(fā)出的光，通過激發(fā)單色器后變成單色光，而后照由光源發(fā)出的光，通過激發(fā)單色器后變成單色光，而后照在熒光池中的被測樣品上，由此激發(fā)出的熒光被發(fā)射單色器收在熒光池中的被測樣品上，由此激發(fā)出的熒光被發(fā)射單色器收集后。經(jīng)單色器分散成單色光而照射在光電倍增管上轉(zhuǎn)換成相集后。經(jīng)單色器分散成單色光而照射在光電

17、倍增管上轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號，經(jīng)放大器放大反饋入應(yīng)的電信號，經(jīng)放大器放大反饋入A/D轉(zhuǎn)換單元，將模擬電信轉(zhuǎn)換單元，將模擬電信號轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的數(shù)字量。并通過顯示器或打印機顯示記錄下被號轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的數(shù)字量。并通過顯示器或打印機顯示記錄下被測樣品的圖譜。這就是熒光光度計的基本工作原理。測樣品的圖譜。這就是熒光光度計的基本工作原理。WGY-10熒光分光光度計儀器的使用熒光分光光度計儀器的使用點擊電腦桌面“WGY-10熒光分光光度計”的圖標進入“WGY-10”友好界面。（此時分別進行激發(fā)光珊檢零，激發(fā)光珊檢索為起始波長，激發(fā)光珊檢索為起始波長等一系列檢索）約3分鐘點擊菜單欄“發(fā)射”圖標先固定發(fā)射波長為400

18、 nm，出現(xiàn)“正在檢索發(fā)射波長，請稍等”如熒光強度大于50，負高壓選95，熒光強度小于50，則選100工作模式：激發(fā)掃描起始波長：250終止波長：350負高壓為：100（95）點擊“單程”輸入通道號，出現(xiàn)激發(fā)光譜（通道1）然后點擊“讀取數(shù)據(jù)”進入“自動尋峰”保存txt文件 清除當前（建立）在曲線上找最大激發(fā)波長297 nm 再選定激發(fā)波長297nm（正在檢索激發(fā)波長） 工作模式：發(fā)射掃描起始波長：350終止波長：500負高壓為：100（90）點擊“單程”輸入通道號，出現(xiàn)發(fā)射光譜（通道2）然后點擊“讀取數(shù)據(jù)”進入“自動尋峰”保存txt文件 清除當前（建立）在曲線上找最大激發(fā)波長397 nm點擊文

19、件，選擇保存。再選定發(fā)射波長397nm，起始波長改為250nm點擊“單程”選擇通道2。則出現(xiàn)水楊酸溶液的光譜圖（含激發(fā)光譜和發(fā)射光譜）點擊保存文本文件，在點確定，輸入文件名，“保存”點擊“工作”再點“定量測量”出現(xiàn)“定量測量-標準曲線”,點擊“編輯”，修改濃度單位ug/mL，確定點擊“添加”依次輸入濃度0、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0再分別點擊“本底測量”、“單項測量”最后點擊“計算標準曲線”最后“樣品測量”。后期作圖1.打開origin軟件x.txt找到已保存的文件（兩個通道）AddOK 點擊 Add AddOK。出現(xiàn)光譜圖2.雙擊X AXTS TITLE，出現(xiàn)對話框，改為x/nm

20、,雙擊y Ax改為y/F.點擊 圖標，移動鼠標到峰點，再點T圖標，再點左鍵，輸入數(shù)值297nm重復(fù)再輸入另一峰值重復(fù)輸入excitation emission 即成3.再點擊File(電腦左上方) （save project）點擊，輸入文件名，點保存。4最后點擊Edit(在File后)，點擊copy page,即可復(fù)制在word文檔。這件完整的圖形即可在用U盤拷貝了。第五節(jié) 熒光分析法的應(yīng)用（一）（一） 有機物的熒光分析有機物的熒光分析 （二）（二） 無機元素的熒光分析無機元素的熒光分析（三）在生命科學(xué)中的應(yīng)用三）在生命科學(xué)中的應(yīng)用 熒光分析測定鄰、間熒光分析測定鄰、間-羥基苯甲酸混合物中羥基

21、苯甲酸混合物中的二組分析含量的二組分析含量一，目標要求一，目標要求1.學(xué)習(xí)熒光分析法的基本理論和操作學(xué)習(xí)熒光分析法的基本理論和操作;2.用熒光分析法進行多組分含量的測定。用熒光分析法進行多組分含量的測定。二，原理二，原理 某些具有某些具有-電子共軛體系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激發(fā)，如該物電子共軛體系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激發(fā)，如該物質(zhì)具有較高的熒光效率，則會以熒光的形式釋放出吸收的一部分能量而回到基態(tài)。質(zhì)具有較高的熒光效率，則會以熒光的形式釋放出吸收的一部分能量而回到基態(tài)。建立在發(fā)生熒光現(xiàn)象基礎(chǔ)上的分析方法，稱為熒光分析法，而常把被測物稱為熒建立在發(fā)生熒光現(xiàn)象基礎(chǔ)上的分析方法

22、，稱為熒光分析法，而常把被測物稱為熒光物質(zhì)。在稀溶液中，熒光強度光物質(zhì)。在稀溶液中，熒光強度It與入射光的強度與入射光的強度Io、熒光量子效率、熒光量子效率f 以及熒光以及熒光物質(zhì)的濃度物質(zhì)的濃度c等有關(guān)，可表示為等有關(guān)，可表示為If=KfIobc。 式中式中K為比例常數(shù)，與儀器性能有為比例常數(shù)，與儀器性能有關(guān)，關(guān)，為摩爾吸光系數(shù)，為摩爾吸光系數(shù)，b為液層厚度。由此可見，當儀器的參數(shù)固定后，以最大為液層厚度。由此可見，當儀器的參數(shù)固定后，以最大激發(fā)波長的光為入射光，測定最大發(fā)射波長光的強度時，熒光強度激發(fā)波長的光為入射光，測定最大發(fā)射波長光的強度時，熒光強度 If與熒光物質(zhì)與熒光物質(zhì)的濃度的濃

23、度c成正比。成正比。在中性水溶液中，鄰在中性水溶液中，鄰-羥基苯甲酸（水楊酸）生成分子內(nèi)氫鍵（羥基苯甲酸（水楊酸）生成分子內(nèi)氫鍵（ ）增加分子）增加分子的剛性而有較強熒光，而間的剛性而有較強熒光，而間-羥基苯甲酸則無熒光。在羥基苯甲酸則無熒光。在PH的堿性溶液中，二者在的堿性溶液中，二者在310nm附近的紫外光照射下則均會發(fā)生熒光，且鄰附近的紫外光照射下則均會發(fā)生熒光，且鄰-羥基苯甲酸的熒光強度與其在羥基苯甲酸的熒光強度與其在PH5.5時相同。因此，在時相同。因此，在PH5.5時可測定水楊酸的含量，間時可測定水楊酸的含量，間-羥基苯甲酸不干擾。羥基苯甲酸不干擾。另取同量試樣溶液調(diào)另取同量試樣溶

24、液調(diào)PH到到12，從測得的熒光強度中扣除水楊酸產(chǎn)生的熒光即可求，從測得的熒光強度中扣除水楊酸產(chǎn)生的熒光即可求出間出間-羥基苯甲酸的含量。在羥基苯甲酸的含量。在012ug/ml范圍內(nèi)熒光強度與二組分濃度均呈線性關(guān)范圍內(nèi)熒光強度與二組分濃度均呈線性關(guān)系。對系。對-羥基苯甲酸在此條件下無熒光，因而不干擾測定。羥基苯甲酸在此條件下無熒光，因而不干擾測定。三，儀器及試劑三，儀器及試劑WGY-10型熒光分光光度計（天津）容量瓶（25 ml）分度吸量管5 ml 2 ml鄰-羥基苯甲酸標準溶液：稱取水楊酸0.1500g溶解并定容于1L容量瓶中。間-羥基苯甲酸標準溶液：稱取間羥基苯甲酸0.1500g溶解并定容于

25、1L容量瓶中。醋酸-醋酸鈉緩沖溶液：稱取47g NaAc和6g 醋酸配成1LPH5.5的緩沖溶液。NaOH溶液：0.1mol/L未知液四，實驗內(nèi)容四，實驗內(nèi)容（1）、配制標準系列和未知溶液）、配制標準系列和未知溶液：1、分別移取水楊酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于25ml 容量瓶中，各加入2.5ml PH5.5的醋酸鹽緩沖溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻。2、取0.6ml未知液兩份于25ml 容量瓶中，各加入2.5ml PH5.5的乙酸緩沖溶液，分別用去離子水稀釋至刻度，搖勻。3.分別移取間羥基苯甲酸羥基苯甲酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于25ml 容量瓶中，各加入3.0ml0.1mol/L溶液， ，用去離子水稀釋至刻度，搖勻。4.取0.6ml未知液兩份于25ml 容量瓶中，各加入3.0ml0.1mol/L溶液，分別用去離子水稀釋至刻度，搖勻。（2）、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的測繪）、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的測繪用（1）中的第四份溶液測繪各自的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。先固定發(fā)射波長為400nm在25